Molecular methods to study the movement of predatory arthropods between elements of the landscape: from topical marking to metagenomics

Abstract

Davant les pèrdues de la producció agrícola global a causa de l'acció de les plagues, incrementades encara més per l'escalfament global, el control biològic per conservació (CBC) és una alternativa sostenible per mitigar aquestes pèrdues, en particular mitjançant poblacions naturals d'agents de control biològic (ACBs). L'estudi del paper que juguen els diferents hàbitats que componen el paisatge en el manteniment d'aquests ACBs en els cultius és necessari, i per a això també conèixer el moviment dels ACBs entre conreus i altres hàbitats del paisatge. L'objectiu general d'aquesta Tesi Doctoral és l'estudi del moviment d'artròpodes depredadors polífags entre elements del paisatge (cultius i àrees no conreades) a través de mètodes moleculars, per a una futura millora dels programes de CBC en els cultius d'alfals i préssec de la conca de l'Ebre. Per això, en primer lloc, es va dur a terme l'optimització d'una tècnica de marcatge tòpic amb un ADN no present en l'agroecosistema d'estudi (el crustaci Artemia spp.) i la seva amplificació per PCR convencional. Els resultats van demostrar el moviment des de l’alfals al préssec per part d'artròpodes depredadors d'interès pel control biològic (CB) de les plagues del préssec, com alguns coccinèl·lids, antocòrids del gènere Orius, mírids i crisopes (Capítol 1). Posteriorment, es va dur a terme la posta a punt d'un mètode d'anàlisi metagenòmic mitjançant un anàlisi multi-primer HTS (Capítol 2), per detectar els artròpodes i les plantes consumides pels principals artròpodes depredadors recol·lectats en dues parcel·les contigües de préssec i d’alfals a l'àrea d'estudi, amb la finalitat d'estudiar el seu moviment entre elements del paisatge. Per a això, es van determinar els paràmetres òptims per a la utilització d'aquesta metodologia de seqüenciació massiva mitjançant l'agrupació dels insectes en pools. També es va demostrar la necessitat de rentar els insectes més grans i amb major pilositat de manera prèvia a l'anàlisi metagenòmica, per la seva major capacitat de retenir el pol·len sobre la cutícula, i poder així detectar exclusivament el pol·len ingerit. En total, es van analitzar 13 taxons depredadors pertanyents a les famílies Cantharidae, Anthocoridae, Coccinellidae, MIridae i Lygaeidae, arribant a detectar 69 i 65 interaccions tròfiques artròpode-artròpode i artròpode-planta, respectivament (Capítols 2, 3 i 4). Aquestes van ser, des de relacions tròfiques ja conegudes sobre importants plagues d'alfals i préssec, com Aphis craccivora, Therioaphis trifolii, Liriomyza sp., Hypera sp. i Frankliniella occidentalis, que van confirmar el paper depredador d'espècies com Orius laevigatus, Orius niger, Nabis i Hippodamia variegata; fins interaccions tròfiques desconegudes fins al moment i d'importància per al control de plagues en préssec, com Grapholita molesta, Myzus persicae i Thrips fuscipennis, per part de Anthocoris nemoralis. Les plantes detectades, majoritàriament asteràcies, poàcies i solanàcies, van ser consumides per la majoria dels depredadors analitzats, posant així de manifestant la seva importància per a conservar els depredadors analitzats a prop dels cultius. Es va poder demostrar el moviment de depredadors des dels marges als cultius i entre cultius, ja fos a través de la detecció de preses, com Diaphorina lycii, insecte oligòfag de l'arbust Lycium europaeum, que va ser consumit per Anthocoris nemoralis i per Adelphocoris lineolatus; o mitjançant la ingestió directa de teixits vegetals, com Prunus persica consumit per Orius niger capturats en alfals. També es va detectar depredació intragremial entre el complexe de depredadors analitzats, així com amb altres enemics naturals presents en l'agroecosistema, com entre espècies del gènere Orius; o relacions depredador-parasitoide com Dinocampus coccinellae parasitant Coccinella septempunctata, o Leucostoma sp. parasitant Nabis sp. Aquesta metodologia ha permès també demostrar la omnivoria de la majoria espècies depredadores analitzades, fins i tot en aquells tàxons amb un conegut caràcter fitòfag, com Adelphocoris lineolatus, Nysius i Lygus. Fins i tot també detectar la ingestió per part d’Orius niger de tàxons d'insectes vectors de malalties que afecten el préssec, com la família Cicadellidae; o fins i tot de malalties que afecten animals, com la família Ceratopogonidae o Aedes caspius, suggerint un potencial efecte d'aquest depredador per minimitzar la transmissió d'aquestes malalties, a tenir en compte en un futur. Finalment, aquesta metodologia també ha permès detectar la presència d'espècies de difícil identificació morfològica com Nysius cymoides i Nysius graminicola. Nysius graminicola, plaga del préssec, va ser la presa consumida en un major nombre espècies depredadores. Tots aquests resultats han demostrat el gran potencial de la metodologia HTS utilitzada en aquesta Tesi Doctoral per a l'estudi de les interaccions tròfiques, així com del moviment en agroecosistemes d’insectes de diversa morfologia, informació necessària per posar a punt futurs programes de CB en préssec i en alfals.

Ante las pérdidas de la producción agrícola global debido a la acción de las plagas, incrementadas aún más por el calentamiento global, el control biológico por conservación (CBC) es una alternativa sostenible para mitigar estas pérdidas, en particular mediante poblaciones naturales de agentes de control biológico (ACBs). El estudio del papel que desempeñan los diferentes hábitats que componen el paisaje en el mantenimiento de estos ACB en los cultivos es necesario, y para ello también conocer el movimiento de los ACBs entre cultivos y otros hábitats del paisaje. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es el estudio del movimiento de artrópodos depredadores polífagos entre elementos del paisaje (cultivos y áreas no cultivadas) a través de métodos moleculares, para una futura mejora de los programas de CBC en los cultivos de alfalfa y melocotón de la cuenca del Ebro. Para ello, en primer lugar, se llevó a cabo la optimización de una técnica de marcaje tópico con un ADN no presente en el agroecosistema de estudio (el crustáceo Artemia spp.) y su amplificación por PCR convencional. Los resultados demostraron el movimiento desde la alfalfa al melocotón por parte de artrópodos depredadores de interés para el control biológico (CB) de las plagas del melocotón, como algunos coccinélidos, antocóridos del género Orius, míridos y crisópidos (Capítulo 1). Posteriormente, se llevó a cabo la puesta a punto de un método de análisis metagenómico mediante un análisis multi-primer HTS (Capítulo 2), para detectar los artrópodos y las plantas consumidas por los principales artrópodos depredadores recolectados en dos parcelas contiguas de melocotón y de alfalfa en el área de estudio, con la finalidad de estudiar su movimiento entre elementos del paisaje. Para ello, se determinaron los parámetros óptimos para la utilización de esta metodología de secuenciación masiva mediante la agrupación de los insectos en pools. También se demostró la necesidad de lavar los insectos de mayor tamaño y con mayor pilosidad de manera previa al análisis metagenómico, debido a su mayor capacidad de retener el polen sobre la cutícula, y poder así detectar exclusivamente el polen ingerido. En total, se analizaron 13 taxones depredadores pertenecientes a las familias Cantharidae, Anthocoridae, Coccinellidae, Miridae y Lygaeidae, llegando a detectar 69 y 65 interacciones tróficas artrópodo-artrópodo y artrópodo-planta, respectivamente (Capítulos 2, 3 y 4). Estas fueron desde relaciones tróficas ya conocidas sobre importantes plagas de alfalfa y melocotón, como Aphis craccivora, Therioaphis trifolii, Liriomyza sp., Hypera sp. y Frankliniella occidentalis, que confirmaron el rol depredador de especies como Orius laevigatus, Orius niger, Nabis e Hippodamia variegata; hasta interacciones tróficas desconocidas hasta el momento y de importancia para el control de plagas en melocotón, como Grapholita molesta, Myzus persicae y Thrips fuscipennis, por parte de Anthocoris nemoralis. Las plantas detectadas, mayoritariamente asteráceas, poáceas y solanáceas, fueron consumidas por parte de la mayoría de los depredadores analizados, poniendo así de manifestando su importancia para conservar los depredadores analizados cerca de los cultivos. Se pudo demostrar el movimiento de depredadores desde los márgenes a los cultivos y entre cultivos, ya fuera a través de la detección de presas, como Diaphorina lycii, insecto oligófago del arbusto Lycium europaeum, que fue consumido por Anthocoris nemoralis y por Adelphocoris lineolatus; o a través de la ingestión directa de tejidos vegetales, como Prunus persica consumido por Orius niger capturados en alfalfa. También se detectó depredación intragremial entre el complejo de depredadores analizados, así como con otros enemigos naturales presentes en el agroecosistema, como entre especies del género Orius; o relaciones depredador-parasitoide como Dinocampus coccinellae parasitando Coccinella septempunctata, o Leucostoma sp. parasitando Nabis sp. Esta metodología ha permitido también demostrar la omnivoría de la mayoría especies depredadoras analizadas, incluso en aquellos taxones con un conocido carácter fitófago, como Adelphocoris lineolatus, Nysius y Lygus. Incluso también detectar la ingestión por parte de Orius niger de taxones de insectos vectores de enfermedades que afectan al melocotón, como la familia Cicadellidae; o incluso de enfermedades que afectan a animales, como la familia Ceratopogonidae o Aedes caspius, sugiriendo un potencial efecto de este depredador para minimizar la transmisión de estas enfermedades, a tener en cuenta en un futuro. Finalmente, esta metodología también ha permitido detectar la presencia de especies de difícil identificación morfológica como Nysius cymoides y Nysius graminícola. Nysius graminícola, plaga de melocotón, fue la presa consumida en un mayor número especies depredadoras. Todos estos resultados han demostrado el gran potencial de la metodología HTS utilizada en esta Tesis Doctoral para el estudio de las interacciones tróficas, así como del movimiento en agroecosistemas con insectos de diversa morfología, información necesaria para poner a punto futuros programas de CB en melocotón y en alfalfa.

Faced with global agricultural production losses due to pests' action, further increased by global warming, conservation biological control (CBC) is a sustainable alternative to mitigate these losses, mainly through natural populations of biological control agents (BCAs). The study of the role that the different habitats that compound the landscape play in the maintenance of the BCAs in crops is necessary, and for this reason, to know the movement of BCAs between crops and other habitats in the landscape is essential. The general objective of this Doctoral Thesis is to study the movement of polyphagous predatory arthropods among landscape elements (crops and non-cultivated areas) through molecular methods, for a future improvement of CBC programs in alfalfa and peach crops in the Ebro basin. To do this, firstly were performed the optimization of a topical marking technique with a DNA non present in the study agroecosystem (the crustacean Artemia spp.) and its amplification by conventional PCR. Results demonstrated the movement from alfalfa to peach by predatory arthropods of interest for the biological control (BC) of peach pests, such as some coccinellids, anthocorids of the genus Orius, mirids and chrysopids (Chapter 1). Subsequently, the development of a metagenomic analysis method was carried out through a multi-primer HTS approach (Chapter 2) to detect the main arthropod and plant consumed resources by the predatory arthropods collected in two contiguous plots of peach and alfalfa in the study area, in order to demonstrate its movement between elements of the landscape. To achieve this objective, the optimal parameters for using this massive sequencing methodology were determined by grouping insects by pools. The need to wash larger insects with greater hairiness before metagenomic analysis was also demonstrated, due to their remarkable ability to retain pollen on the cuticle, and thus be able to detect ingested pollen exclusively. In total, 13 predatory taxa belonging to the Cantharidae, Aanthocoridae, Coccinellidae, Miyridae and Lygaeidae families were analysed, detecting 69 and 65 arthropod-arthropod and arthropod-plant trophic interactions, respectively (Chapters 2, 3 and 4). These were trophic relationships already known on important pests of alfalfa and peach, such as Aphis craccivora, Therioaphis trifolii, Liriomyza sp., Hypera sp. and Frankliniella occidentalis, which confirmed the predatory role of species such as Orius laevigatus, Orius niger, Nabis and Hippodamia variegata; or other trophic interactions unknown until now on important pests in peaches, such as Grapholita molesta, Myzus persicae and Thrips fuscipennis consumed by Anthocoris nemoralis. The plants detected, mainly Asteraceae, Poaceae and Solanaceae, were consumed by most of the analysed predators, thus demonstrating their importance to conserve those predators near the crops. The movement of predators from the margins to the crops, and between crops, could be demonstrated, either through the detection of ingested prey, such as Diaphorina lycii, an oligophagous insect of the Lycium europaeum shrub, which was consumed by Anthocoris nemoralis and Adelphocoris lineolatus; or through the direct ingestion of plant tissues, such as Prunus persica consumed by Orius niger captured in alfalfa. Intra-guild predation was also detected among the complex of analysed predators and other natural enemies present in the agroecosystem, such as among species of the genus Orius; or predator-parasitoid relationships such as Dinocampus coccinellae parasitizing Coccinella septempunctata, or Leucostoma sp. parasitizing Nabis sp. This methodology has also made possible to demonstrate the omnivory of the majority of the predatory species analysed, even in those taxa with a known phytophagous character, such as Adelphocoris lineolatus, Nysius and Lygus. Even also allowed the detection of the ingestion by Orius niger of insect taxa vectors of diseases that affect peaches, such as the Cicadellidae family; or even diseases that affect animals, such as the family Ceratopogonidae or Aedes caspius, suggesting a potential effect of this predator to minimize the transmission of these diseases, to be considered in the future. Finally, this methodology has also made possible to detect species of difficult morphological identification such as Nysius cymoides and Nysius graminícola. Nysius graminícola, a peach pest, was the prey consumed in a higher number of predatory species. All these results have demonstrated the great potential of the HTS methodology used in this Doctoral Thesis to study trophic interactions and movement in agroecosystems with insects of diverse morphology, information necessary to fine-tune future CB programs in peach and in alfalfa.