Síntesi, caracterització i estudi cromatogràfic d'oligoprolines com a agents d'afinitat

Abstract

En un ambient biològic, intrínsecament asimètric, l’activitat de les substàncies quirals pot estar fortament condicionada per la seva estereoquímica. Aquesta és la raó per la qual les tècniques enantioselectives han esdevingut una eina essencial tant per la determinació analítica de la composició en enantiòmers d’una mostra com per la obtenció i preparació d’aquests isòmers de manera separada.

Tot i que existeix un nombre considerable de procediments i tècniques quirals, la cromatografia juga un paper molt rellevant en aquest context. És per això que la recerca de noves fases estacionàries quirals (FEQs) capaces de resoldre un ventall extens de parells d’enantiòmers segueix sent de transcendental importància. En aquest aspecte, un dels avenços més sorprenents i inesperats és l’ús de selectors quirals (SQs) derivats de les cadenes d’oligoprolines. En una sèrie d’estudis anteriors, diferents FEQs derivatizades amb aquest tipus d’estructures van demostrar valors de d’enantioselectivitat i resolució així com un rang d’aplicació similars o superiors als de famílies de FEQs que contenen SQs d’un pes molecular semblant.

En la present tesi doctoral, es presenta la síntesi d’un SQ de tipus octaprolina més simple, més enantioselectiu, més aplicable, més versàtil i més fàcil de sintetitzar que els estudiats en treballs anteriors. Per això, es descriu la síntesi d’un octapèptid de prolina que es dur a terme mitjançant un mètode de síntesi peptídica en fase sòlida (SPPS) tipus Fmoc. En el pèptid obtingut se li afegeix un grup terminal trimetilacetil (Tma) i a partir d’aquí es procedeix al ancoratge sobre sílice gel. Posteriorment es procedeix a la fabricació de la columna quiral resultant. El comportament cromatogràfic de la nova FEQ s’avalua i es compara amb FEQs similars que contenen grups 3,5-dimetilfenilcarbamats en la posició 4 de l’anell de pirrolidina de tots els monòmers que constitueixen la cadena. És en aquest punt on s’estableix un mecanisme d’enantioreconeixement principalment basat en interaccions mitjançant enllaços per pont d’hidrogen.

A més a més, l’ús de diferents condicions cromatogràfiques permet demostrar que l’enantioselectivitat és clarament dependent de la fase mòbil utilitzada. Quan s’utilitzen mescles d’un alcà i un alcohol, o d’un alcà i un èter com a fase mòbil, s’obtenen valors d’enantioselectivitat força semblants. En canvi, en absència d’un dissolvent amb grups donadors d’enllaços d’hidrogen i amb presència de dissolvents clorats, força habituals en separacions enantioselectives, els factors de separació disminueixen significativament. No obstant, es demostra que la desaparició de l’enantioselectivitat és un fenomen totalment reversible que s’atribueix al canvi conformacional que experimenten les cadenes de poliprolina segons en el dissolvent en el qual es troben immerses

Seguidament, diferents SQs de la família de les oligoprolines s’uneixen a columnes monolítiques de sílice gel. La derivatització es realitza de forma repetitiva i es procedeix a testar l’enantioselectivitat després de cada reacció. Així, es pot demostrar que l’habilitat enantioselectiva, la resolució i l’eficiència depenen de la quantitat de SQ contingut dins de cada columna, resultant ser la columna més derivatitzada la que exhibeix un millor comportament cromatogràfic. Quan les columnes monolítiques amb el mateix SQ es comparen amb les seves anàlogues particulades, les primeres mostren millor enantioselectivitat i un espectre d’aplicació més ampli. Finalment, quan s’examina la capacitat de càrrega, aquesta és de l’ordre de 3 a 20 vegades superior per les columnes monolítiques que les respectives particulades.

Per acabar, l’enantioselectivitat i el comportament cromatogràfic de diferents FEQs tipus oligoprolina es proven sota condicions de fluids supercrítics, obtenint valors favorables d’enantioselectivitat, resolució i eficiència. Aquests valors són encara més positius quan es combinen les condicions de cromatografia de fluids supercrítics amb columnes de suports monolítics. No obstant, la millora més notable en aquestes noves condicions és la significant reducció del temps d’anàlisi, fet que obre les portes a utilitzar aquest tipus de FEQs per treballar en condicions de high-througput.

Nowadays, enantioselective chromatography has become a mature technique and chiral stationary phases (CSPs) nearly routine tools in the analysis and purification of enantiomers. One of the most striking and recent novelties in this area is the recognition of the outstanding and, in some way, unexpected enantioselectivity provided by oligopolyproline-derived chiral selectors (CSs). In a number of previous studies, oligoproline-based CSPs showed interesting enantioselectivity and a broad application domain, in spite of being constituted by relatively low-molecular weight CSs.

For this reason, in this work, a proline octapeptide-derived chiral selector (CS) end- capped using a pivaloyl group was covalently linked to a silica gel chromatographic matrix by the C-terminal group. The chromatographic behavior of the resulting chiral CSP using different conditions was compared to those containing 3,5- dimethylphenylcarbamate residues on the proline units. An enantioselectivity highly dependent on the mobile phase used is observed for these CSPs. This phenomenon was proved to be reversible and it was attributed to a conformational change in the CS.

Moreover, monolithic silica gel chromatographic matrices were derivatized repetitively with oligoproline-derived CSs. The enantioseparation ability, resolution and efficiency were found to depend on the content of CS attained after each reaction. Additionally, enantioselectivity and performance of the column with the highest CS coverage were compared to those of a bead-based CSP counterpart. The oligoproline-derivatized monolithic column demonstrated increased separation factors, resolution and broader applicability than the particle-based column. Finally, the loading capacity was found to be 3–20 times higher for the monolithic columns than their particle-based counterparts. An effect produced by the chromatographic silica support structure is suggested as the responsible of the enhanced capabilities of the derivatized monolithic columns with respect to that of their bead-based analogues.

Finally, the chromatographic behaviour and performance of different polyproline- derived CSPs were tested using supercritical fluid chromatography (SFC). The compounds tested in the SFC conditions had already been resolved by normal phase HPLC. Great enantioselection ability was shown by the CSPs for the analytes tested in the new conditions. Resolution, efficiency and analysis time, were considerably enhanced with respect to NP-HPLC when CO2/alcohol mobile phases were used. Once again, monolithic columns clearly show enhanced chromatographic parameters and improved performance respect to their bead-based counterparts.