The role of glycosylated sterols in tomato development and stress response

Abstract

Els fitoesterols es troben en forma lliure (FS) i conjugats com èsters d'esterols (SE), esteril glucòsids (SG) i esteril glucòsids acil·lats (ASG). Els FS, SG i ASG són components integrals de les membranes cel·lulars que modulen les seves propietats biofísiques i la seva funcionalitat. Les esterol glicosiltransferases (SGT) catalitzen la glucosilació del grup hidroxil C3 dels FS per produïr SG, la posterior acil·lació dels quals origina els ASG. Les funcions fisiològiques i els mecanismes d'acció dels esterols glicosilats romanen encara poc caracteritzats. Per investigar els efectes de les alteracions del metabolisme dels esterols glicosilats en el desenvolupament de les plantes i les respostes a l'estrès abiòtic i biòtic, en aquesta tesi hem utilitzat mutants de tomàquet (Micro-Tom) amb perfils contrastants d'esterols, obtinguts per sobreexpressió de SlSGT2 (SlSGT2-ox) i silenciament del gen SlSGT1 (SlSGT1-ami). Els resultats demostren que els esterols glicosilats afavoreixen la tolerància a l'estrès per fred en tomàquet. Les plantes SlSGT2-ox, amb una proporció GS/FS més gran que les plantes WT, presenten major estabilitat de la membrana i tolerància al fred, i una activació de les defenses antioxidants. Per contra, les plantes SlSGT1-ami, amb una menor proporció GS/FS, mostren més sensibilitat al fred, dany cel·lular i una reducció de la capacitat antioxidant. Les anàlisis transcriptòmiques demostren que les plantes SlSGT2-ox tenen preactivats programes de resposta a estrès en condicions basals, afavorint una resposta més eficaç davant del fred, mentre que les plantes SlSGT1-ami presenten menor capacitat d'activació d'aquesta resposta. A més, les plantes SlSGT2-ox acumulen nivells elevats de jasmonats (JA) tant en condicions basals com sota estrès, que indueixen l'expressió de gens de resposta al fred, incloent els que codifiquen components de la via CBF-COR, enzims antioxidants i de la biosíntesi de poliamines. Les llavors SlSGT2-ox, que presenten també un elevat contingut d'esterols glicosilats, mostren un fenotip de germinació avançada, sense que la taxa de germinació final es vegi afectada, associat a nivells augmentats de giberelina activa (GA₄) i disminuits d'àcid abscísic (ABA) i indolacètic (IAA). La inhibició farmacològica de la biosíntesi de GA confirma que aquest fenotip depèn d'aquesta hormona. L'anàlisi transcriptòmic de llavors seques i embegudes va revelar una reprogramació de gens implicats en senyalització hormonal, regulació redox i la resposta a estrès, amb sobreexpressió de gens relacionats amb modificacions de la paret cel·lular durant la imbibició, cosa que pot facilitar l'emergència de la radícula. Les plantes SlSGT1-ami, a diferència de les SlSGT2-ox, presenten un fenotip de nanisme en condicions normals. L'anàlisi de plantes SlSGT1-ami portadores del gen reporter de sensibilitat a l'auxina DR5::GUS ha revelat que, tot i que els nivells d'auxina no varien, l'activitat GUS disminueix fins i tot després de l'aplicació exògena d'auxina, cosa que indica una percepció deficient d'aquesta hormona. La reducció de la mida cel·lular observada en analisis histoquímiques suggereix que la deficiència d'esterols glicosilats limita l'expansió cel·lular i el creixement mediat per auxines, independentment de la seva biosíntesi. També s'ha estudiat la resistència al fong necròtrof Botrytis cinerea. Les plantes SlSGT1-ami mostren una major resistència, amb lesions més petites i menor colonització fúngica que les WT. Aquesta resistència s'acompanya d'un increment dels nivells d'àcid salicílic (SA) i flavonoides com el kaempferol i l'herbacetina, juntament amb una disminució d'ABA durant la infecció, suggerint un reajustament hormonal que afavoreix la defensa. En conjunt, els resultats aquest estudi demostren que els esterols glicosilats tenen un paper crucial en el desenvolupament del tomàquet i la seva capacitat de resposta a l'estrès abiòtic i biòtic, actuant a través de la modulació de rutes hormonals, l'equilibri redox i la reprogramació transcripcional.

Los fitoesteroles se encuentran en forma libre (FS) o conjugados como ésteres de esteroles (SE), esteril glucósidos (SG) y esteril glucósidos acilados (ASG). Los FS, SG y ASG son componentes estructurales de las membranas celulares que modulan sus propiedades biofísicas y sus funciones. Las esterol glicosiltransferasas (SGT) catalizan la glucosilación del grupo hidroxilo en C3 de los FS dando lugar a los SG, cuya posterior acilación origina los ASG. Las funciones y los mecanismos de acción de los esteroles glicosilados son aun bastante desconocidos. Para investigar los efectos de las alteracions del metabolismo de los esteroles glicosilados en el desarrollo de las plantas y la respuesta al estrés, en esta tesis hemos utilizado mutantes de tomate (Micro-Tom) con perfiles contrastantes de esteroles, obtenidos por sobreexpresión de SlSGT2 (SlSGT2-ox) y silenciamiento del gen SlSGT1 (SlSGT1-ami). Los resultados demuestran que los esteroles glicosilados mejoran la tolerancia al estrés por frío. Las plantas SlSGT2-ox, con una proporción GS/FS mayor que las WT, presentan mayor estabilidad de la membrana, activación de las defensas antioxidantes y mayor tolerancia al frío. En cambio, las plantas SlSGT1-ami, con una proporción GS/FS menor, muestran mayor sensibilidad al frío y daño celular, y menor capacidad antioxidante. Los análisis transcriptómicos demuestran que las plantas SlSGT2-ox preactivan programas de respuesta a estrés en condiciones basales, lo que permite una reacción más eficaz frente al frío, mientras que las plantas SlSGT1-ami presentan menor capacidad de respuesta. Además, las plantas SlSGT2-ox acumulan niveles más elevados de jasmonatos (JA) en condiciones basales y bajo estrés por frio que las plantas WT y SlSGT1-ami, lo que induce la expresión de genes de respuesta al frío, incluyendo los que codifican componentes de la vía CBF-COR, así como enzimas antioxidantes y de la biosíntesis de poliaminas. Las semillas SlSGT2-ox, que presentan también un mayor contenido de esteroles glicosilados, muestran una germinación avanzada, que no afecta la tasa de germinación final, asociada a mayores niveles de giberelina activa (GA₄) y menores de ácido abscísico (ABA) e indolacético (IAA). La inhibición de la biosíntesis de GA confirma que este fenotipo depende de dicha hormona. El anàlisis transcriptómico de semillas secas e imbibidas reveló una reprogramación de genes implicados en señalización hormonal, la regulación redox y la respuesta a estrés, y la sobreexpresión de genes relacionados con modificación de la pared celular durante la imbibición, lo que puede facilitar la emergencia de la radícula. Las plantas SlSGT1-ami, a diferencia de las SlSGT2-ox, presentan un fenotipo de enanismo en condiciones normales. El análisis de plantas SlSGT1-ami portadoras del gen reportero de auxina DR5::GUS ha revelado una disminución de la actividad GUS a pesar de que los niveles de auxina no varían. La actividad GUS no se recupera incluso tras la aplicación exógena de auxina, lo que indica una percepción deficiente de la hormona. Análisis histoquímicos evidencian La reducción del tamaño celular observada en análisis histoquímicos sugiere que la deficiencia de esteroles glicosilados limita la expansión celular y el crecimiento mediado por auxinas, independientemente de su biosíntesis. También se ha estudiado la resistencia frente al hongo necrótrofo Botrytis cinerea. Las plantas SlSGT1-ami muestran lesiones de menor tamaño y menor colonización fúngica que las WT. Esta mayor resistencia se asocia a un incremento de los niveles de ácido salicílico (SA) y flavonoides como el kaempferol y la herbacetina, y una disminución de ABA durante la infección, sugiriendo un reajuste hormonal que favorece la defensa. En conjunto, este estudio demuestra que los esteroles glicosilados desempeñan un papel crucial en el desarrollo del tomate y la capacidad de respuesta al estrés abiótico y biótico, mediante la modulación de rutas hormonales, equilibrio redox y reprogramación transcripcional.

Phytosterols occur in free form (FS) or as conjugated derivatives, including steryl esters (SE), steryl glycosides (SG), and acylated steryl glycosides (ASG). FS, SG and ASG are integral components of cell membranes, where they influence biophysical properties and hence overall function. SG are formed by glycosylation of FS at the C3 hydroxyl group via sterol glycosyltransferases (SGTs), while further acylation of the sugar moiety yields ASG. The physiological functions and mechanisms of action of glycosylated sterols and their biosynthetic enzymes still remain poorly understood. To address this knowledge gap, in this thesis we used tomato (Micro-Tom) mutants with contrasting sterol profiles, resulting from SlSGT2 overexpression (SlSGT2-ox) and SlSGT1 silencing (SlSGT1-ami), to investigate the effects of altered glycosylated sterol metabolism on plant development and responses to abiotic and biotic stress. The results reveal that glycosylated sterols contribute significantly to cold stress tolerance in tomato. SlSGT2-ox plants, which have a higher glycosylated-to-free sterol (GS/FS) ratio than WT, exhibit enhanced cold tolerance, improved membrane stability, and greater activation of oxidative stress defenses. Conversely, SlSGT1 silencing, which results in a reduced GS/FS ratio, leads to increased cold sensitivity, membrane damage, and impaired antioxidant responses. Transcriptomic analyses demonstrated that SlSGT2-ox plants exhibited pre-activation of stress-related transcriptional programs under control conditions, which facilitated a more robust response to cold stress. In contrast, SlSGT1-ami plants showed a diminished capacity to activate cold-responsive pathways. SlSGT2-ox plants also accumulated higher basal levels of jasmonates (JA) and exhibited enhanced JA biosynthesis under cold stress compared to WT and SlSGT1-ami plants. This was linked to the activation of cold-responsive genes, including components of the CBF–COR pathway, antioxidant enzymes, and genes involved in polyamine biosynthesis. Elevated glycosylated sterol content was also observed in SlSGT2-ox seeds, which showed earlier germination than WT, although final germination rates remain unchanged. This phenotype was associated with higher active gibberellin (GA₄) levels and lower levels of abscisic acid (ABA) and indolacetic acid (IAA) in dry seeds. Pharmacological inhibition of GA biosynthesis confirmed that early germination in SlSGT2-ox seeds is GA-dependent. Transcriptome profiling of dry and imbibed seeds revealed extensive reprogramming of genes related to hormone signaling, redox regulation, and stress response. Notably, imbibition induces strong upregulation of cell wall-modifying genes, likely facilitating radicle emergence. The SlSGT1-ami plants, in contrast to the normal phenotype of SlSGT2-ox plants, displayed a clear dwarfism under normal growth conditions. To further explore this issue, SlSGT1-ami plants were crossed with auxin-responsive DR5::GUS reporter lines. Although auxin levels remained unchanged, the hybrids showed significantly reduced GUS activity, even after exogenous auxin application, indicating impaired auxin perception. Histochemical analyses revealed reduced cell size in SlSGT1-ami tissues, suggesting that glycosylated sterol deficiency limits cell expansion and disrupts auxin-mediated growth, independent of auxin biosynthesis. In addition to abiotic stress responses, we assessed resistance to the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. SlSGT1-ami plants exhibited enhanced resistance, with smaller lesion sizes and reduced fungal colonization than WT. This resistance was correlated with increased salicylic acid (SA) accumulation, and higher levels of flavonoids such as kaempferol and herbacetin, which are known to contribute to defense. Furthermore, ABA levels decreased during infection in SlSGT1-ami lines compared to WT, supporting a shift in hormonal balance that favors resistance. Overall, this study demonstrates that glycosylated sterols modulate tomato development and adaptation to abiotic and biotic stress via hormonal regulation, redox balance, and transcriptional reprogramming.