Introducción Las plaquetas reticuladas (PR) son las formas más jóvenes de las plaquetas circulantes, que contienen ARN residual, y por tanto constituyen el equivalente plaquetario de los reticulocitos de la serie roja. La primera descripción se realizó en 1969, a partir de su visión directa en extensiones periféricas de un modelo animal de pérdida de sangre. Los primeros trabajos que investigan su aplicación clínica no aparecen hasta 1990, cuando es posible utilizar la citometría de flujo para su identificación. La determinación de PR por citometría de flujo, no es una técnica estandarizada, se han utilizado distintos sustratos, sangre total o plasma rico en plaquetas, diversos colorantes y diferentes tiempos de incubación. Metodología Entre 2002 y 2005, se recogieron de forma prospectiva pacientes que ingresados o de forma ambulatoria presentaban trombocitopenia, inferior a 100x109/L confirmada por revisión manual de extensión periférica así como un grupo control de pacientes no trombocitopénicos. Se determinó el porcentaje de plaquetas reticuladas mediante citometría de flujo, usando sangr total como sustrato y un doble marcaje de las plaquetas. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-glicoproteina III (CD61 PerCP®) para identificar las plaquetas y Naranja de Tiazol (Retic-count®) como colorante de ARN plaquetar. La determinación automática de PR, se realizó detrminando la fracción plaquetar inmadura (IPF) mediante el autoanalizador Sysmex XE 2100. Objetivos y Resultados Objetivo 1, Valorar si la determinación de plaquetas reticuladas mediante citometría de flujo utilizando un doble marcaje es una técnica capaz de diferenciar trombocitopenias de diferentes etiologías. Los resultados de este primer trabajo fueron publicados en European Journal of Internal Medicine (M. Monteagudo Jiménez, MJ Amengual Guedán, L Muñoz Martín , JA Soler Campos, I Roig Martínez, C Tolosa Vilella. Measurement of reticulated platelets by simple flow cytometry : an indirect thrombocytopoienic marker. Eur J Intern Med. 2006 Dec;17(8): 541-4). Objetivo 2. Valorar si la determinación de plaquetas reticuladas por citometría de flujo a partir de sangre total puede ser una técnica útil de cribado inicial para el diagnóstico etiológico de las trombocitopenias. Los resultados de este segundo trabajo fueron publicados en Quaterly Journal Medicine (Monteagudo M, Amengual MJ, Muñoz L, Soler JA, Roig I, Tolosa C. Reticulated platelets as a screening test to identify thrombocytopenia aetiology QJM. 2008 Jul;101(7):549-55). Objetivo 3. Analizar la correlación que existe entre la determinación de plaquetas reticuladas por citometría de flujo y el número de megacariocitos en médula ósea determinados por aspirado medular. Los resultados de este tercer trabajo fueron publicados en Medicina Clínica (Monteagudo M, Lucchetti G, Amengual MJ, Muñoz L, Soler JA, Roig I, Tolosa C. Relationship between reticulated platelets and megacaryocyte number in thrombocytopenic patients Med Clin (Barc). 2009 Jun 20;133(3):81-5). Objetivo 4. Valorar la correlación existente entre los valores de PR determinadas por citometría de flujo con los resultados de la fracción plaquetar inmadura (IPF), determinada de forma automática mediante el autoanalizador Sysmex 2100. Los resultados de este último trabajo fueron publicados en European Journal of Haematology (Pons I , Monteagudo M, Lucchetti G, Mun˜ oz L, Perea G, Colomina I, Guiu J, Obiols J. Correlation between immature platelet fraction and reticulated platelets. Usefulness in the etiology diagnosis of thrombocytopenia. Eur J Haematol 2010 August ; 85(2):158-163 ). Conclusiones 1. La determinación de plaquetas reticuladas a partir de sangre total utilizando un doble marcaje, mediante citometría de flujo y sin manipulación de la muestra es una técnica de fácil realización y reproducible. 2. La determinación de plaquetas reticuladas por esta técnica permite diferenciar trombocitopenias de origen central de trombocitopenias de origen periférico. 3. Unos valores de plaquetas reticuladas por encima del 11% mediante esta metodología, tienen una alta sensibilidad (93%) y buena especificidad (85%) para el diagnóstico de trombocitopenia periférica, con actividad megacariocítica medular elevada. 4. Debe tenerse presente la posibilidad de que existan falsos negativos, pero especialmente falsos positivos, en algunos pacientes con síndromes mielodisplásicos y algunas leucemias agudas de estirpe linfoide o mieloide. 5. Las plaquetas reticuladas en sangre periférica son un marcador indirecto de la actividad megacariocítica medular. 6. La presencia de plaquetas reticuladas periféricas superiores al 11%, en trombocitopenias aisladas y agudas, tiene una buena correlación con el número de megacariocitos a nivel medular. 7. Existe una buena correlación entre la determinación de plaquetas reticuladas realizada mediante citometría de flujo, según nuestra metodología, y los valores de plaquetas reticuladas realizadas de forma automática mediante el valor IPF del autoanalizador Sysmex-2100. 8. Los valores de IPF obtenidos en nuestros pacientes tienden a ser globalmente superiores, a los valores de plaquetas reticuladas medidas por citometría de flujo. 9. La sencillez de realización del IPF, su reproducibilidad y su buena correlación con la citometría de flujo pueden convertir su determinación en una técnica de cribado útil para la orientación etiológica inicial en el paciente trombocitopénico, siempre que se tenga en cuanta la valoración global del mismo.

Introduction Reticulated platelets (RP) are the youngest forms of circulating platelets, which contain residual RNA, and therefore constitute the platelet equivalent of red cell reticulocytes. The first description was made in 1969, by direct visualization in peripheral blood film in an animal model of blood loss. The first study investigating the clinical application do not appear until 1990, when it is possible to use flow cytometry for their identification. RP measurement by flow cytometry is not a standardized technique. Several dyes for mRNA stain have been used. Two substrates for RP determination, whole blood or platelet rich plasma have been published and different incubation times have been described Methodology From 2002 to 2005, we prospectively enrolled both admitted and out patients being attend at our Hospital with thrombocytopenia, fewer than 100x109 /L, confirmed after peripheral blood film review and a control group of non thrombocytopenic patients. A direct, whole-blood, dual–labelling flow cytometric method was used. Direct, whole-blood double coverage was achieved using a monoclonal anti-glycoprotein III antibody (CD 61 PerCP) for platelet identification and thiazole orange (Retic-count) as platelet mRNA stain.The automatic determination of PR, was measured by determining the immature platelet fraction (IPF) by autoanalyzer Sysmex XE 2100. Objectives and Results Objective 1 To assess whether the determination of reticulated platelets by flow cytometry using double labeling is a technique capable of differentiating different causes thrombocytopenia. The results of this first study were published in European Journal of Internal Medicine (M. Monteagudo Jiménez, MJ Amengual Guedán, L Muñoz Martín, JA Soler Campos, I Roig Martínez, C Tolosa Vilella. Measurement of reticulated platelets by simple flow cytometry: an indirect thrombocytopoienic marker. Eur J Intern Med 2006 Dec; 17 (8): 541-4). Objective 2. Assess whether the determination of reticulated platelets by flow cytometry from whole blood can be a useful initial screening test for the etiological diagnosis of thrombocytopenia. The results of this second study were published in Quarterly Journal of Medicine (Monteagudo M, Amengual MJ, Muñoz L, Soler JA, Roig R, Tolosa C. Reticulated platelets as a screening test to Identify thrombocytopenia aetiology QJM. 2008 Jul; 101 (7) :549-55). Objective 3. To analyze the correlation between the determination of reticulated platelets by flow cytometry and the number of megakaryocytes in bone marrow determined by bone marrow aspiration. The results of this third study were published in Medicina Clínica (Monteagudo M, Lucchetti G, Amengual MJ, Muñoz L, Soler JA, Roig R, Tolosa C. Relationship between reticulated platelets and megacaryocyte number in thrombocytopenic patients. Med Clin (Barc). 2009 June 20, 133 (3) :81-5). Objective 4. To assess the correlation between PR values determined by flow cytometry with the results of the immature platelet fraction (IPF), automatically determined by the autoanalyzer Sysmex 2100. The results of this latest study were published in European Journal of Haematology (Pons I, Monteagudo M, Lucchetti G, Muñoz L, Perea G, Colomina I, Guiu J, Obiols J. Correlation between immature platelet fraction and reticulated platelets. Usefulness etiology in the diagnosis of thrombocytopenia. Eur J Haematol 2010 August, 85 (2) :158-163). Conclusions 1. The determination of reticulated platelets from whole blood using double labeling, flow cytometry and without sample manipulation is a technique easy to perform and reproducible. 2. The determination of reticulated platelets by this technique allow to differentiate between thrombocytopenia of central origin of thrombocytopenia of peripheral origin. 3. Reticulated platelet values above 11% with this methodology, have a high sensitivity (93%) and good specificity (85%) for the diagnosis of peripheral thrombocytopenia with high megakaryocytic marrow activity. 4. Should be considered the possibility of false negatives, but especially false positives, in some patients with myelodysplastic syndromes and some acute leukemias of lymphoid or myeloid. 5. Reticulated platelets in peripheral blood are a surrogate marker for megakaryocytic marrow activity. 6. The presence of peripheral reticulated platelets above 11% in isolated and acute thrombocytopenia, is well correlated with an elevated number of megakaryocytes in bone marrow 7. There is good correlation between the determination of reticulated platelets by flow cytometry carried out according to our methodology, and values of immature platelet fraction (IPF) performed automatically by the autoanalyzer Sysmex IPF-2100. 8.. IPF values obtained in our patients tend to be higher than the values of reticulated platelets measured by flow cytometry 9. The simplicity of implementation of the IPF, reproducibility and good correlation with flow cytometry, makes its determination on an useful screening test for thrombocytopenic patient, provided that we take into account the overall assessment of the patient