Factores moleculares que influyen en la fluorescencia intraoperatoria del ácido 5-aminolevulínico en gliomas malignos y su significado diagnóstico

Abstract

[spa] Introducción: El glioma maligno es el tumor cerebral primario maligno más frecuente. La esperanza de vida es de 14 meses. Para lograr una resección total se emplean la fluorescencia intraoperatoria por el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). La fluorescencia presenta una gran variabilidad en el tejido tumoral, postulándose diferentes razones para ello.

Contenido de la investigación: Comparamos la intensidad de fluorescencia en cultivos de líneas de glioma. Se emplearon dos presentaciones de 5-ALA para comparar la intensidad de fluorescencia de cada una. Se analizó la fluorescencia producida en muestras tumorales de pacientes. Para cuantificar la fluorescencia se empleó microscopia de fluorescencia invertida. En las muestras tumorales se analizaron factores moleculares por medio de inmunohistoquímica, siendo estos la mutación de IDH-1, la expresión de ATRX y p53, índice de proliferación celular Ki67. Se analizó la presencia de hipermetilación del promotor del gen MGMT por medio de pirosecuenciación. Se comparó la intensidad de la fluorescencia con cada una de las características moleculares analizadas. Se realizó un análisis de sobrevida en relación con la intensidad de fluorescencia y los factores moleculares analizados.

Para comprobar los resultados obtenidos se realizó un análisis de reducción de dimensionalidad empleando la base de datos sobre la expresión génica en gliomas malignos del “Cancer Genome Atlas”. Se incluyeron 23 genes identificados en la literatura como responsables de favorecer o impedir la fluorescencia emitida por 5-ALA. Se investigó la probabilidad de presentar o no fluorescencia según la presencia de mutación de IDH-1 y la metilación del promotor del gen del MGMT, y por grupos moleculares de glioma de alto grado (clásico, mesenquimal y proneural). Con la información de la base de datos se comparó la sobrevida en las poblaciones de alta y baja probabilidad de fluorescencia.

La comparación de la fluorescencia emitida tras administrar la sustancia comercial y la sustancia producida en el hospital mostró que ambas sustancias producen una fluorescencia equivalente. En las líneas celulares se observó una diferencia de intensidad de la fluorescencia, siendo mayor en las líneas U87MG y T98G, y menor en la línea LN229. La fluorescencia no fue diferente entre las muestras con y sin mutación de IDH-1, TP53, ATRX, tampoco en aquellas con y sin hipermetilación del promotor del MGMT. No hubo diferencias en muestras con mayor o menor índice de proliferación celular. En el análisis de reducción de dimensionalidad el subtipo proneural presentó una menor probabilidad de fluorescencia por el perfil genético. En el análisis de sobrevida no hubo diferencia significativa entre los pacientes con mayor y menor fluorescencia. Este resultado se corroboró al hacer el análisis de la base del “Glioblastoma Atlas Project".

Estudios previos han buscado factores moleculares asociados a la intensidad de fluorescencia. La mutación de IDH-1 en gliomas grado III y un elevado índice de proliferación celular en tumores de grado II y III se han asociado a mayor fluorescencia, siendo estos estudios de tipo cualitativos. En este estudio no se observó diferencia en la cuantificación de la fluorescencia con relación a estos factores ni con la presencia de mutación de ATRX, TP53 o el estado de metilación del MGTM. No hay estudios previos de sobrevida según la fluorescencia con 5-ALA en gliomas de alto grado. En este estudio no se observó una diferencia en la sobrevida según la intensidad de fluorescencia, teniendo un tiempo medio de sobrevida mayor aquellos con mayor fluorescencia.

Conclusión: La intensidad de la fluorescencia está condicionada por diversos factores tanto intrínsecos como extrínsecos al tumor. Aquellos factores que afectan el estado metabólico tumoral y que pueden intervenir en el metabolismo de las porfirinas tienen una mayor importancia sin que parezca condicionada por las mutaciones analizadas.

[cat] Introducció: El glioma maligne és el tumor maligne cerebral primari més freqüent. L´esperança de vida és de 14 mesos. La resecció quirúrgica total afavoreix un millor pronòstic, per la qual cosa s'utilitzen adjuvants quirúrgic, entre els quals hi ha la fluorescència intraoperatòria amb l'àcid 5-aminolevulínic. La fluorescència produïda és variable en el teixit tumoral, raó per la qual es postulen diferents motius de la variabilitat. Contingut de la investigació: En aquest estudi observem diferències en la intensitat de fluorescència en cultius cel·lulars emprant dues presentacions de 5-ALA amb fluorescència comparable, fent posteriorment l'anàlisi de la fluorescència en mostres tumorals de pacients. Per a l'anàlisi de fluorescència es va emprar microscopia de fluorescència invertida, quantificant la fluorescència a la mostra. Es van analitzar factors moleculars de les mostres per immunohistoquímica, i aquests són la mutació IDH-1, l'expressió e ATRX i p53, així com l'índex de proliferació cel·lular Ki67. Per piroseqüenciació es va analitzar la hipermetilació del promotor de MGMT. S'hi va comparar la presència d'aquestes mutacions amb intensitat de fluorescència. Es va fer l'anàlisi de sobrevida amb relació a la intensitat de fluorescència i als factors moleculars analitzats. Per a comprovar els resultats es va fer una anàlisi de reducció de dimensionalitat usant la base de dades d'expressió gènica en gliomes malignes del “Cancer Genome Atlas”, incloent-hi 23 gens que s'han identificat com a responsables de la fluorescència per 5-ALA afavorint o disminuint la seva intensitat. S'ha analitzat la probabilitat de presentar alta o baixa fluorescència segons la presència de mutació d'IDH i la metilació del MGMT, i per a grups moleculars de glioma d'alt grau (clàssic, mesenquimal i proneural). Es va comparar la sobrevida a les poblacions d'alta i baixa probabilitat de fluorescència. La comparació inicial de la fluorescència emesa després d'administrar la substància comercial i la substància produïda a l'hospital va mostrar l'equivalència d'ambdues substàncies, observant una diferència d'intensitat entre les línies cel·lulars emprades, sent més gran a les línies U87MG i T98G, i de menor intensitat a la línia LN229. En l'anàlisi de fluorescència en mostres de pacients la intensitat de fluorescència no va ser diferent entre les mostres amb i sense mutació d'IDH-1, TP53, ATRX, tampoc en aquelles amb i sense hipermetilació del promotor del MGMT. No hi va haver diferències en intensitat de fluorescència en mostres amb més o menys índex de proliferació cel·lular. A l'anàlisi de reducció de dimensionalitat el subtipus proneural va presentar una menor probabilitat de fluorescència pel perfil genètic. A l'anàlisi de supervivència dels pacients inclosos no va ser diferent entre els pacients amb major i menor intensitat de fluorescència, observant el mateix resultat en analitzar la base del “Glioblastoma Atlas Project". Estudis previs han buscat factors moleculars associats a la intensitat de fluorescència, trobant en els gliomes de grau III la mutació d'IDH-1 i en els de grau II i III un elevat índex de proliferació cel·lular com a factors associats a la fluorescència, sent aquests estudis només qualitatius . En aquest estudi no es va observar cap diferència en fluorescència amb relació a aquests factors ni amb la presència de mutació d'ATRX, TP53 o l'estat de metilació del MGTM. No hi ha estudis previs de supervivència segons la fluorescència amb 5-ALA en gliomes d'alt grau. En aquest estudi no es va observar una diferència en la sobrevida segons la intensitat de fluorescència, tenint un temps mitjà de sobrevida més gran aquells amb més fluorescència. Conclusio: La diferència en la fluorescència està condicionada per diversos factors, i és més important l'afectació en el metabolisme tumoral que modifiqui el metabolisme de les porfirines, sense que sembli condicionat per les mutacions analitzades.

[eng] Introduction: Malignant glioma is the most common primary malignant brain tumor. Life expectancy with current treatment is 14 months. Total surgical resection favors a better prognosis. Surgical adjuvants, such as intraoperative fluorescence produced by 5-aminolevulinic acid (5-ALA), are used to achieve a total resection. The fluorescence produced by 5-ALA shows great variability in tumor tissue, and different reasons for this have been postulated. Content of the investigation: In this study we compared the fluorescence intensity in cultures of different glioma lines. Two presentations of 5-ALA were used to compare the fluorescence intensity of each. In a second phase of the study, the fluorescence produced in tumor samples from patients was analyzed. Inverted fluorescence microscopy was used to quantify the fluorescence. Molecular factors in tumor samples were analyzed by immunohistochemistry, including IDH-1 mutation, ATRX and p53 expression, as well as the Ki67 cell proliferation index. The presence of MGMT gene promoter hypermethylation was analyzed by pyrosequencing. Fluorescence intensity was compared with each of the molecular characteristics analyzed. Survival analysis was performed in relation to fluorescence intensity and the molecular factors analyzed. To verify the results obtained, a dimensionality reduction analysis was performed using the ‘Cancer Genome Atlas’ database on gene expression in malignant gliomas. Twenty-three genes identified in the literature as being responsible for promoting or impeding the fluorescence emitted by 5-ALA were included. By means of this analysis, the probability of presenting or not fluorescence was investigated according to the presence of IDH-1 mutation and MGMT gene promoter methylation, and by molecular groups of high-grade glioma (classical, mesenchymal and proneural). Using information from the database, survival was compared in the high- and low-fluorescence populations. Comparison of the fluorescence emitted after administration of the commercial substance and the substance produced in the 5-ALA hospital showed that both substances produce equivalent fluorescence. A difference in fluorescence intensity was observed in the cell lines, being higher in the U87MG and T98G lines, and lower in the LN229 line. In the fluorescence analysis in malignant glioma patients, the fluorescence intensity was not different between samples with and without mutation of IDH-1, TP53, ATRX, nor in those with and without hypermethylation of the MGMT promoter. There was no difference in fluorescence intensity in samples with higher or lower cell proliferation index. In the dimensionality reduction analysis, the proneural subtype showed a lower probability of fluorescence by genetic profiling. In the survival analysis there was no significant difference between patients with higher and lower fluorescence. This result was corroborated by analysis of the “Glioblastoma Atlas Project” database. Previous studies have looked for molecular factors associated with fluorescence intensity. The presence of IDH-1 mutation in grade III gliomas and a high cell proliferation index in grade II and III tumors have been associated with increased fluorescence, these studies being qualitative. In this study, no difference in fluorescence quantification was observed in relation to these factors or to the presence of ATRX mutation, TP53 or MGTM methylation status. There are no previous studies of survival based on 5-ALA fluorescence in high-grade gliomas. In this study, no difference in survival was observed according to fluorescence intensity, with those with higher fluorescence having a longer median survival time. Conclusion: The intensity of 5-ALA fluorescence is conditioned by several factors both intrinsic and extrinsic to the tumor. Those factors that affect the metabolic state of the tumor and that may intervene in the metabolism of porphyrins are of greater importance without appearing to be conditioned by the mutations analyzed.