Modulació de l’activació microglial com a estratègia neuroreparadora

Abstract

L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives.

El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari.

Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma.

En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular.

Microglial activation is a physiologic phenomenon that occurs in response to alterations of homeostasis. When microglia are activated by an pro-inflammatory stimulus there is an inflammatory response where cytokines and other pro-inflammatory factors with neurotoxic potential are released. A chronic or exacerbated response can have harmful effects; in fact many authors connect microglial pro-inflammatory overactivation with degenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Given that, the main goal of this thesis was develope strategies to inhibit pro-inflammatory microglial activation that could serve as therapeutic target in neurodegenerative diseases.

To do so we set up and characterized an in-vitro model of neuroinflammation using LPS + interferon-gamma as a proinflammatory stimulus. Treated microglial cells undergo a proinflammatory response pattern characterized by the release of NO, TNF-alpha and IL-6 and the increase of iNOS and COX-2 expression. When microglial cells are co-cultured with cortical neurons, the pro-inflammatory response results in neurotoxicity, an effect mediated mainly by NO release, whereas TNF-alpha, la IL-6 and COX-2 may have a secondary role in the process.

Using this model we tested whether we could modulate microglial activation by inhibiting C/EBPs, a family of transcription factors involved in the regulation of pro-inflammatory genes. We first used a pharmacologic approach treating microglial cells with an anti-inflammatory compound named crisin. We determinated that crisin has anti-inflammatory and neuroprotective effects and that these effects are mediated,at least in part, by C/EBP-delta inhibition. We then used a genetic approach to inhibit C/EBPs, by using microglial cells from KO mice. We showed that the lack of C/EBP-beta or C/EBP-delta inhibits microglial activation and the associated neurotoxicity. Therefore, we suggest that C/EBPs are a potential therapeutic target in the treatment of diseases where neuroinflammation is present.

We also modulated microglial activation by potentiating the inhibitory signals that keep microglia in a resting state, such as the neuronal ligand CD200 and its microglial receptor CD200R. We showed that CD200 expression appears to increase in response to neuronal death but not in response to pro-inflammatory stimuli such as IL-4, IL-10 or anti-inflammatory stimuli such as LPS and IFN-gamma.

In summary we demonstrated that in-vitro models can be used to study the pro-inflammatory and neurotoxic effect of the microglial response. Using this approach we determinated the relevance of C/EBPs in regulating microglial activation and our studies support an important role of CD200 in the crosstalk between microglia and neurons that undergoing cell death.