Physiological welfare indicators in cetaceans: epidermal cortisol and oxytocin concentrations in managed and wild populations

Abstract

La consciència sobre el benestar dels cetacis, tant en animals sota cura humana com en llibertat, ha augmentat considerablement en els darrers anys. Com a conseqüència, les consideracions de benestar tenen avui un paper rellevant en la formulació de polítiques institucionals i en l’elaboració de regulacions relacionades amb la protecció d’aquestes espècies. En aquest context, el desenvolupament de mesures fiables per avaluar el benestar s’ha convertit en una necessitat, especialment per a aquestes espècies amb un estil de vida aquàtic que històricament ha dificultat la recerca. Els marcadors fisiològics obtinguts a partir de diverses mostres biològiques poden proporcionar indicadors fiables, encara que inespecífics, de l’estat de benestar. En cetacis, les concentracions d’oxitocina (EOC) i cortisol epidèrmic (ECC) podrien oferir mètodes per avaluar el benestar a llarg termini i entendre com diversos estressors l’afecten. Tanmateix, abans de ser utilitzats, cal validar cada indicador per garantir que els mètodes de mostreig i anàlisi detecten de manera fiable les concentracions hormonals, i que els valors obtinguts reflecteixen els estats fisiològics i afectius.

Així doncs, aquesta tesi té com a objectiu validar l’ECC i l’EOC com a indicadors fisiològics del benestar en cetacis. S’han desenvolupat protocols de mostreig epidèrmic estandarditzats que s’han adaptat amb èxit a diferents espècies i contextos, incloent-hi dofins mulars (Tursiops truncatus), belugues (Delphinapterus leucas) i orques (Orcinus orca) sota cura humana, així com dofins ratllats (Stenella coeruleoalba) varats. Per a cada espècie i hormona, s’han optimitzat i validat els mètodes d’extracció i quantificació epidèrmica utilitzant immunoassaigs ELISA o AlphaLISA. Aquests protocols han assolit nivells elevats d’especificitat, precisió i sensibilitat, la qual cosa recolza l’ús per a una quantificació hormonal fiable. La tesi també analitza factors de confusió que podrien influir en les concentracions hormonals i comprometre la interpretació de les dades. S’observa que una massa de mostra baixa augmenta la variabilitat i redueix la precisió de les mesures de cortisol. A més, tant l’ECC com l’EOC han mostrat variacions en funció de la regió corporal, la capa epidèrmica i l’estació de l’any, fet que posa de manifest la importància d’aplicar protocols estandarditzats i considerar acuradament les variables ambientals.

D’altra banda, aquesta tesi avalua si l’ECC i l’EOC reflecteixen l’activitat integrada de l’eix hipotalàmic–hipofisiari–adrenal i del sistema d'oxitocina, respectivament, i examina la seva rellevància com a indicadors fisiològics del benestar en cetacis. L’ECC mostra correlacions elevades amb el cortisol en sèrum i greix, i varia de manera biològicament significativa en resposta a estressors, condicions de salut i modulació farmacològica, la qual cosa recolza la seva utilitat com a mesura retrospectiva de l’activitat de l’eix HPA. L’ECC també s’ha correlacionat amb una varietat de condicions associades a estats afectius, incloent-ne la seva gravetat i durada, reforçant així el seu potencial com a indicador no invasiu de benestar. Paral·lelament, l’EOC s’ha correlacionat significativament amb l’ECC i ha respost de manera inconsistent a estressors i a la motivació social i ambiental, possiblement reflectint el paper de l’oxitocina en la vinculació social i la recompensa, així com la seva interacció moduladora amb el sistema d’estrès. Addicionalment, s’han observat canvis similars en l’EOC sota condicions associades tant a estats afectius positius com negatius, cosa que actualment en limita l’aplicabilitat com a indicador fisiològic del benestar en cetacis.

En definitiva, aquesta tesi aporta evidència rellevant sobre la validesa i aplicabilitat de l’ECC i l’EOC com a indicadors fisiològics no invasius del benestar en cetacis, i ofereix orientació metodològica i pràctica per al seu ús i mesura. A més, obre noves preguntes de recerca que podrien ampliar el seu ús en l’estudi de qüestions relacionades amb el benestar i la conservació.

La concienciación sobre el bienestar de los cetáceos, tanto en animales bajo cuidado humano como en libertad, ha aumentado considerablemente en los últimos años. En consecuencia, las consideraciones sobre bienestar desempeñan actualmente un papel relevante en políticas y regulaciones sobre protección y conservación de estas especies. En este contexto, desarrollar medidas fiables para evaluar el bienestar es esencial, especialmente por las dificultades históricas para investigar especies acuáticas. Los marcadores fisiológicos obtenidos de muestras biológicas pueden proporcionar indicadores fiables, aunque inespecíficos, del bienestar. En cetáceos, las concentraciones epidérmicas de oxitocina (EOC) y cortisol (ECC) podrían ofrecer métodos no invasivos para evaluar el bienestar a largo plazo y analizar cómo diversos estresores lo afectan. Sin embargo, antes de usarlos, es necesario validar rigurosamente estos indicadores para cada especie, garantizando que los métodos de muestreo y análisis sean precisos y que reflejen correctamente estados fisiológicos y afectivos.

Esta tesis tiene como objetivo validar y optimizar ECC y EOC como indicadores fisiológicos del bienestar en cetáceos. Se han desarrollado protocolos estandarizados, no invasivos, adaptados con éxito a distintas especies y contextos, incluyendo delfines mulares (Tursiops truncatus), belugas (Delphinapterus leucas) y orcas (Orcinus orca) bajo cuidado humano, así como delfines listados (Stenella coeruleoalba) varados y fallecidos. Para cada especie y hormona se han optimizado métodos de extracción y cuantificación epidérmica mediante inmunoensayos ELISA o AlphaLISA. Estos protocolos mostraron niveles altos de especificidad, precisión y sensibilidad, confirmando su utilidad para cuantificar hormonas de forma fiable. Además, la tesis analiza posibles factores de confusión no relacionados con bienestar que podrían influir en las concentraciones hormonales. Se observó que masas de muestra bajas (<20 mg) aumentan la variabilidad y reducen la precisión en las medidas de cortisol. Asimismo, ECC y EOC varían según región corporal, capa epidérmica y estación del año, destacando la importancia de protocolos estandarizados y de considerar variables ambientales.

Por otro lado, se evaluó si las ECC y EOC reflejan la actividad integrada del eje hipotalámico–hipofisario–adrenal (HPA) y del sistema oxitocina, respectivamente, examinando su relevancia como indicadores fisiológicos del bienestar. Las ECC mostraron correlaciones altas con cortisol en suero y grasa, variando significativamente ante probables estresores, condiciones de salud y modulación farmacológica, confirmando su utilidad como medida retrospectiva de la actividad del eje HPA. También se correlacionó con diversas condiciones afectivas, destacando su potencial como indicador no invasivo de bienestar. Las EOC mostraron correlación significativa con ECC, aunque con respuestas inconsistentes ante probables estresores y motivaciones sociales y ambientales, posiblemente debido al papel de la oxitocina en vínculos sociales, recompensa e interacción moduladora con el sistema del estrés. Se observaron cambios similares en EOC en condiciones afectivas positivas y negativas, limitando su aplicabilidad actual como indicador fisiológico del bienestar.

En conclusión, esta tesis aporta evidencia relevante sobre la validez y aplicabilidad de ECC y EOC como indicadores fisiológicos no invasivos del bienestar en cetáceos. Proporciona orientación metodológica práctica para su medición y plantea nuevas preguntas de investigación para ampliar su uso en estudios relacionados con bienestar y conservación, tanto en cetáceos en cautividad como en libertad.

Awareness of cetacean welfare, both in managed care and in response to anthropogenic impacts in the wild, has increased substantially in recent years. As a result, welfare considerations now play a significant role in shaping institutional policies and informing regulations related to cetacean protection and conservation. In this context, developing robust and reliable welfare assessment measures has become essential, particularly for species whose aquatic lifestyle has historically posed significant research challenges. Physiological markers obtained from a variety of biological samples can provide reliable, nonspecific indicators of animal welfare. In cetaceans, epidermal cortisol concentrations (ECC) and oxytocin concentrations (EOC) may offer non-invasive methods for assessing long-term welfare and understanding how multiple stressors impact it. However, before its use and for each species, every indicator requires rigorous validation to ensure that both sampling and analytical methods reliably detect hormone concentrations, and that the resulting values accurately reflect physiological and affective states. Accordingly, this thesis aimed to validate and optimize ECC and EOC as physiological welfare indicators in cetaceans. Standardized, non-invasive epidermal sampling protocols were successfully developed and adapted across species and contexts, including voluntarily participating bottlenose dolphins (Tursiops truncatus), belugas (Delphinapterus leucas), and killer whales (Orcinus orca) under human care, as well as stranded, deceased striped dolphins (Stenella coeruleoalba). For each species and hormone, epidermal extraction and quantification methods were optimized and validated using either ELISA or AlphaLISA immunoassays. These protocols consistently achieved high levels of specificity, precision, and sensitivity, supporting their use for reliable hormone quantification. The thesis also examined potential confounding factors unrelated to welfare that may affect hormone concentrations and compromise data interpretation. Low sample mass (<20 mg) was found to increase variability and reduce the accuracy of cortisol measurements. Additionally, both ECC and EOC varied by sampled body region, epidermal layer, and season, underscoring the need for consistent sampling protocols and careful consideration of environmental variables when using these indicators. Further, this thesis evaluated whether ECC and EOC reflect integrated activity of the hypothalamic–pituitary–adrenal (HPA) axis and the oxytocin system, respectively, and assessed their relevance as physiological welfare indicators in cetaceans. ECC showed strong correlations with cortisol in serum and blubber and varied in a biologically meaningful way in response to assumed stressors, health conditions, and pharmacological modulation, supporting its utility as a retrospective, long-term measure of HPA axis activity. ECC correlated with a range of conditions assumed to reflect affective states, including their severity and duration, reinforcing its potential as a non-invasive welfare indicator. In parallel, EOC was significantly correlated with ECC and responded inconsistently to assumed stressors and to social and environmental motivation, likely reflecting oxytocin’s role in bonding and reward, as well as its modulatory interplay with the stress system. Additionally, similar changes in EOC were observed under conditions assumed to reflect both positive and negative affective states, currently limiting its applicability as a physiological welfare indicator in cetaceans. Overall, this thesis provides important evidence on the validity and relevance of ECC and EOC as non-invasive physiological welfare indicators in cetaceans, offering methodological and practical guidance for their measurement and application. Furthermore, it opens up new research questions which could further expand the use of these indicators in addressing welfare and conservation-related issues, both in managed and wild cetacean populations.