Engineering zirconia surfaces with cell instructive and antibacterial properties

Abstract

(English) Tetragonal zirconia polycrystals stabilized with 3 mol% yttria (3Y-TZP) has gained growing interest as an alternative to titanium for dental implants, owing to its excellent biocompatibility, high mechanical strength and corrosion resistance and superior aesthetics. Despite these advantages, the clinical performance of zirconia implants still depends on their ability to promote osseointegration while simultaneously minimizing the risk of bacterial colonization, a competitive process known as "race for the surface". Surface properties of dental implants, such as topography, chemistry, and wettability, critically influence the biological response at the tissue-implant interface. In particular, micro- and nanotopographies directly impact cell-material interaction and can modulate several cellular functions including adhesion, migration, proliferation, and differentiation. Similarly, these topographical features affect bacterial response, either promoting bacterial adhesion or, conversely, reducing colonization through antifouling or bactericidal effects. For this reason, surface modifications have become a widely explored strategy to enhance the biological performance of implants. Nevertheless, the major challenge lies in designing surfaces that simultaneously support osseointegration while also preventing bacterial adhesion. This PhD Thesis addressed this challenge by investigating different surface modification approaches to improve the biological performance of zirconia. The aim was to create topographies that simultaneously improve cell behavior while exhibiting antibacterial properties. In concrete, we developed and characterized a series of micro and nanostructured zirconia surfaces and evaluated their biological performance both in terms of human mesenchymal stem cell (hMSC) response and bacterial adhesion of different strains. Prior to experimental work, a comprehensive bibliographic review on topographical modification strategies for 3Y-TZP was conducted (Chapter I), highlighting existing knowledge gaps and guiding the selection of surface treatments. Following this, different surface modification techniques were employed, including hydrofluoric acid (HF) etching for generating nanotopography (Chapter II) and laser patterning via nanosecond (ns-) and femtosecond (fs-) laser to create defined microstructures (Chapter III). These techniques were also combined to evaluate a potential synergistic effect of hierarchically rough micro- and nanotopographies on the biological response (Annex I). Our findings demonstrate both chemical etching and laser patterning techniques successfully enhanced the biological performance of zirconia by improving the hMSCS behavior and reducing bacterial adhesion. However, their combination did not result in a synergistic improvement. Among all the surfaces, the 3 μm linear pattern (L3) created through fs-laser patterning offered the best balance by simultaneously enhancing hMSC adhesion, migration, and osteogenic differentiation, while significantly reducing the adhesion of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa bacteria. It also led to the most favorable biological outcome under competitive co-culture conditions. Furthermore, biofunctionalization of this topography using a multifunctional peptide containing both antimicrobial and cell-adhesive sequences showed promising synergistic biological effects (Annex II). Importantly, these improvements were achieved without compromising the mechanical integrity of the L3-patterned surface (Annex III). In conclusion, this PhD Thesis demonstrated that topographical modification of zirconia offers promising strategies for developing zirconia implant with improved biological performance, enhancing both osseointegration and antibacterial properties. Future directions should focus on integrating biochemical cues, in vivo validations, and complete assessment of the mechanical integrity.

(Català) La zircona policristal·lina tetragonal dopada amb un 3% d’itria (3Y-TZP) s’ha convertit en una alternativa prometedora al titani per als implants dentals, gràcies a la seva excel·lent biocompatibilitat, alta resistència mecànica, resistència a la corrosió i bones propietats estètiques. Malgrat aquests avantatges, l’èxit clínic dels implants de zirconi encara depèn de la seva capacitat per afavorir l’osteointegració, minimitzant alhora el risc de colonització bacteriana, un procés competitiu conegut com a “race for the surface”. Les propietats superficials dels implants dentals, com la topografia, influeixen críticament en la resposta biològica a la interfície teixit-implant. En particular, les micro- i nanotopografies impacten directament en la interacció entre les cèl·lules i el material, i poden modular diverses funcions cel·lulars com l’adhesió, la migració, la proliferació i la diferenciació. Igualment, aquestes característiques topogràfiques també afecten la resposta bacteriana, afavorint o reduint la colonització mitjançant efectes antifouling o bactericides. Per aquest motiu, les modificacions superficials s’han convertit en una estratègia àmpliament explorada per millorar el rendiment biològic dels implants. No obstant això, el repte continua sent dissenyar superfícies que puguin afavorir alhora la osteointegració i evitar l’adhesió bacteriana. Aquesta tesi doctoral ha abordat aquest repte investigant diferents estratègies de modificació superficial per millorar el comportament biològic dels implants dentals de 3Y-TZP. L’objectiu ha estat crear topografies capaces de millorar simultàniament el comportament cel·lular i presentar propietats antibacterianes. Concretament, es van desenvolupar i caracteritzar diverses superfícies de zircona micro- i nanostructurades, i es va avaluar el seu comportament biològic tant en termes de resposta de cèl·lules mare mesenquimals humanes (hMSCs) com de l’adhesió bacteriana. Prèviament al treball experimental, es va dur a terme una revisió bibliogràfica exhaustiva sobre les estratègies de modificació topogràfica de 3Y-TZP (Capítol I), que va permetre identificar mancances i orientar la selecció dels tractaments superficials. A continuació, es van aplicar diferents tècniques de modificació, incloent l’atac amb àcid fluorhídric (HF) per generar nanotopografies (Capítol II) i el gravat làser amb làser de nanosegons (ns-) i femtosegons (fs-) per obtenir microestructures definides (Capítol III). També es van combinar aquestes tècniques per avaluar un possible efecte sinèrgic de les topografies jeràrquicament rugoses (Annex I). Els resultats obtinguts demostren que tant l’atac químic com el gravat làser van millorar amb èxit el comportament biològic de la zircona, millorant el comportament cel·lular i reduint l’adhesió bacteriana. No obstant això, la seva combinació no va produir una millora sinèrgica. Entre totes les superfícies analitzades, el patró lineal de 3 μm (L3), creat mitjançant làser de femtosegons, va oferir el millor balanç, millorant simultàniament l’adhesió, la migració i la diferenciació osteogènica de les hMSC, alhora que va reduir significativament l’adhesió de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa. També va conduir al millor resultat biològic en condicions de co-cultiu competitiu. A més, la biofuncionalització d’aquesta topografia amb un pèptid multifuncional amb propietats antimicrobianes i d’adhesió cel·lular va mostrar efectes sinèrgics prometedors (Annex II). Aquestes millores es van aconseguir sense comprometre la integritat mecànica de la superfície (Annex III). En conclusió, aquesta tesi doctoral ha demostrat que la modificació topogràfica de zircona ofereix estratègies prometedores per al desenvolupament d’implants amb un rendiment biològic millorat, afavorint tant la osteointegració com la resposta antibacteriana. Futures investigacions haurien d’incloure la integració de senyals bioquímiques, validació in vivo i anàlisi de la integritat mecànica.

(Español) La circona policristalina estabilizada con el 3% mol de yttria (3YTZP) ha generado un creciente interés como alternativa al titanio para los implantes dentales, gracias a su excelente biocompatibilidad, alta resistencia mecánica, resistencia a la corrosión y ventrajas estéticas. A pesar de esto, el éxito clínico de los implantes sigue dependiendo de su capacidad para favorecer simultáneamente la osteointegración y minimizar la colonización bacteriana, un proceso competitivo conocido como ““race for the surface”. Las propiedades superficiales de los implantes, como la topografía, influyen en la respuesta biológica en la interfaz tejido-implante. En particular, las micro- y nanotopografías impactan directamente en la interacción entre las células y el material, pudiendo modular funciones celulares clave como la adhesión, migración, proliferación y diferenciación. Estas características topográficas también afectan la respuesta bacteriana, favoreciendo o reduciendo la colonización mediante efectos antifouling o bactericidas. Por ello, las modificaciones superficiales se han convertido en una estrategia ampliamente explorada para mejorar el rendimiento biológico de los implantes. No obstante, el principal reto sigue siendo diseñar superficies que favorezcan simultáneamente la osteointegración y eviten la adhesión bacteriana. Esta tesis doctoral aborda este reto investigando distintas estrategias de modificación superficial para mejorar el comportamiento biológico de la circona. El objetivo fue crear topografías capaces de mejorar simultáneamente el comportamiento celular y presentar propiedades antibacterianas. En concreto, se crearon y caracterizaron distintas superficies micro- y nanoestructuradas, y se evaluó su comportamiento biológico en términos de la respuesta de células madre mesenquimales humanas (hMSC) y de la adhesión bacteriana de distintas cepas. Previo al trabajo experimental, se realizó una revisión bibliográfica exhaustiva sobre estrategias de modificación topográfica de 3Y-TZP (Capítulo I), con el fin de identificar áreas poco exploradas y seleccionar las técnicas con mayor potencial. A continuación, se aplicaron diferentes técnicas de modificación, incluyendo el ataque con ácido fluorhídrico (HF) para generar nanotopografías (Capítulo II) y el grabado con láser de nanosegundos (ns-) y femtosegundos (fs-) para obtener microestructuras definidas (Capítulo III). También se combinaron estas técnicas para evaluar un posible efecto sinérgico de las topografías jerárquicamente rugosas en la respuesta biológica (Anexo I). Los resultados demostraron que tanto el ataque químico como el grabado láser mejoraron exitosamente el rendimiento biológico de la circona, favoreciendo el comportamiento de las hMSC y reduciendo la adhesión bacteriana. Sin embargo, su combinación no generó un efecto sinérgico. Entre todas las superficies analizadas, el patrón lineal de 3 μm (L3), creado mediante grabado con láser fs-, ofreció el mejor equilibrio, mejorando simultáneamente la adhesión, migración y diferenciación osteogénica de las hMSC, al tiempo que redujo significativamente la adhesión de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Además, este patrón dio lugar al resultado biológico más favorable en condiciones de co-cultivo competitivo. Asimismo, la biofuncionalización de dicha topografía con un péptido multifuncional con secuencias antimicrobianas y de adhesión celular mostró efectos biológicos sinérgicos prometedores (Anexo II). Es importante destacar que estas mejoras se lograron sin comprometer la integridad mecánica de la superficie (Anexo III). En conclusión, esta tesis demuestra que la modificación topográfica de la circona es una estrategia prometedora para mejorar su comportamiento biológico, promoviendo la osteointegración y limitando la adhesión bacteriana. Las investigaciones futuras deberían centrarse en integrar señales bioquímicas, realizar validaciones in vivo y evaluar de forma completa la integridad mecánica.