dc.contributor
Universitat de València. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular
dc.contributor.author
Laserna Mendieta, Emilio Jósé
dc.date.accessioned
2011-06-14T07:31:09Z
dc.date.available
2011-06-14T07:31:09Z
dc.date.issued
2009-12-01
dc.identifier.isbn
9788437077901
cat
dc.identifier.uri
http://hdl.handle.net/10803/31922
dc.description.abstract
La vitamina A, a partir de una serie de transformaciones metabólicas, se convierte en el
ácido retinoico (RA), su metabolito activo más potente biológicamente. La vitamina A y sus
derivados juegan un importante papel como reguladores fisiológicos de un gran número de
procesos biológicos. Concretamente, el RA posee un papel relevante en el desarrollo
embrionario temprano y en la generación de varios órganos y sistemas, como es el caso del
Sistema Nervioso. El RA es capaz de inducir la parada proliferativa y la diferenciación in vitro
de líneas celulares de muy diferente origen, incluyendo muchos tipos celulares tumorales como
el neuroblastoma.
Estudios previos realizados en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y han mostrado
que, además de las acciones clásicas sobre la transcripción de genes específicos, el receptor
nuclear de RA (RAR), perteneciente a la superfamilia de los receptores nucleares de
hormonas, media cambios rápidos en el estado de activación de rutas de señalización, como la
ruta de PI3K/Akt y la vía de la MAP kinasa ERK. Este tipo de acciones rápidas independientes
de transcripción, también llamadas no genómicas, constituyen el tema de interés principal de
esta Tesis Doctoral, siendo nuestro objetivo general tratar de comprender cómo contribuyen
este tipo de acciones en los procesos celulares y cómo se integran con las acciones genómicas
transcripcionales para conseguir una única respuesta al RA.
Un primer estudio de los intermediarios de estas rutas, mediante el empleo de fosfoanticuerpos
específicos de residuo e inhibidores de las vías de señalización, demostró que la
activación de PI3K/Akt y ERK por un tratamiento a tiempos cortos con RA se traduce en la
fosforilación de sustratos corriente abajo (downstream), como mTOR y p70S6 en el caso de
Akt, y MSK1 para ERK. Además, se estableció que ERK es activada independientemente de
PI3K, aunque existe cierta relación entre ambas, pues la inhibición de PI3K con LY294002
modificaba el grado de inducción de ERK.
Mediante un abordaje proteómico, se trató de identificar a aquellas proteínas nucleares
que sufrían un cambio en su estado de fosforilación como consecuencia de las acciones
atípicas del RA. Primeramente, se realizó una comparación de geles bidimensionales teñidos
con Coomassie de fosfoproteínas nucleares de las células control y tratadas con RA. Este
estudio fue ampliado con un ensayo LC-MS/MS cuantitativo empleando la metodología iTRAQ.
Los resultados mostraron que el RA modifica el patrón de fosforilación de dos grandes grupos
de proteínas: 1) aquellas que participan en transcripción y en la remodelación de la cromatina,
y 2) las relacionadas con el procesamiento del mRNA, y dentro de ellas, sobre todo las
implicadas en splicing. Además, estos resultados pudieron ser validados para algunas de estas
proteínas mediante el empleo de otras metodologías.
Los estudios funcionales mostraron que efectivamente el RA participa en la regulación
del splicing alternativo, a través de la activación de la vía de PI3K/Akt. El mecanismo molecular
podría implicar alteraciones en la unión al mRNA de algunos factores de splicing ricos en Ser y
Arg (proteínas SFRS) y la promoción de la interacción entre las proteínas de splicing SF2 y U1-
70K. Por otro lado, el RA también desempeña un papel en la regulación del inicio de la
traducción, que requiere de la inducción de la vía de PI3K/Akt/mTOR, responsable de fosforilar
a 4E-BP1, y de la MAP kinasa ERK.
Como conclusión, la activación de vías de señalización por las acciones no genómicas
del RA en células de neuroblastoma puede regular el procesado del mRNA como parte de la
respuesta orquestada por el receptor nuclear RAR.
spa
dc.description.abstract
Retinoic acid (RA), the biologically active form of vitamin A, is an important molecular
signal for the early embryonic development and the differentiation of many cell types. RA
induces the differentiation of neuroblastoma cells when added in vitro, and a therapeutic effect
for RA has been demonstrated in a multicenter clinical assay with high-risk neuroblastoma
patients.
RA signaling is mediated by the retinoic acid receptor (RAR), belonging to the nuclear
hormone receptor superfamily. In addition to its classical transcriptional actions, RAR also
mediates rapid transcription-independent (nongenomic) actions, consisting in the activation of
signal transduction pathways, as the phosphatidyl-inositol-3-kinase or the ERK MAPK-signaling
pathways. RA-induced rapid transcription-independent actions play a role in different
physiological contexts, being our main goal to elucidate how these rapid actions converge with
the transcriptional actions and integrate together to achieve a physiological response to RA.
First, several experiments using phospho-specific antibodies and signaling pathways
inhibitors showed that activation of PI3K/Akt pathway downstream targets, like mammalian
target of rapamycin (mTOR) and p70S6 kinases, was rapidly induced by RA treatment. On the
other hand, mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) was shown to be an ERK
target induced by RA addition.
Secondly, we identified nuclear proteins whose phosphorylation state was rapidly
modified by RA treatment in neuroblastoma cells, by comparing nuclear phosphoproteins from
control and RA-treated cells using two proteomic approaches: 2DE-gels stained with
Coomassie and quantitative LC-MS/MS assay based on the iTRAQ (isolated tags for relative
and absolute quantification) methodology. Our results showed that RA addition led to changes
in the phosphorylation patterns in two families of proteins: 1) those related to chromatin
dynamics in relation to transcriptional activation, and 2) those related to mRNA processing and,
in particular, mRNA splicing.
Finally, functional assays showed that RA treatment in neuroblastoma cells led to the
alteration of pre-mRNA alternative splicing and mRNA translation patterns, through a molecular
mechanism involving SFRS (splicing factor, serine/arginine-rich) proteins.
Therefore, we conclude that RA activation of signaling pathways converge at multiple
levels with RAR-dependent transcriptional regulation to generate the cellular response to RA
orchestrated by RAR receptor.
eng
dc.format.extent
252 p.
cat
dc.format.mimetype
application/pdf
dc.publisher
Universitat de València
dc.rights.license
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dc.source
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
dc.subject.other
Facultat de Biològiques
cat
dc.title
Cambios en la fosforilación de proteínas nucleares y cascadas de señalización inducidos por el ácido retinoico
cat
dc.type
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.type
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.contributor.director
Barettino Fraile, Domingo
dc.rights.accessLevel
info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.identifier.dl
V-1054-2011
cat