Herbicide resistance in Amaranthus palmeri from Spain: mechanisms, evolution, and biochemical insights

Abstract

La resistència als herbicides inhibidors de l'acetolactat sintasa (ALS) i la 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfat sintasa (EPSPS) està àmpliament distribuïda entre les poblacions d’Amaranthus palmeri (A. palmeri) a nivell mundial, cosa que representa un gran repte per a la gestió dels cultius. A Espanya, només s’han caracteritzat unes poques poblacions d’A. palmeri fins ara, mentre que se’n continuen descobrint de noves tant en entorns agrícoles com urbans. Per a aquestes poblacions recentment identificades, es desconeix si han desenvolupat resistència als diferents modes d'acció dels herbicides, quins són els mecanismes subjacents a aquesta resistència i quins esdeveniments evolutius van conduir a la seva aparició. L’objectiu general d’aquest treball és caracteritzar els mecanismes de resistència als herbicides en poblacions espanyoles d’A. palmeri, centrant-se en el seu impacte sobre la fisiologia de la planta i els processos evolutius que han permès l’establiment de la resistència en poblacions naturals. Això inclou la identificació de mecanismes que confereixen resistència als inhibidors d’ALS i EPSPS, l’estudi dels orígens evolutius de la resistència al glifosat mediada per ADN circular extracromosòmic (eccDNA), l’anàlisi de l’expansió de la resistència als inhibidors d’ALS a Europa i l’avaluació de l’impacte de les mutacions en la proteïna ALS sobre la cinètica enzimàtica i la interacció amb herbicides inhibidors. A la primera part d’aquest estudi, es van caracteritzar els patrons de resistència als herbicides de nou poblacions espanyoles d’A. palmeri davant d’herbicides inhibidors d’ALS i EPSPS. Es van realitzar assajos d’aplicació d’herbicides per avaluar el perfil de resistència de cada població, seguits d’anàlisis moleculars per identificar possibles mecanismes de resistència en el lloc d’acció. L’estudi va confirmar que les mutacions puntuals als codons P197, A376 i W574 confereixen resistència als herbicides inhibidors d’ALS, com ara el tifensulfuró-metil i l’imazamox. A més, la resistència al glifosat en dues de les nou poblacions es va associar a la duplicació del gen EPSPS.

L’anàlisi d’haplotips de la mutació W574L al gen ALS i l’amplificació parcial de l’ADN circular extracromosòmic (eccDNA) del gen EPSPS van suggerir que aquests mecanismes de resistència en el lloc diana es van originar arran d’esdeveniments evolutius que van tenir lloc abans de la introducció d’aquestes poblacions a Espanya. Finalment, es va dur a terme la caracterització bioquímica de les proteïnes ALS recombinants d’A. palmeri per entendre la seva cinètica enzimàtica i la seva sensibilitat als herbicides inhibidors d’ALS. Els resultats van revelar que les mutacions a P197 i W574 redueixen l’afinitat pel substrat, donant lloc a resistència creuada a causa d’alteracions en el lloc d’unió de l’herbicida. En conjunt, aquests resultats posen de manifest la creixent presència de poblacions d’A. palmeri amb múltiples resistències als herbicides a Espanya, indicant que els mecanismes de resistència es van originar abans de la seva introducció i probablement s’estan propagant mitjançant el flux gènic a través del pol·len i les llavors. L’aparició de noves poblacions amb perfils de resistència desconeguts complica encara més la seva gestió, la qual cosa subratlla la necessitat d’aplicar estratègies integrades de control de males herbes per gestionar de manera eficaç aquestes poblacions resistents.

La resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) y la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) está ampliamente distribuida entre las poblaciones de Amaranthus palmeri (A. palmeri) a nivel mundial, lo que plantea importantes desafíos para la gestión de cultivos. En España, solo unas pocas poblaciones de A. palmeri han sido caracterizadas hasta la fecha, mientras que se siguen identificando nuevas poblaciones tanto en entornos agrícolas como urbanos. Para estas poblaciones recientemente descubiertas, se desconoce si han desarrollado resistencia a diferentes modos de acción de los herbicidas, cuáles son los mecanismos subyacentes a esta resistencia y qué eventos evolutivos condujeron a su aparición. El objetivo general de este trabajo es caracterizar los mecanismos de resistencia a herbicidas en poblaciones españolas de A. palmeri, centrándose en su impacto sobre la fisiología de la planta y los procesos evolutivos que facilitan el establecimiento de la resistencia en poblaciones naturales. Esto incluye la identificación de mecanismos que confieren resistencia a inhibidores de ALS y EPSPS, la exploración de los orígenes evolutivos de la resistencia al glifosato mediada por ADN circular extracromosómico (eccDNA), el análisis de la expansión de la resistencia a inhibidores de ALS en Europa y la evaluación del impacto de mutaciones en la proteína ALS sobre la cinética enzimática y la interacción con herbicidas inhibidores. En la primera parte de este estudio, se caracterizaron los patrones de resistencia a herbicidas de nueve poblaciones españolas de A. palmeri frente a herbicidas inhibidores de ALS y EPSPS. Se realizaron ensayos de aplicación de herbicidas para evaluar el perfil de resistencia de cada población, seguidos de análisis moleculares para identificar posibles mecanismos de resistencia en el sitio de acción. El estudio confirmó que las mutaciones puntuales en los codones P197, A376 y W574 confieren resistencia a los herbicidas inhibidores de ALS, como el tifensulfurón- metil y el imazamox. Además, la resistencia al glifosato en dos de las nueve poblaciones se asoció con la duplicación del gen EPSPS. El análisis de haplotipos de la mutación W574L en el gen ALS y la amplificación parcial del ADN circular extracromosómico (eccDNA) del gen EPSPS sugirieron que estos mecanismos de resistencia en el sitio diana se originaron a partir de eventos evolutivos que ocurrieron antes de la introducción de estas poblaciones en España. Finalmente, se llevó a cabo la caracterización bioquímica de proteínas recombinantes ALS de A. palmeri para comprender su cinética enzimática y su sensibilidad a herbicidas inhibidores de ALS. Los resultados revelaron que las mutaciones en P197 y W574 reducen la afinidad por el sustrato, lo que genera resistencia cruzada debido a alteraciones en el sitio de unión del herbicida. En conjunto, estos hallazgos destacan la creciente presencia de poblaciones de A. palmeri con múltiples resistencias a herbicidas en España, indicando que los mecanismos de resistencia se originaron antes de su introducción y probablemente se están propagando mediante el flujo génico a través del polen y las semillas. La aparición de nuevas poblaciones con perfiles de resistencia desconocidos complica aún más su manejo, subrayando la necesidad de implementar estrategias integradas de control de malezas para gestionar eficazmente estas poblaciones resistentes.

Herbicide resistance to acetolactate synthase (ALS) and 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) inhibitors is widespread among Amaranthus palmeri (A. palmeri) populations globally, posing significant challenges for crop management. In Spain, only a few A. palmeri populations have been characterized to date, while new populations continue to be identified in both agricultural and urban environments. For these newly discovered populations, it remains unknown whether they have developed resistance to herbicide modes of action, what mechanisms underlie their resistance, and what evolutionary events led to their emergence. The general objective of this work, is to characterize herbicide resistance mechanisms in A. palmeri populations from Spain, focusing on their impact on plant physiology and the evolutionary processes enabling resistance in natural populations. This includes identifying mechanisms conferring resistance to ALS- and EPSPS-inhibitors, exploring the evolutionary origins of eccDNA-mediated glyphosate resistance, analyzing the spread of ALS inhibitor resistance in Europe, and assessing how ALS protein mutations influence enzyme kinetics and herbicide interactions. In the first part of this study, the herbicide resistance patterns of nine Spanish A. palmeri populations were characterized in response to ALS- and EPSPS-inhibiting herbicides. Herbicide application trials were conducted to assess the resistance profile of each population, followed by molecular analysis to identify possible target-site resitance mechanisms. The study confirmed that point mutations at codons P197, A376, and W574 confer resistance to ALS-inhibiting herbicides thifensulfuron-methyl and imazamox. Additionally, glyphosate resistance in two of the nine populations was linked to gene duplication of the EPSPS gene. The haplotype analysis of the W574L mutation at ALS gene and partial amplification of extrachromosomal circular DNA (eccDNA) of the EPSPS gene suggested that these target-site resistance mechanisms emerged from evolutionary events that occurred prior to the introduction of these populations into Spain. Finally, the biochemical characterization of recombinant ALS proteins from A. palmeri was carried out to understand their enzyme kinetics and sensitivity to ALS-inhibiting herbicides. The results revealed that mutations at P197 and W574 reduce substrate affinity, resulting in cross-resistance due to alterations in the herbicide binding site. Together, these findings highlight the increasing presence of multiple herbicide-resistant A. palmeri populations in Spain, indicating that resistance mechanisms originated prior to their introduction and are likely spreading through pollen- and seed-mediated gene flow. The emergence of new populations with unknown resistance profiles further complicates their management, underscoring the need for integrated weed management strategies to control these resistant populations.