Enhanced molecular insights and therapeutic strategies for temozolomide and (±)-gossypol combination in glioblastoma

Abstract

El glioblastoma (GB) és el tumor cerebral primari més comú i agressiu. Malgrat el tractament estàndard, que inclou cirurgia, radioteràpia i temozolomida (TMZ), el pronòstic continua sent extremadament desfavorable, fet que subratlla la necessitat urgent d’estratègies terapèutiques més eficaces. Les combinacions de fàrmacs i els règims d’administració optimitzats han mostrat resultats prometedors en aquest context. En particular, s’ha demostrat que el gossypol, tant (±)-gossypol (GSP) com el seu enantiòmer (-)-gossypol, millora l’eficàcia de la TMZ en models preclínics, tot i que els seus mecanismes moleculars no es coneixen completament. A més, l’administració de TMZ sota el protocol “pauta metronòmica amb potenciació immune” (IMS) ha millorat tant la resposta immune com l’eficàcia terapèutica en un model murí ortotòpic immunocompetent de GB GL261 (C57BL6/J). Basant-se en aquestes troballes, aquesta tesi doctoral es va proposar investigar els mecanismes moleculars subjacents a la combinació de TMZ i GSP en cèl·lules de GB, així com avaluar la seva implementació i eficàcia en el mateix model murí ortotòpic utilitzant el protocol IMS.

Els estudis in vitro van demostrar que la combinació de TMZ i GSP exerceix un efecte sinèrgic, associat amb un augment de l’apoptosi dependent de caspases i la inhibició de proteïnes antiapoptòtiques de la família BCL-2. En les línies cel·lulars humanes de GB A172 i LN-18, GSP va reduir l’expressió de BCL-2 i BCL-xL, alhora que va augmentar MCL-1. Tanmateix, també va incrementar l’expressió de NOXA, contrarestant la reducció de NOXA induïda per TMZ i superant un possible mecanisme de resistència adquirida. En la línia cel·lular murina GL261, la combinació va reduir BCL-xL i MCL-1, posant de manifest la importància d’inhibir aquestes proteïnes per maximitzar l’eficàcia de TMZ. A més, la combinació va revertir l’aturada en G2/M induïda per TMZ, promovent l’apoptosi i evitant mecanismes de reparació de l’ADN que podrien contribuir a la resistència tumoral.

Els estudis in vivo van demostrar que la combinació sota el protocol IMS va millorar significativament la supervivència en comparació amb la monoteràpia amb TMZ, confirmant una eficàcia terapèutica superior. A més, es va observar una possible resposta de memòria immune adaptativa, ja que el reimplantament tumoral a l’hemisferi contralateral d’un ratolí curat no va resultar en creixement tumoral. No obstant això, es va detectar un efecte advers a llarg termini, amb l’aparició d’un limfoma en un dels animals tractats, fet que indica la necessitat d’avaluar els possibles efectes secundaris. L’eficàcia augmentada també es va associar amb un increment de l’apoptosi dependent de caspases i una reducció de l’expressió de MCL-1, així com una disminució de l’expressió de la vimentina, suggerint una menor agressivitat tumoral. Addicionalment, es va observar una reducció de l’expressió de Ki67, SOX2 i ALDH1/2, indicant una menor proliferació cel·lular i una disminució de la població de cèl·lules mare de GB, que tenen un paper clau en la resistència i la recurrència tumoral. Així mateix, la combinació va induir un augment de l’expressió de CD45, suggerint activació del sistema immunitari, però també una sobreexpressió de PD-L1, que podria indicar un mecanisme d’evasió immune que caldria investigar més a fons.

En conjunt, aquestes troballes posen de manifest el potencial terapèutic de la combinació de TMZ i GSP sota el protocol IMS, i subratllen la importància d’inhibir proteïnes antiapoptòtiques per contrarestar l’evasió de l’apoptosi en el GB, el paper clau del sistema immune en la resposta al tractament i la necessitat d’avaluar amb cura els possibles efectes adversos associats al tractament.

El glioblastoma (GB) es el tumor cerebral primario más común y agresivo. A pesar del tratamiento estándar, que incluye cirugía, radioterapia y temozolomida (TMZ), el pronóstico sigue siendo extremadamente pobre, lo que resalta la necesidad urgente de estrategias terapéuticas más eficaces. Las combinaciones de fármacos y los regímenes de administración optimizados han mostrado resultados prometedores en este contexto. En particular, se ha demostrado que el gossipol, tanto (±)-gossipol (GSP) como su enantiómero (-)-gossipol, mejora la eficacia de la TMZ en modelos preclínicos, aunque sus mecanismos moleculares no se comprenden completamente. Además, la administración de TMZ bajo el protocolo “pauta metronómica con potenciación inmune” (IMS) ha mejorado tanto la respuesta inmune como la eficacia terapéutica en un modelo murino ortotópico inmunocompetente de GB GL261 (C57BL6/J). Con base en estos hallazgos, esta tesis doctoral tuvo como objetivo investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la combinación de TMZ y GSP en células de GB, así como evaluar su implementación y eficacia en el mismo modelo murino ortotópico utilizando el protocolo IMS.

Los estudios in vitro demostraron que la combinación de TMZ y GSP ejerce un efecto sinérgico, asociado con un aumento de la apoptosis dependiente de caspasas y la inhibición de proteínas antiapoptóticas de la familia BCL-2. En las líneas celulares humanas de GB A172 y LN-18, GSP redujo la expresión de BCL-2 y BCL-xL, al tiempo que aumentó MCL-1. Sin embargo, también incrementó la expresión de NOXA, contrarrestando la reducción de NOXA inducida por TMZ y superando un posible mecanismo de resistencia adquirida. En la línea celular murina GL261, la combinación redujo BCL-xL y MCL-1, lo que resalta la importancia de inhibir estas proteínas para maximizar la eficacia de TMZ. Además, la combinación revirtió el arresto en G2/M inducido por TMZ, promoviendo la apoptosis y evitando mecanismos de reparación del ADN que podrían contribuir a la resistencia tumoral.

Los estudios in vivo demostraron que la combinación bajo el protocolo IMS mejoró significativamente la supervivencia en comparación con la monoterapia con TMZ, confirmando su mayor eficacia terapéutica. Además, se observó una posible respuesta de memoria inmune adaptativa, ya que el reimplante tumoral en el hemisferio contralateral de un ratón curado no resultó en crecimiento tumoral. Sin embargo, se detectó un efecto adverso a largo plazo, con la aparición de un linfoma en uno de los animales tratados, lo que indica la necesidad de evaluar los posibles efectos secundarios. La mayor eficacia también se asoció con un aumento de la apoptosis dependiente de caspasas y una disminución en la expresión de MCL-1, así como una reducción en la expresión de vimentina, lo que sugiere una menor agresividad tumoral. Además, se observó una reducción en la expresión de Ki67, SOX2 y ALDH1/2, lo que indica una menor proliferación celular y una disminución en la población de células madre de GB, que desempeñan un papel clave en la resistencia y la recurrencia tumoral. Asimismo, la combinación indujo un aumento en la expresión de CD45, lo que sugiere activación del sistema inmune, pero también una sobreexpresión de PD-L1, lo que podría indicar un mecanismo de evasión inmune que merece una investigación más profunda.

En conjunto, estos hallazgos destacan el potencial terapéutico de la combinación de TMZ y GSP bajo el protocolo IMS, enfatizando la importancia de inhibir proteínas antiapoptóticas para contrarrestar la evasión de la apoptosis en el GB, el papel clave del sistema inmune en la respuesta al tratamiento y la necesidad de evaluar cuidadosamente los posibles efectos adversos relacionados con el tratamiento.

Glioblastoma (GB) is the most common and aggressive primary brain tumor. Despite standard treatment, which includes surgery, radiotherapy, and temozolomide (TMZ), the prognosis remains extremely poor, highlighting the urgent need for more effective therapeutic strategies. Drug combinations and optimized administration regimens have shown promise in this context. In particular, gossypol, both (±)-gossypol (GSP) and its enantiomer (-)-gossypol, has been shown to enhance TMZ efficacy in preclinical models, although its molecular mechanisms remain incompletely understood. Moreover, TMZ administration under the “immune-enhancing metronomic schedule” (IMS) protocol has improved both immune response and therapeutic efficacy in an immunocompetent orthotopic murine model of GB GL261 (C57BL6/J). Based on these findings, this PhD thesis aimed to investigate the molecular mechanisms underlying the combination of TMZ and GSP in GB cells, as well as to evaluate its implementation and efficacy in the same orthotopic murine model using the IMS protocol.

In vitro studies demonstrated that the combination of TMZ and GSP exerts a synergistic effect, associated with an increase in caspase-dependent apoptosis and the inhibition of anti-apoptotic proteins of the BCL-2 family. In human GB cell lines A172 and LN-18, GSP reduced the expression of BCL-2 and BCL-xL, while increasing MCL-1. However, it also upregulated NOXA, counteracting the TMZ-induced reduction in NOXA and overcoming a potential mechanism of acquired resistance. In the murine GL261 cell line, the combination reduced BCL-xL and MCL-1, emphasizing the importance of inhibiting these proteins to maximize TMZ efficacy. Additionally, the combination reversed TMZ-induced G2/M arrest, promoting apoptosis and preventing DNA repair mechanisms that could contribute to tumor resistance.

In vivo studies demonstrated that the combination under the IMS protocol significantly improved survival compared to TMZ monotherapy, confirming its greater therapeutic efficacy. Furthermore, a possible adaptive immune memory response was observed, as tumor reimplantation in the contralateral hemisphere of a cured mouse did not result in tumor growth. However, a long-term adverse effect was detected, with the occurrence of lymphoma in one treated animal, indicating the need to assess potential side effects. The enhanced efficacy was also associated with increased caspase-dependent apoptosis and reduced MCL-1 expression, as well as decreased vimentin expression, suggesting lower tumor aggressiveness. Additionally, a reduction in Ki67, SOX2, and ALDH1/2 expression was observed, indicating decreased cell proliferation and a reduction in the GB stem cell population, which plays a key role in resistance and tumor recurrence. Moreover, the combination induced an increase in CD45 expression, suggesting immune system activation, but also an upregulation of PD-L1, which could indicate an immune evasion mechanism that warrants further investigation.

Overall, these findings highlight the therapeutic potential of the combination of TMZ and GSP under the IMS protocol, emphasizing the importance of inhibiting anti-apoptotic proteins to counteract apoptosis evasion in GB, the key role of the immune system in treatment response, and the need to carefully assess potential treatment-related adverse effects.