Mass Spectrometry-driven strategies for the development of K-VAX: A proteomic approach to AcinetoVax-based vaccines

Abstract

Les infeccions adquirides en entorns hospitalaris (HAIs) representen una amenaça creixent per a la salut pública, agreujada per la proliferació de bacteris resistents als antibiòtics (AMR). L’Organització Mundial de la Salut (OMS) adverteix sobre la urgència de desenvolupar noves estratègies terapèutiques i preventives. En aquest context, les vacunes es presenten com una alternativa prometedora, tot i que el seu desenvolupament és complex i requereix metodologies avançades per a la seva optimització. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament de K-VAX, una vacuna bivalent contra Acinetobacter baumannii i Klebsiella pneumoniae, dos dels principals patògens implicats en infeccions en entorns hospitalaris. K-VAX es basa en la plataforma vacunal AcinetoVax (Vaxdyn S.L.), dissenyada per a l’expressió de proteïnes heteròlogues amb potencial immunogènic. Per a la seva caracterització i desenvolupament, s’ha implementat un mètode quantitatiu basat en LC-MS/MS per mesurar amb precisió els antígens vacunals. Aquest mètode utilitza pèptids marcats amb isòtops estables (SIL, Stable Isotope-Labeled). A més, actualment s’està adaptant per a la seva futura implementació en l’anàlisi rutinari de lots industrials. També s’han dut a terme estudis d’adsorció dels antígens en l’adjuvant Alhydrogel, amb l’objectiu de determinar la quantitat d’antigen adsorbit i avaluar-ne l'estabilitat en la formulació vacunal. Paral·lelament, s’han caracteritzat anticossos monoclonals (mAbs) dirigits contra els antígens vacunals, la qual cosa ha permès el seu ús en el desenvolupament d’immunoassaigs, com ELISA. En conclusió, l’aplicació de metodologies avançades d’espectrometria de masses ha permès optimitzar el desenvolupament preclínic d’aquesta vacuna, proporcionant eines analítiques clau per a la seva caracterització, control de qualitat i futura escalabilitat a la producció industrial.

Las infecciones adquiridas en entornos hospitalarios (HAIs) representan una amenaza creciente para la salud pública, agravada por la proliferación de bacterias resistentes a los antibióticos (AMR). La Organización Mundial de la Salud (OMS) advierte sobre la urgencia de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y preventivas. En este contexto, las vacunas surgen como una alternativa prometedora, aunque su desarrollo es complejo y requiere metodologías avanzadas para su optimización. Esta tesis se centra en el desarrollo de K-VAX, una vacuna bivalente contra Acinetobacter baumannii y Klebsiella pneumoniae, dos de los principales patógenos implicados en infecciones en entornos hospitalarios. K-VAX se basa en la plataforma vacunal AcinetoVax (Vaxdyn S.L.), diseñada para la expresión de proteínas heterólogas con potencial inmunogénico. Para la caracterización y desarrollo, se ha implementado un método cuantitativo basado en LC-MS/MS para medir con precisión los antígenos vacunales. Este método emplea péptidos marcados con isótopos estables (SIL, Stable Isotope-Labeled) Además, este método se encuentra en adaptación para su futura implementación en el análisis rutinario de lotes industriales. También, se han llevado a cabo estudios de adsorción de los antígenos en el adyuvante Alhydrogel, con el objetivo de determinar la cantidad de antígeno absorbido y evaluar su estabilidad en la formulación vacunal. Paralelamente, se han caracterizado anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra los antígenos vacunales, lo que ha permitido su uso en el desarrollo de inmunoensayos, como ELISA. En conclusión, la aplicación de metodologías avanzadas de espectrometría de masas ha permitido optimizar el desarrollo preclínico de esta vacuna, proporcionando herramientas analíticas clave para su caracterización, control de calidad y futura escalabilidad a la producción industrial.

Hospital-acquired infections (HAIs) represent a growing threat to public health, exacerbated by the proliferation of antibiotic-resistant bacteria (AMR). The World Health Organization (WHO) has highlighted the urgent need to develop new therapeutic and preventive strategies. In this context, vaccines emerge as a promising alternative, although their development remains complex and requires advanced methodologies for optimization. This thesis focuses on the development of K-VAX, a bivalent vaccine against Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae, two of the main pathogens responsible for hospital-acquired infections. K-VAX is based on the AcinetoVax platform (Vaxdyn S.L.), designed for the expression of heterologous proteins with immunogenic potential. To support its characterization and development, a quantitative method based on LC-MS/MS has been implemented to accurately measure vaccine antigens. This method employs Stable Isotope-Labeled (SIL) peptides as internal standards. Additionally, it is currently being adapted for future implementation in the routine analysis of industrial vaccine batches. Furthermore, antigen adsorption studies have been conducted using the Alhydrogel adjuvant to determine the amount of antigen absorbed and assess its stability in the final vaccine formulation. In parallel, monoclonal antibodies (mAbs) targeting vaccine antigens have been characterized, enabling their use in the development of immunoassays such as ELISA. In conclusion, the application of advanced mass spectrometry methodologies has facilitated the preclinical optimization of this vaccine, providing key analytical tools for its characterization, quality control, and future scalability to industrial production.