Regulatory factors of quorum sensing and quorum quenching systems in Stenotrophomonas maltophilia and their involvement in metabolic adaptation, pathogenesis and resistance

Abstract

Stenotrophomonas maltophilia és un patogen oportunista emergent multiresistent als antibiòtics que representa una amenaça clínica significativa, especialment en pacients hospitalitzats i immunodeprimits. Els sistemes de detecció de quorum (quorum sensing, QS) regulen processos fisiològics relacionats amb l’adaptació i la patogènesi en aquest bacteri. En aquesta tesi doctoral, hem dut a terme una investigació exhaustiva i integral de les xarxes reguladores del sistema QS de S. maltophilia, basat en el factor de senyalització difusible (diffusible signaling factor, DSF) i la seva interacció amb el segon missatger cíclic di-GMP (cyclic di-GMP, c-di-GMP). A més, s'ha estudiat un sistema intrínsec de degradació del quorum (quorum quenching, QQ) basat en una enzima acilasa. Mitjançant una extensa mutagènesi, anàlisis transcriptòmiques i la caracterització funcional dels components clau del sistema de DSF-QS en el sistema Rpf de la soca representativa K279a, hem demostrat que la producció de DSF arriba al seu màxim a l'inici de la fase estacionària i desencadena una cascada de senyalització que redueix els nivells intracel·lulars de c-di-GMP. Aquesta reducció afavoreix la transició d'un estil de vida sessil a un de mòbil, facilitant la dispersió del biofilm i un increment de la motilitat. El regulador transcripcional Clp emergeix com un factor clau que percep c-di-GMP i coordina canvis en l’expressió gènica, incloent-hi la regulació de factors de virulència com els pilis, les fímbries i les proteases extracel·lulars. Al seu torn, el component RpfB desactiva el DSF com a mecanisme de retroalimentació d’aquest sistema de QS. Les nostres dades destaquen dos factors sigma alternatius, RpoN1 i RpoN2, amb funcions reguladores especialitzades i diferenciades dins la xarxa de QS. RpoN2 és un element directe de la cascada DSF-QS que modula l’assemblatge flagel·lar, la motilitat i la maduració del biofilm, mentre que RpoN1 influeix de manera independent en la biosíntesi d'àcids grassos i en la producció de DSF, especialment en condicions de limitació de nutrients. L’eliminació del gen rpoN1 altera la composició dels àcids grassos, redueix els nivells de DSF i modifica la cinètica de creixement, revelant una connexió integral entre les vies metabòliques i la senyalització de QS.

A més, hem identificat i caracteritzat un enzim de S. maltophilia amb activitat acilasa pertanyent a la família de les Ntn hidrolases (old locus Smlt1522 en el genoma de K279a), que presenta una doble funcionalitat degradant tant senyals de QS de tipus AHL com antibiòtics de la classe de la penicil·lina. Els mutants deficients en el gen smlt1522 presenten un creixement alterat, una major formació de biofilm i una reducció de la motilitat, característiques que subratllen la importància ecològica i clínica del QQ a S. maltophilia. En conjunt, aquest estudi proporciona una comprensió sistèmica de la xarxa de QS dependent de DSF a S. maltophilia i de la seva coordinació intricada amb c-di-GMP, així com de la sofisticació evolutiva de les estratègies de QQ a aquest bacteri. Aquestes troballes amplien el coneixement sobre la patobiologia de S. maltophilia i poden contribuir al desenvolupament de noves estratègies per al control d’infeccions i la lluita contra la resistència als antibiòtics.

Stenotrophomonas maltophilia es un patógeno oportunista emergente, multirresistente a los antibióticos, que representa una amenaza clínica significativa, especialmente en pacientes hospitalizados e inmunodeprimidos. Los sistemas de detección de quorum (quorum sensing, QS) regulan procesos fisiológicos relacionados con la adaptación y la patogénesis en esta bacteria. En esta tesis doctoral, hemos llevado a cabo una investigación exhaustiva e integral de las redes reguladoras del sistema QS de S. maltophilia, basado en el factor de señalización difusible (diffusible signaling factor, DSF) y su interacción con el segundo mensajero cíclico di-GMP (cyclic di-GMP, c-di-GMP). Además, se ha estudiado un sistema intrínseco de degradación del quorum (quorum quenching, QQ) basado en una enzima acilasa. Mediante una extensa mutagénesis, análisis transcriptómicos y la caracterización funcional de los componentes clave del sistema de DSF-QS en el sistema Rpf de la cepa representativa K279a, hemos demostrado que la producción de DSF alcanza su máximo al inicio de la fase estacionaria y desencadena una cascada de señalización que reduce los niveles intracelulares de c-di-GMP. Esta reducción favorece la transición de un estilo de vida sésil a uno móvil, facilitando la dispersión del biofilm y un incremento de la motilidad. El regulador transcripcional Clp emerge como un factor clave que percibe c-di-GMP y coordina cambios en la expresión génica, incluyendo la regulación de factores de virulencia como los pilis, las fimbrias y las proteasas extracelulares. A su vez, el componente RpfB desactiva el DSF como un mecanismo de retroalimentación de este sistema de QS. Nuestros datos destacan dos factores sigma alternativos, RpoN1 y RpoN2, con funciones reguladoras especializadas y diferenciadas dentro de la red de QS. RpoN2 es un elemento directo de la cascada DSF-QS que modula el ensamblaje flagelar, la motilidad y la maduración del biofilm, mientras que RpoN1 influye de manera independiente en la biosíntesis de ácidos grasos y en la producción de DSF, especialmente en condiciones de limitación de nutrientes. La eliminación del gen rpoN1 altera la composición de los ácidos grasos, reduce los niveles de DSF y modifica la cinética de crecimiento, revelando una conexión integral entre las vías metabólicas y la señalización de QS. Además, hemos identificado y caracterizado una enzima de S. maltophilia con actividad acilasa, perteneciente a la familia de las Ntn hidrolasas (old locus Smlt1522 en el genoma de K279a), que presenta una doble funcionalidad, degradando tanto señales de QS de tipo AHL como antibióticos de la clase de la penicilina. Los mutantes deficientes en el gen smlt1522 presentan un crecimiento alterado, una mayor formación de biofilm y una reducción de la motilidad, características que subrayan la importancia ecológica y clínica del QQ en S. maltophilia. En conjunto, este estudio proporciona una comprensión sistémica de la red de QS dependiente de DSF en S. maltophilia y de su intrincada coordinación con c-di-GMP, así como de la sofisticación evolutiva de las estrategias de QQ en esta bacteria. Estos hallazgos amplían el conocimiento sobre la patobiología de S. maltophilia y pueden contribuir al desarrollo de nuevas estrategias para el control de infecciones y la lucha contra la resistencia a los antibióticos.

Stenotrophomonas maltophilia is an emerging multidrug-resistant opportunistic pathogen that poses a significant clinical threat, particularly in hospitalized and immunocompromised patients. Quorum sensing (QS) systems regulate physiological processes related to adaptation and pathogenesis in this bacterium. In this doctoral thesis, we first did an in-depth and comprehensive investigation of the regulatory networks of the S. maltophilia QS system based on DSF (diffusible signaling factor) and its interaction with the second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP). Additionally, an intrinsic quorum quenching (QQ) system based on an acylase enzyme was studied. Through extensive mutagenesis and transcriptomic analyses and functional characterization of key DSF QS components of the Rpf system in the representative strain K279a, we show that DSF production reaches its peak in the early-stationary phase and triggers a signaling cascade that lowers intracellular c-di-GMP levels. This reduction promotes a switch from sessile to motile lifestyles, underpinning biofilm dispersal and enhanced motility. The transcriptional regulator Clp emerges as a pivotal effector that senses c-di-GMP and orchestrates gene expression changes, including those governing virulence factors such as pili, fimbriae, and extracellular proteases. The RpfB component, in turn, deactivates DSF as a feedback mechanism of this QS system. Our data highlights two alternative σ54 factors, RpoN1 and RpoN2, with specialized and differentiated regulatory roles in the QS network. RpoN2 is a direct downstream element of the DSF-QS cascade that modulates flagellar assembly, motility, and biofilm maturation, whereas RpoN1 independently influences fatty acid biosynthesis and DSF production, particularly under nutrient-limited conditions. Deletion of the rpoN1 gene disrupts fatty acid composition, reduces DSF levels, and alters growth kinetics, revealing an integral link between metabolic pathways and QS signaling. Additionally, we identified and characterized an S. maltophilia enzyme with acylase activity belonging to the Ntn hydrolase family (old locus tag Smlt1522 in K279a genome), which exhibits dual functionality by degrading both AHL-type QS signals and penicillin-class antibiotics. Mutants lacking smlt1522 gene show altered growth, increased biofilm formation, and reduced motility, traits that underscore the ecological and clinical significance of QQ in S. maltophilia. Overall, this study provides a systems-level understanding of the DSF-dependent QS network in S. maltophilia and its intricate coordination with c-di-GMP, and also the evolutionary sophistication of QQ strategies in this bacterium. These findings advance our knowledge of S. maltophilia pathobiology and may inform future approaches to control infections and combat antibiotic resistance.