Mecanisme enzimàtic de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis: estudis cinètics en estat estacionari i preestacionari

Abstract

Les glicosidases que hidrolitzen els substrats amb retenció de configuració segueixen un mecanisme general en què després d'una primera etapa d'associació enzim-lligand s'encadenen dues etapes catalítiques que porten a la hidròlisi del substrat conservant la configuració del carboni anomèric en el nou extrem generat.<br/><br/> <br/><br/>En el present treball es comprova a través d'estudis mecanístics, principalment estudis en estat preestacionari i anàlisis de Hammett, que amb aquest mecanisme tan senzill no es pot descriure correctament l'activitat catalítica de la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis, i es proposa el mecanisme que es mostra a continuació: <br/><br/> <br/><br/>on els complexos enzim-substrat adopten dues conformacions productives (SES* i SES**) i on el balanç entre aquestes dues conformacions en funció del substrat explica els diferents comportaments cinètics en estat estacionari i preestacionari.<br/>Un estudi en profunditat sobre la importància que exerceix la interacció entre l'enzim i l'hidroxil a C2 de la unitat de glucopiranosa que ocupa el subseti -1 demostra que en el cas de la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis aquesta interacció no juga el paper rellevant que s'ha observat en altres &#946;-glicosidases que actuen amb retenció de configuració.<br/>L'estudi de la reacció d'hidratació del glical G4G3G' catalitzada per la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis permet proposar que hi ha un canvi en el residu que fa el paper d'àcid general. De manera que es proposa que l'Asp136 que en la reacció d'hidròlisi de substrats ajuda al posicionament dels residus catalítics i juga un paper en la regulació dels seus pKa, és el residu que fa d'àcid general en la reacció d'hidratació de glicals.

Las glicosidasas que hidrolizan substratos con retención de configuración siguen un mecanismo general en que después de una primera etapa de asociación enzima-ligando se encadenan dos etapas catalíticas que llevan a la hidrólisis del substrato conservando la configuración del carbono anomérico en el nuevo extremo generado.<br/><br/> <br/><br/>En el presente trabajo se comprueba a través de estudios mecanísticos, principalmente estudios en estado pre-estacionario y análisis de Hammett, que con este mecanismo tan sencillo no se puede describir correctamente la actividad catalítica de la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis, y se propone el mecanismo que se muestra a continuación:<br/><br/> <br/><br/>donde los complejos enzima-substrato adoptan dos conformaciones productivas (SES* y SES**) y donde el balance entre estas dos conformaciones en función del substrato explica los diferentes comportamientos cinéticos en estado estacionario y pre-estacionario.<br/>Un estudio en profundidad sobre la importancia que ejerce la interacción entre el enzima y el hidroxilo en C2 de la unidad de glucopiranosa que ocupa el subsitio -1 demuestra que en el caso de la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis esta interacción no juega el papel relevante que se ha observado en otras &#946;-glicosidasas que actuan con retención de configuración.<br/>El estudio de la reacción de hidratación del glical G4G3G' catalizada por la 1,3-1,4-&#946;-glucanasa de Bacillus licheniformis permite proponer que hay un cambio en el residu que ejerce el papel de ácido general. De manera que se propone que el Asp136 que en la reacción de hidrólisis de substratos ayuda en el posicionamiento de los resíduos catalíticos y juega un papel en la regulación de sus pKa, es el resíduo que actúa de ácido general en la reacción de hidratación de glicales.

Retaining glycosidases follow a general mechanism in which the first enzime-ligand association is followed by two catalytic steps that render the product of hydrolysis with the same anomeric configuration as the starting material.<br/><br/> <br/><br/>In the present work we demonstrate using mechanistic studies, basically pre-steady state kinetics and Hammett analysis, that this mechanism is too simple to properly describe the catalytic activity of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-&#946;-glucanase, and the following mechanism is proposed:<br/><br/> <br/>In this mechanism, the enzim-substrate complexes adopt two productive conformations (SES* and SES**) and the balance between these two conformations depending on the nature of the substrate explains the diferent behaviours observed in pre-steady and steady state kinetics.<br/>A deep study on the importance of the interaction between the enzyme and the hydroxyl group at C2 of the glucopyranose residue that occupies the -1 subsite demonstrates that in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-&#946;-glucanase this interaction is not the key interaction observed in other retaining &#946;-glycosidases.<br/>The study of the G4G3G' glical hydration catalysed by the Bacillus licheniformis 1,3-1,4-&#946;-glucanase let us propose that there is a change in the residue that acts as a general acid. We propose that Asp136, that plays a role positioning the catalytic residues and modulating their pKa in the hydrolysis reaction, acts as the general acid in the hydration of glycals.