Development of new protein nanoconjugation strategies to improve enzyme replacement therapy

Abstract

En les últimes dècades, la teràpia de reemplaçament enzimàtic (TRE) ha revolucionat el tractament dels pacients amb malalties per dipòsit lisosòmal (LSD). La malaltia de Gaucher (MG), un trastorn causat per mutacions en el gen GBA1 que codifica l'enzim β-glucocerebrosidasa (GBA), és l'LSD més comú. La infusió intravenosa de GBA funcional en pacients amb MG reverteix la majoria de les manifestacions viscerals de la malaltia. No obstant això, existeixen importants inconvenients associats a la TRE, com l'escassa estabilitat i la inactivació de l'enzim durant el seu transport pel torrent sanguini. Això limita la biodistribució i el potencial terapèutic de la TRE, que ha demostrat ser ineficaç en el tractament de la malaltia òssia. A més, la incapacitat de la GBA per a travessar la barrera hematoencefàlica (BHE) fa que aquesta teràpia sigui ineficaç per a tractar les manifestacions neurològiques de la MG.

Per això, és necessari desenvolupar estratègies de TRE millorades i TRE dirigides al cervell amb GBA. De fet, la penetració cerebral en el cas específic de GBA, no sols obre la possibilitat de tractar la MG neuropàtica, sinó que també permet el possible tractament de la malaltia de Parkinson (MP). La clara associació genètica del gen GBA1 amb la MP com a factor de risc que afecta l'edat d'inici i a la patogenicitat de la malaltia representa una oportunitat per al tractament de la MP. A més, la proporcionalitat inversa entre l'activitat enzimàtica de GBA i els nivells de Syn i agregació proporcionen una oportunitat de tractament modificador del mecanisme de la malaltia.

La nanotecnologia ofereix poderoses eines per a superar les limitacions de la terapèutica proteica, particularment a través dels sistemes d'administració de fàrmacs que protegeixen els enzims de la degradació i milloren la seva biodisponibilitat. Entre ells, la conjugació proteïna-polímer s'ha revelat com una estratègia capdavantera que millora l'estabilitat i farmacocinètica de les proteïnes. Encara que la Pegilació ha dominat aquest camp, la preocupació per la no biodegradabilitat i la immunogenicitat del PEG han suscitat l'interès per altres alternatives. El poli (àcid α-L-glutàmic) (PGA) és un polímer biodegradable, sintetitzable i de baixa immunogenicitat, la qual cosa ho converteix en un candidat atractiu i adaptable per als conjugats proteïna-polímer de pròxima generació.

En aquesta tesi, proposem un mètode per a la conjugació de GBA recombinant amb el polímer PGA utilitzant diferents tècniques de conjugació. Els conjugats GBA-PGA se sintetitzen eficaçment, es caracteritzen fisicoquímicamente i s'avaluen in vitro en models cel·lulars GBA Knock-Out.

En aquesta tesi s'ha demostrat la seva eficàcia in vivo com TRE millorada per al tractament de la MG visceral mitjançant l'administració intravenosa comparativa de conjugats de GBA i GBA-PGA en animals model de ratolí amb MG. Els conjugats GBA-PGA administrats per via intravenosa confereixen un tractament nou per a la MG amb capacitat per a abordar les manifestacions òssies de la malaltia. No obstant això, els conjugats GBA-PGA administrats per via intravenosa no travessen la BHE.

En aquesta tesi s'ha avaluat a fons l'administració de fàrmacs via intranasal cap al cervell com a via alternativa d'administració que evita la BHE. Unes modificacions mínimes del polímer PGA van conferir als conjugats GBA-PGA propietats de mucoadhesión i capacitat d'administració cerebral a través de la via olfactòria, seguint potencialment el transport interneuronal al bulb olfactori. Malgrat els nostres esforços, quantitats mínimes de conjugats GBA-PGA van aconseguir el compartiment cerebral seguint aquesta estratègia a causa de diversos mecanismes de defensa dels organismes tractats, incloent-hi el desacoblament GBA-PGA, la retallada PGA i esdeveniments inmunomediados. S'estan duent a terme noves optimitzacions per a resoldre aquests múltiples problemes i aconseguir una administració cerebral eficaç dels conjugats GBA-PGA.

En las últimas décadas, la terapia de reemplazo enzimático (TRE) ha revolucionado el tratamiento de los pacientes con enfermedades por depósito lisosomal (LSD). La enfermedad de Gaucher (EG), un trastorno causado por mutaciones en el gen GBA1 que codifica la enzima β-glucocerebrosidasa (GBA), es la LSD más común. La infusión intravenosa de GBA funcional en pacientes con EG revierte la mayoría de las manifestaciones viscerales de la enfermedad. Sin embargo, existen importantes inconvenientes asociados a la TRE, como la escasa estabilidad y la inactivación de la enzima durante su transporte por el torrente sanguíneo. Esto limita la biodistribución y el potencial terapéutico de la TRE, que ha demostrado ser ineficaz en el tratamiento de la enfermedad ósea. Además, la incapacidad de la GBA para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) hace que esta terapia sea ineficaz para tratar las manifestaciones neurológicas de la EG.

Por ello, es necesario desarrollar estrategias de TRE mejoradas y TRE dirigidas al cerebro con GBA. De hecho, la penetración cerebral en el caso específico de GBA, no sólo abre la posibilidad de tratar la EG neuropática, sino que también permite el posible tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP). La clara asociación genética del gen GBA1 con la EP como factor de riesgo que afecta a la edad de inicio y a la patogenicidad de la enfermedad representa una oportunidad para el tratamiento de la EP. Además, la proporcionalidad inversa entre la actividad enzimática de GBA y los niveles de Syn y agregación proporcionan una oportunidad de tratamiento modificador del mecanismo de la enfermedad.

La nanotecnología ofrece poderosas herramientas para superar las limitaciones de la terapéutica proteica, particularmente a través de los sistemas de administración de fármacos que protegen a las enzimas de la degradación y mejoran su biodisponibilidad. Entre ellos, la conjugación proteína-polímero se ha revelado como una estrategia puntera que mejora la estabilidad y farmacocinética de las proteínas. Aunque la PEGilación ha dominado este campo, la preocupación por la no biodegradabilidad y la inmunogenicidad del PEG han suscitado el interés por otras alternativas. El poli (ácido α-L-glutámico) (PGA) es un polímero biodegradable, sintetizable y de baja inmunogenicidad, lo que lo convierte en un candidato atractivo y adaptable para los conjugados proteína-polímero de próxima generación.

En esta tesis, proponemos un método para la conjugación de GBA recombinante con el polímero PGA utilizando diferentes técnicas de conjugación. Los conjugados GBA-PGA se sintetizan eficazmente, se caracterizan fisicoquímicamente y se evalúan in vitro en modelos celulares GBA Knock-Out.

En esta tesis se ha demostrado su eficacia in vivo como TRE mejorada para el tratamiento de la EG visceral mediante la administración intravenosa comparativa de conjugados de GBA y GBA-PGA en animales modelo de ratón con EG. Los conjugados GBA-PGA administrados por vía intravenosa confieren un tratamiento novedoso para la EG con capacidad para abordar las manifestaciones óseas de la enfermedad. Sin embargo, los conjugados GBA-PGA administrados por vía intravenosa no atraviesan la BHE.

En esta tesis se ha evaluado a fondo la administración de fármacos vía intranasal hacia el cerebro como vía alternativa de administración que evita la BHE. Unas modificaciones mínimas del polímero PGA confirieron a los conjugados GBA-PGA propiedades de mucoadhesión y capacidad de administración cerebral a través de la vía olfativa, siguiendo potencialmente el transporte interneuronal al bulbo olfativo. A pesar de nuestros esfuerzos, cantidades mínimas de conjugados GBA-PGA alcanzaron el compartimento cerebral siguiendo esta estrategia debido a varios mecanismos de defensa de los organismos tratados, incluyendo el desacoplamiento GBA-PGA, el recorte PGA y eventos inmunomediados. Se están llevando a cabo nuevas optimizaciones para resolver estos múltiples problemas y conseguir una administración cerebral eficaz de los conjugados GBA-PGA.

Enzyme replacement therapy (ERT) has revolutionized the management of patients with lysosomal storage disorders (LSDs) over the last few decades. Gaucher disease (GD), a disorder caused by mutations in the GBA1 gene encoding the enzyme β-glucocerebrosidase (GBA), is the most common LSD. Intravenous infusion of functional GBA into GD patients reverses most of the visceral manifestations of the disease. However, there are important drawbacks associated with ERT, such as poor stability and enzyme inactivation during transport throughout the bloodstream. This limits the biodistribution and therapeutic potential of ERT, which has been shown to be ineffective in the treatment of bone disease. Furthermore, the inability of GBA to cross the blood-brain barrier (BBB) makes this therapy ineffective for treating the neurological manifestations of GD.

For that reason, there’s a need for the development of enhanced ERT strategies and brain-targeted ERT with GBA. In fact, brain penetration in the specific case of GBA, not only opens the possibility to treat neuropathic GD, but also allows the possible treatment of Parkinson's disease (PD). The clear genetic association of GBA1 gene with PD as a risk factor affecting age of onset and disease pathogenicity represents an opportunity for PD treatment. Furthermore, the inverse proportionality between GBA enzymatic activity and Syn levels and aggregation provide a mechanistic disease modifying treatment opportunity.

Nanotechnology offers powerful tools to overcome the limitations of protein therapeutics, particularly through drug delivery systems (DDS) that protect enzymes from degradation and improve their bioavailability. Among these, protein–polymer conjugation has emerged as a leading strategy, enhancing protein stability and pharmacokinetics. While PEGylation has dominated the field, concerns over PEG’s non-biodegradability and immunogenicity have prompted interest in alternatives. Poly(α-L-glutamic acid) (PGA) is a biodegradable, synthetically tunable polymer with low immunogenicity, making it an attractive and adaptable candidate for next-generation protein–polymer conjugates.

In this thesis, we propose a method for recombinant GBA conjugation to PGA polymer using different conjugation techniques. GBA-PGA conjugates are effectively synthetized, physico-chemically characterized and in vitro evaluated in GBA Knock-Out cellular models.

Its efficacy in vivo as an enhanced ERT for visceral GD treatment has been proven in this thesis by comparative intravenous administration of GBA and GBA-PGA conjugates in GD mouse model animals. Intravenously administered GBA-PGA conjugates confer a novel treatment for GD with the capacity to address bone manifestations of the disease. However, intravenously administered GBA-PGA conjugates does not cross the BBB.

Nose-to-brain drug delivery has been thoroughly assessed in this thesis as an alternative route of administration by-passing the BBB. Minimal modifications on PGA polymer conferred to GBA-PGA conjugates mucoadhesion properties and brain targeting capacity through the olfactory pathway, potentially following intraneuronal transport to the olfactory bulb. Despite our efforts, minimal amounts of GBA-PGA conjugates reached the brain compartment following this strategy due to several defence mechanisms of the treated organisms, including GBA-PGA uncoupling, PGA trimming and immune-mediated events. Further optimization is on-going to address these multiple issues for effective brain delivery of GBA-PGA conjugates.