Deciphering tumor-intrinsic resistance mechanisms to T-cell-mediated cytotoxicity in pancreatic cancer

Abstract

La immunoteràpia es basa en potenciar la capacitat del sistema immunitari per combatre el càncer. Entre les seves modalitats, els inhibidors de punts de control immunològic han generat respostes potents i duradores en tumors refractaris a teràpies convencionals, particularment melanoma i càncer de pulmó. Tret d’haver demostrat bons resultats, la immunoteràpia continua sent ineficaç per la majoria de tumors, on aquesta limitació és particularment evident en el cas de l’adenocarcinoma ductal pancreàtic (PDAC). Aquesta malaltia constitueix la sisena causa de mort per càncer del món, ressaltant la urgència d’ampliar els beneficis de la immunoteràpia als pacients amb PDAC.

La manca de resposta del PDAC a la immunoteràpia s’ha atribuït principalment a l’escassa infiltració de limfòcits T en el tumor i a un microambient tumoral altament immunosupressor. Tot i així, estudis recents han demostrat que és possible aïllar i expandir limfòcits provinents de càncers pancreàtics. Tanmateix, aquests limfòcits poden no reconèixer ni eliminar de manera eficaç les línies cel·lulars tumorals autòlogues in vitro.

En aquesta tesis hipotetitzem que les cèl·lules del càncer de pàncrees poden evadir el reconeixement i la citotoxicitat mediada per limfòcits T mitjançant mecanismes cel·lulars encara desconeguts. Per això, l’objectiu d’aquesta tesi és identificar nous gens que, quan siguin eliminats, incrementin la citotoxicitat per limfòcits T.

Per a això, vam decidir utilitzar un model descrit per Gros et al. (2019): una línia cel·lular derivada d’un pacient amb càncer de pàncrees (TC-4177) que és poc reconeguda i eliminada per la subpoblació de limfòcits CD8+PDhi extrets de la sang del mateix pacient. Aquesta població efectora és enriquida per limfòcits T que reconeixen el neoantigen MMP14p.R158C, expressat en la línia tumoral. A demés, s’observa el mateix fenotip amb limfòcits transduïts amb el TCR específic per aquest neoantigen. El reconeixement limitat observat en aquest model s’atribueix principalment a un dèficit en la presentació del neoantigen.

Donades aquestes característiques úniques, vam utilitzar aquest model de reconeixement ineficient per investigar els mecanismes intrínsecs d’evasió del sistema immunitari en el PDAC. Això ho vam fer mitjançant un cribratge a escala genòmica amb CRISPR/Cas9 en aquest model de co-cultiu in vitro utilitzant dos ratis d’efectors enfront de cèl·lules tumorals (1:1 i 1:2). Entre aquests dos cribratges vam identificar 42 gens la eliminació dels quals augmentava la citotoxicitat mediada per limfòcits T. Entre aquests candidats, es va demostrar que l’ablació de la ubiquitina lligasa E3 MARCHF5, augmentava la susceptibilitat de les cèl·lules tumorals a l’atac de les cèl·lules T en tres models in vitro diferents de càncer de pàncrees. A més, la pèrdua de MARCHF5 també sensibilitza les cèl·lules TC-4177 al tractament amb IFN-γ.

Estudis mecanístics van demostrar que l’ablació de MARCHF5 impacta negativament en el creixement cel·lular sense induir apoptosi ni alterar el cicle cel·lular. L’eliminació de MARCHF5 compromet la integritat mitocondrial, fent que les cèl·lules tumorals siguin més propenses a l’apoptosi. A més, estudis de proteòmica van demostrar que les cèl·lules en absència de MARCHF5 augmenten l’expressió basal del receptor FAS, de proteïnes reguladores de la dinàmica mitocondrial (MTFP1) així com de proteïnes pro-apoptòtiques (MTCH1).

L’increment de mort mediada per limfòcits T en cèl·lules deficient per MARCHF5 es correlaciona amb un increment en l’expressió de NOXA i de proteïnes associades amb la disfunció mitocondrial i el dany a l’ADN. A nivell transcripcional, la pèrdua de MARCHF5 promou la disminució de gens implicats en la reparació del dany de doble hèlix.

En conjunt, aquests descobriments proporcionen una potencial diana terapèutica per potenciar la capacitat del sistema immunològic per combatre el càncer de pàncrees.

La inmunoterapia se basa en potenciar la capacidad del sistema inmunitario para combatir el cáncer. Entre sus modalidades, los inhibidores de puntos de control inmunológico han generado respuestas potentes y duraderas en tumores refractarios a terapias convencionales, particularmente en melanoma y cáncer de pulmón. Sin embargo, sigue siendo ineficaz para la mayoría de los tumores, donde esta limitación es particularmente evidente en el caso del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Esta enfermedad constituye la sexta causa de muerte por cáncer en el mundo, recalcando la urgencia de ampliar los beneficios de la inmunoterapia a pacientes con PDAC.

La falta de respuesta del PDAC a la inmunoterapia se ha atribuido a la escasa infiltración de linfocitos T en el tumor y a un microambiente tumoral altamente inmunosupresor. No obstante, estudios recientes han demostrado que es posible aislar y expandir linfocitos que están infiltrando cánceres pancreáticos. Sin embargo, estos linfocitos pueden no reconocer eficazmente las líneas celulares tumorales autólogas in vitro.

En esta tesis hipotetizamos que las células del cáncer de páncreas pueden evadir el reconocimiento y la citotoxicidad mediada por linfocitos T a través de mecanismos celulares aún desconocidos. El objetivo de esta tesis es identificar nuevos genes que, cuando son eliminados, promuevan la citotoxicidad por linfocitos T.

Para ello, decidimos utilizar un modelo descrito por Gros et al. (2019): una línea celular derivada de un paciente con cáncer de páncreas (TC-4177) que es poco reconocida y eliminada por la subpoblación de linfocitos CD8+PDhi extraídos de la sangre del mismo paciente. Esta población efectora está enriquecida por linfocitos T que reconocen el neoantígeno MMP14p.R158C, expresado en la línea tumoral. Además, se obtiene el mismo fenotipo con linfocitos transducidos con el TCR específico para dicho neoantígeno. El reconocimiento limitado observado en este modelo se atribute principalmente a una deficiente presentación del neoantígeno.

Dadas estas características únicas, utilizamos este modelo de reconocimiento ineficiente para investigar los mecanismos intrínsecos de evasión del sistema inmunitario en PDAC. Lo hicimos mediante el cribado a escala genómica con CRISPR/Cas9 en este modelo de co-cultivo in vitro utilizando dos ratios de efectores frente a células tumorales (1:1 y 1:2). Entre ambos cribados identificamos 42 genes cuya eliminación aumenta la citotoxicidad mediada por linfocitos T. Entre estos candidatos, se demostró que la ablación de la ubiquitina ligasa E3 MARCHF5, aumenta la susceptibilidad de las células tumorales al ataque de las células T en tres modelos distintos in vitro de cáncer de páncreas. Además, la pérdida de MARCHF5 también sensibiliza a las células TC-4177 al tratamiento con IFN-γ.

Estudios mecanísticos demostraron que la ablación de MARCHF5 impacta negativamente el crecimiento celular sin inducir apoptosis o alterar el ciclo celular. La eliminación de MARCHF5 compromete la integridad mitocondrial, haciendo que las células tumorales sean más propensas a la apoptosis. Además, estudios de proteómica demostraron que las células deficientes en MARCHF5 aumentan la expresión basal del receptor FAS, de proteínas reguladoras de la dinámica mitocondrial (MTPF1) así como de proteínas pro-apoptóticas (MTCH1).

El incremento de muerte mediado por linfocitos T en células deficientes de MARCHF5 se correlaciona con un incremento en la expresión de la proteína NOXA así como de proteínas asociadas con la disfunción mitocondrial y el daño en el ADN. A nivel transcripcional, la pérdida de MARCHF5 promueve la disminución de genes implicados en la reparación de daño de doble hebra.

En conjunto, proporcionamos una potencial diana terapéutica para potenciar la capacidad del sistema inmunológico en el control del cáncer de páncreas.

Cancer immunotherapy harnesses the natural ability of the immune system to treat cancers. Certain modalities, like immune checkpoint inhibitors, have demonstrated remarkable and durable outcomes in a fraction of patients with specific cancer types, such as melanoma and lung adenocarcinoma. However, immunotherapy remains ineffective in the vast majority of solid tumors. This lack of response is particularly evident in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the sixth leading cause of cancer-related deaths worldwide, and where there is an urgent need for more effective treatments. The lack of response to immunotherapy observed in PDAC has been largely attributed to its low tumor mutational burden, limited immune infiltration, and desmoplastic, dense, and highly immunosuppressive tumor microenvironment. However, recent articles have shown that neoantigen-specific tumor-infiltrating lymphocytes can be successfully expanded and isolated from pancreatic cancers. Despite this, ex vivo expanded tumor-reactive TILs derived from pancreatic cancers often fail to recognize and, therefore, kill the autologous tumor cell line, even in the absence of tumor microenvironment influences. In this thesis, we hypothesize that PDAC may evade immune recognition and T-cell-mediated cytotoxicity through cell-intrinsic mechanisms that remain to be fully characterized. Thus, we sought to identify novel targets limiting T-cell killing of pancreatic cancer cells that could be therapeutically manipulated to potentially enhance the efficacy of immunotherapy. We used an in vitro model consisting of a patient-derived pancreatic cancer cell line (TC-4177) that is poorly recognized and killed by a circulating CD8+PD1hi lymphocyte subset from the same patient. These effector T cells were highly enriched for T cells recognizing the neoantigen MMP14p.R158C, expressed on the tumor cell line. The limited recognition observed in this model was mainly attributed to poor neoantigen presentation. Additionally, the dysfunctional state of the CD8+PD1hi lymphocytes further impaired cancer cell cytotoxicity. Given these findings, we used this inefficient recognition model challenged with peripheral blood T cells stably expressing a TCR targeting the MMP14 neoantigen (MMP14 TCR-T cells) to explore the tumor-intrinsic mechanisms that limit T-cell-mediated cytotoxicity. By conducting two genome-wide CRISPR/Cas9 screens under conditions of high and low T-cell pressure in our in vitro co-culture model, we identified 42 shared candidate genes whose depletion enhanced cytotoxicity across both screens. Among these candidates, we demonstrated that the ablation of one of the top hits, the E3 ubiquitin ligase MARCHF5, increased susceptibility to T-cell cytotoxicity. We validated these findings in three patient-derived in vitro pancreatic models, where the effect of MARCHF5 loss was consistent across cell lines, TCRs, and targeted neoantigens. Additionally, MARCHF5 deficiency also sensitized TC-4177 cells to IFN-g treatment. Mechanistic studies revealed that MARCHF5 disruption negatively impacts cell growth independent of increased apoptosis or dysregulation of the cell cycle. Furthermore, dynamic BH3 profiling experiments showed that mitochondria integrity was compromised on MARCHF5-deficient cells. Proteomic analysis of these cells revealed a baseline increase of the FAS receptor, the pro-apoptotic protein MTCH1, and the mitochondrial fission-regulating protein MTFP1.

Moreover, MARCHF5 depletion enhanced T-cell cytotoxicity in pancreatic tumors which was associated with the upregulation of NOXA. Transcriptomic and proteomic profiling of these co-cultures revealed that MARCHF5-deficient cells had an increase in proteins related to mitochondrial dysfunction and DNA damage, while concurrently downregulating transcripts involved in double-strand break repair. Although the exact mechanism linking MARCHF5 ablation to enhanced T cell killing of pancreatic cancer and its impact in vivo warrants further investigation, our work provides a novel target that holds promise to unleash the immune system's potential to control pancreatic cancer.