Biosíntesis de carotenoides en

Abstract

Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todo tipo de organismos fotosintéticos y en algunos no fotosintéticos. En plantas, los carotenoides se sintetizan en todo tipo de plastos y se encuentran en grandes cantidades en cloroplastos (donde desempeñan una función esencial para la planta de fotoprotección) y cromoplastos de flores y frutos. Por el contrario, en los plastos de tejidos no fotosintéticos como aquellos de plantas crecidas en la oscuridad (etioplastos) y leucoplastos (raíces y pétalos de Arabidopsis) las cantidades de pigmentos son mucho menores y se desconoce parcialmente la función que desempeñan.<br/><br/>Los carotenoides han sido ampliamente utilizados en la industria farmacéutica y alimenticia por sus propiedades colorantes y antioxidantes. Hasta el momento los carotenoides se obtienen mediante síntesis química o extracción a partir de microorganismos y plantas. No obstante, recientemente se ha desarrollado un creciente interés por la producción biotecnológica de estos compuestos. Pese a los numerosos avances realizados en este campo, diversos factores limitantes han de resolverse: i) la capacidad de almacenamiento ii) la disponibilidad limitada de precursores de naturaleza isoprenoide y iii) el escaso conocimiento de los mecanismos que regulan su biosíntesis. <br/><br/>En este marco, el principal objetivo de este trabajo de tesis ha sido profundizar en nuestro conocimiento de la carotenogénesis en bacterias y plantas.<br/><br/>1. Estudio de la influencia de la capacidad de almacenamiento y el aporte de precursores en la producción de carotenoides en "Escherichia coli".<br/><br/>La primera aproximación llevada a cabo fue la expresión de genes procedentes de la cianobacteria carotenogénica "Synechocystis" en células de "Escherichia coli" transformadas genéticamente para la producción de licopeno. Aunque "Escherichia coli" no es una bacteria carotenogénica, la transformación de estas células con los enzimas apropiados para la biosíntesis de carotenoides procedentes de bacterias carotenogénicas permite la producción de diversos pigmentos en "E. coli". Este estudio reveló que la producción de licopeno no mejoraba al sobreexpresar una proteína de unión a carotenoides, la orange carotenoid protein (OCP). Es más, células transformadas con una genoteca de "Synechocystis" demostraron que la producción de licopeno mejoraba únicamente al aumentar la disponibilidad de precursores de naturaleza isoprenoide como resultado de interferir con el metabolismo celular. Los carotenoides se sintetizan mayoritariamente a partir de precursores isoprenoides generados por la vía del metilertitritol 5-fosfato (MEP), sirviendo de precursores también para multitud de metabolitos generados en la planta. Por ello nuestro siguiente objetivo consistió en intentar incrementar la disponibilidad de precursores y ver su influencia en la producción de carotenoides en "E. coli". Esto se realizó mediante la activación de la vía endógena de las células (la vía del MEP) y mediante la introducción de una vía foránea (la vía del mevalonato, MVA). En ambos casos se observó que el incremento de la disponibilidad de precursores mejoraba la producción de licopeno en células de "E. coli".<br/> <br/>2. Estudio de la carotenogénesis y la función fisiológica de los carotenoides en tejidos no fotosintéticos de "Arabidopsis thaliana".<br/><br/>En "Arabidopsis thaliana", la biosíntesis de carotenoides está fuertemente activada cuando las plantas pasan de germinar en la oscuridad (escotomorfogénesis) a un metabolismo con luz (fotomorfogénesis). En concreto observamos que la desrepresión de la fotomorfogénesis producía un aumento de la síntesis de carotenoides lo cual parece facilitar la adaptación de las plantas a un metabolismo fotosintético ya que ayuda a incrementar la producción de clorofilas. El aumento de la producción de carotenoides que conlleva la desrepresión de la fotomorfogénesis se debe mayoritariamente a un aumento de la expresión y consecuentemente de la actividad del principal enzima carotenogénico, la fitoeno sintasa (PSY). Ésta, además de controlar la producción de carotenoides en etioplastos puede regular el aporte de precursores de naturaleza isoprenoide procedentes de la vía del MEP. En concreto observamos que un aumento de la actividad de PSY provoca una acumulación post-transcripcional del enzima clave en la regulación de la vía del MEP, el enzima desoxixilulosa 5-fosfato sintasa (DXS). <br/>En otros tejidos no fotosintéticos de Arabidopsis como pétalos y raíces observamos que la expresión de PSY se localizaba en los haces vasculares. En leucoplastos de raíces, los carotenoides se requieren para la producción de los precursores de importantes hormonas como ácido abscísico (ABA, que controla diversas respuestas de la planta frente a condiciones de estrés abiótico) y estrigolactonas. En concreto se observó que en plántulas sometidas a estrés salino, PSY se induce únicamente en la raíz para producir ABA y estrigolactonas, que a su vez controlan la expresión de dicho gen. En conclusión podríamos decir que la regulación de la expresión de PSY en Arabdiopsis permite a la planta incrementar los niveles de carotenoides en respuesta a estímulos externos como luz o estrés abiótico.

<i>"Carotenoid biosynthesis in Escherichia coli and in no-photosynthetic tisúes of Arabidopsis thaliana".<br/><br/>TEXT:<br/><br/>Carotenoids are isoprenoid pigments synthesized by all photosynthetic organism and some non-photosynthetic bacteria and fungi. In plants, these isoprenoids are synthesized in all types of plastids and they serve as precursors of important growth regulators such as absicsic acid (ABA) and strigolactones (both involved in the response to developmental and environmental cues). Besides their antioxidant properties and their use as nutraceuticals, carotenoids have an important industrial value due to their aromatic and colorant properties. Most commercial carotenoids are obtained by chemical synthesis or extraction from natural sources. However, several biotechnological approaches have engineered microorganisms and plants for increased carotenoids levels. However, for metabolic engineering become to a mature technology, several advances in our knowledge are still needed: i) to improve pigment storage capacity in vivo, ii) to overcome the limitation of precursor abundance and iii) to get new insights in the regulation of carotenoid biosynthesis. In our work, we mainly focused on the study of the influence of storage capacity and precursor abundance in carotenoid biosynthesis in engineered E. coli cells for lycopene production. In our study, we demonstrated that lycopene accumulation did not increase by the expression of an orange carotenoid protein (OCP), a carotenoid binding protein whereas the increase of precursor supply resulted in an enhanced carotenoid accumulation. Hence, activation of endogenous (methylerythritol 4-phosphate, MEP) or exogenous (mevalonate, MVA) pathways resulted in an increased lycopene accumulation, suggesting a limiting role of precursors supply for carotenoid production in engineered E. coli cells. On the other hand, in Arabidospsis thaliana, carotenoid biosynthesis is strongly up-regulated when dark-germinated seedlings (skotomorphogenic) emerge form the soil and light de-repress photomorphogenesis. We found that carotenogenesis was also activated when photomorphogenesis is de-repressed even in darkness. Moreover, an enhancement in the carotenoid biosynthetic rate was the result of an up-regulation of the expression of phytoene synthase (PSY), the first carotenogenic enzyme and its concomitant activity. Moreover, PSY controls isoprenoid precursor supply by triggering a post-transcriptional accumulation of the key enzyme of the MEP pathway, deoxyxylulose 5-phosphate synthase (DXS). In root leucoplast, PSY expression was mainly found in bundle vessels probably to ensure a sufficient carotenoid supply for the synthesis of carotenoid-derived root hormones such as ABA or strigolactones. Under salt-stress conditions, we observed a root specific induction of PSY expression to produce ABA and strigolactones, which in turn are addressed to regulate PSY expression specifically in Arabidopsis roots. </i>