Dominis estructurals i noves interaccions proteiques de l'enzim deubiquitinant USP25

Abstract

La present Tesi Doctoral es presenta com una agrupació de quatre publicacions que resumeixen el treball realitzat al Departament de Genètica de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona. El principal objectiu és la caracterització funcional de les regions estructurals de la isoforma muscular de l’enzim deubiquitinat USP25, inicialment definides amb eines bioinformàtiques. A més a més, es pretén fer un estudi de noves interaccions moleculars tipus proteïna-proteïna per la cerca de nous substrats o reguladors enzimàtics.

La cèl•lula eucariota posseeix, entre altres, un sistema senyalitzador intracel•lular basat en una família de pèptids, el representant dels quals és la ubiquitina. Aquest sistema presenta diferents categories funcionals, entre elles, els enzims deubiquitinants, un centenar a l’espècie humana. Aquests enzims hidrolitzen l’enllaç que uneix la ubiquitina als seus precursors o substrats, mantenint així l’homeostasi d’aquest pèptid dins la cèl•lula. Una alteració de la seva funció pot portar diferents conseqüències depenent de la via metabòlica que es vegi afectada, doncs suposa una desregulació estequiomètrica dels substrats ubiquitinants respecte els no ubiquitinats. L’enzim deubiquitinant USP25 es va descriure en el grup d’investigació d’aquesta tesi durant la cerca de nous gens relacionats amb la síndrome de Down. Un cop caracteritzat funcionalment com una proteasa específica d’ubiquitina, els estudis d’expressió van mostrar l’existència de tres isoformes proteiques, una d’elles, USP25m, restringida al teixit muscular i cardíac.

Tenint en compte que en el fenotip dels pacients amb síndrome de Down, entre altres trets, hi ha deficiència cardiovascular i atonia muscular, els esforços del grup es van centrar en la descripció i anàlisi d’aquesta isoforma. Els primers estudis van mostrar la seva situació citosòlica, l’expressió correlativa amb la diferenciació de cèl•lules musculars i la relació específica amb diverses proteines del sarcòmer. En el treball realitzat per la present Tesi Doctoral, s’han caracteritzat funcionalment diferents regions reguladores descrites a nivell bioinformàtic, així com també s’ha analitzat la seva implicació fisiológica a la funció d’USP25m. A més a més, mitjançant un estudi de cerca de nous interactors proteics, s’ha trobat una nova molècula que pertany a la mateixa via senyalitzadora i que es relaciona de manera específica amb USP25m, la lligasa d’ubiquititna MKRN1 (makorin 1)

Mitjançant l’ús de diferents construccions amb delecions i mutacions puntuals de la proteïna que afecten a les regions d’interès, s’ha arribat a diferents conclusions, entre elles, que USP25m és monoubiquitinat i té la capacitat d’autodeubiquitinar-se. La monoubiquitinació en regula la seva activitat enzimàtica i es proposa un mecanisme de regulació basat en la conjugació alternativa de SUMO (una altra molècula de la família de la ubiquitina) i ubiquitina, en el mateix residu aminoacídic, la lisina 99 (Lys99). Els dominis d’unió a ubiquitina regulen el reconeixement de substrat i afavoreixen la monoubiquitinació. USP25m oligomeritza dins la cèl•lula i es troba present en diferents formacions proteiques d’elevat pes molecular. S’ha comprovat la relació específica amb la nova lligasa MKRN1 i es suggereixen diferents escenaris moleculars on poden trobar-se inclosos els dos pèptids

The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions.

The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins.

Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.

The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions.

The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins.

Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.