Evaluation of LSD1 and BET proteins as epigenetic targets to promote neuroprotection and regeneration after spinal cord injury

Abstract

La lesió medul·lar (LM) és una greu afecció neurològica que causa disfuncions sensorials, motores i autonòmiques permanents. El trauma inicial desencadena diversos mecanismes de lesió secundària, com la neuroinflamació, la desmielinització, la formació de cicatrius glials i la mort cel·lular secundària. Aquests processos agreugen el dany i limiten la capacitat regenerativa de la medul·la espinal, convertint-se en dianes potencials per al desenvolupament de tractaments eficaços per a la LM. Cada cop hi ha més evidències que posen de manifest el paper clau de les modificacions epigenètiques en la regulació d’aquestes respostes fisiopatològiques. En aquesta tesi, ens proposem investigar el potencial terapèutic de dirigir-nos a dos reguladors epigenètics: la desmetilasa d’histones LSD1 i les proteïnes lectores d’histones acetilades BET.

Basant-nos en estudis previs que relacionen la inhibició de LSD1 amb efectes neuroprotectors, antiinflamatoris i una major plasticitat, vam avaluar l’eficàcia de RN-1, un inhibidor selectiu de LSD1, en un model murí de contusió medul·lar. Les anàlisis transcriptòmiques espacials van revelar que la inhibició de LSD1 modula l'expressió gènica neuronal després de la LM, provocant una reducció de les vies relacionades amb el cicle cel·lular i l’excitotoxicitat, i promovent un estat neuronal immadur induït tant per la lesió com per la intervenció farmacològica. Funcionalment, la inhibició de LSD1 va millorar la recuperació funcional, va afavorir la supervivència neuronal, va preservar el teixit mielinitzat, va reduir l’astrogliosi i va potenciar la regeneració axonal. Per aprofundir en la regulació específica per tipus cel·lular de LSD1, vam desenvolupar una eina d’edició epigenètica basada en CRISPR-dCas9-DNMT3A/DNMT3L per a la metilació dirigida. Amb aquest sistema, vam aconseguir silenciar el gen Kdm1a, que codifica LSD1, mitjançant la metilació específica del seu promotor, establint les bases per a futurs estudis i possibles aplicacions terapèutiques enfocades a la repressió selectiva de LSD1.

També vam abordar el potencial terapèutic de la inhibició de les proteïnes BET, conegudes per modular la neuroinflamació i afavorir la recuperació funcional després de la LM. No obstant això, la inhibició sistèmica de BET sovint comporta efectes adversos no desitjats, com la reducció del creixement de neurites. Per aquest motiu, vam utilitzar làmines d’òxid de grafè (GO) per administrar l’inhibidor de proteïnes BET, JQ1, específicament als macròfags i la microglia al lloc de la lesió. Aquesta estratègia d’administració dirigida va millorar significativament els resultats funcionals, amb el grup tractat amb GO:JQ1 superant tots els altres grups.

En conjunt, els nostres resultats donen suport al potencial terapèutic de la modulació epigenètica per al tractament de la LM. A més, demostrem la viabilitat de diferents estratègies dirigides per modular l’expressió gènica en tipus cel·lulars específics, per tal d’augmentar l’eficàcia i l’especificitat de les teràpies epigenètiques, minimitzant els efectes no desitjats i maximitzant la recuperació funcional.

La lesión medular (LM) es una grave afección neurológica que provoca disfunción sensorial, motora y autonómica permanente. El trauma inicial desencadena diversos mecanismos de daño secundario, entre ellos la neuroinflamación, la desmielinización, la formación de cicatrices gliales y la muerte celular secundaria. Estos procesos agravan el daño y limitan la capacidad regenerativa de la médula espinal, representando así posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de tratamientos eficaces para la LM. Cada vez hay más evidencias que destacan el papel fundamental de las modificaciones epigenéticas en la regulación de estas respuestas fisiopatológicas. En esta tesis, nos proponemos investigar el potencial terapéutico de dirigirse a dos reguladores epigenéticos: la demetilasa de histonas LSD1 y las proteínas BET, “lectoras” de residuos acetilados de histonas. Basándonos en estudios previos que relacionan la inhibición de LSD1 con efectos neuroprotectores, antiinflamatorios y un aumento de la plasticidad, evaluamos la eficacia de RN-1, un inhibidor selectivo de LSD1, en un modelo murino de contusión medular. Los análisis transcriptómicos espaciales revelaron que la inhibición de LSD1 modula la expresión génica neuronal tras la LM, dando lugar a una disminución de las vías relacionadas con el ciclo celular y la excitotoxicidad, y promoviendo un estado neuronal inmaduro inducido tanto por la lesión como por la intervención farmacológica. Funcionalmente, la inhibición de LSD1 mejoró la recuperación funcional, favoreció la supervivencia neuronal, preservó el tejido mielinizado, redujo la astrogliosis y potenció la regeneración axonal. Para explorar con mayor profundidad la regulación específica por tipos celulares de LSD1, desarrollamos una herramienta de edición epigenética basada en CRISPR-dCas9-DNMT3A/DNMT3L para la metilación dirigida. Usando este sistema, conseguimos silenciar el gen Kdm1a, que codifica LSD1, mediante la metilación específica de su promotor, sentando las bases para futuros estudios y posibles aplicaciones terapéuticas orientadas a la represión selectiva de LSD1. También abordamos el potencial terapéutico de la inhibición de las proteínas BET, conocidas por modular la neuroinflamación y favorecer la recuperación funcional tras una LM. Sin embargo, la inhibición sistémica de BET suele conllevar efectos adversos no deseados, como la reducción del crecimiento de neuritas. Por ello, utilizamos láminas de óxido de grafeno (GO) para administrar el inhibidor de proteínas BET, JQ1, específicamente a macrófagos y microglía en el sitio de la lesión. Esta estrategia de administración dirigida mejoró significativamente los resultados funcionales, siendo el grupo tratado con GO:JQ1 el que mostró los mejores resultados en comparación con todos los demás. En conjunto, nuestros resultados respaldan el potencial terapéutico de la modulación epigenética para el tratamiento de la LM. Además, demostramos la viabilidad de diferentes estrategias dirigidas para modular la expresión génica en tipos celulares específicos, con el objetivo de aumentar la eficacia y especificidad de las terapias epigenéticas, minimizando los efectos secundarios y maximizando la recuperación funcional.

Spinal cord injury (SCI) is a severe neurological condition that causes permanent sensory, motor and autonomic dysfunction. The initial trauma triggers various secondary injury mechanisms, including neuroinflammation, demyelination, glial scar formation and secondary cell death. These secondary processes exacerbate the damage and limit the spinal cord’s regenerative capacity, thereby representing potential targets for the development of effective therapies for SCI. Increasing evidence highlights the pivotal role of epigenetic modifications in regulating these pathophysiological responses. In this thesis, we aim to investigate the therapeutic potential of targeting two epigenetic regulators: the histone demethylase LSD1 and the acetylated histone readers BET proteins. Based on previous findings linking LSD1 inhibition to neuroprotection, anti-inflammatory effects, and enhanced plasticity, we assessed the efficacy of RN-1, a selective LSD1 inhibitor, in a murine contusion model of SCI. Spatial transcriptomic analyses revealed that LSD1 inhibition modulates neuronal gene expression following SCI, resulting in a downregulation pathways related to cell cycle and excitotoxicity, and promoted an immature neuronal state induced by both the injury and the pharmacological intervention. Functionally, LSD1 inhibition improved functional recovery, enhanced neuronal survival, preserved myelinated tissue, reduced astrogliosis and enhanced axonal regeneration. To further explore cell-type-specific regulation by LSD1, we developed a CRIPSR-dCas9-DNMT3A/DNMT3l-based epigenetic editing tool for targeted methylation. Using this system, we successfully silenced Kdm1a, which encodes LSD1, via promoter-specific methylation, laying the groundwork for future studies and potential therapeutic applications aimed at selective LSD1 repression We also addressed the therapeutic potential of inhibiting BET proteins, known to modulate neuroinflammation and promote functional recovery after SCI. However, systemic BET inhibition often leads to undesirable off-target effects, including reduced neurite outgrowth. Therefore, we used Graphene Oxide (GO) nanosheets to deliver the BET protein inhibitor JQ1 specifically to macrophages and microglia at the injury site. This targeted delivery strategy significantly enhanced functional outcomes, with the GO:JQ1-treated group outperforming all other groups.