RGD-Targeted Nanoliposomes and Extracellular Vesicles for Enhanced Enzyme Replacement Therapy in Fabry Disease

Abstract

Les malalties de dipòsit lisosomal (LSDs) són malalties genètiques rares causades per mutacions en gens que afecten les proteïnes lisosomals, provocant l’acumulació de substrats no degradats als lisosomes i desencadenant problemes en diversos òrgans. La malaltia de Fabry (FD), una LSD lligada al cromosoma X, es caracteritza per una deficiència en l’enzim α-galactosidasa A (GLA), que provoca l’acumulació de globotriaosilceramida (Gb3) en òrgans com els ronyons, el cor i el sistema nerviós. La teràpia de substitució enzimàtica (ERT) amb GLA recombinant és el tractament principal, però presenta limitacions com la baixa estabilitat de l’enzim, la biodistribució restringida, la formació d'anticossos neutralitzants i la incapacitat de travessar la barrera hematoencefàlica.

La nanotecnologia ha estat proposada per millorar l’ERT augmentant la estabilitat i la biodistribució dels enzims terapèutics. Aquesta tesi explora dos sistemes de lliurament de medicaments: els nanoliposomes i les vesícules extracel·lulars (EVs). Els nanoliposomes, vesícules sintètiques, poden encapsular medicaments i ser funcionalitzades per millorar la seva internalització cel·lular i lliurament dirigit. Les EVs, estructures naturals implicades en la comunicació cel·lular, poden ser modificades per transportar proteïnes terapèutiques amb baixa immunogenicitat i bona biocompatibilitat.

En aquesta tesi es van investigar nanoliposomes carregats amb GLA recombinant (rh-GLA) i dirigits amb un pèptid RGD, que millora la interacció amb les integrines αvβ3 de les cèl·lules endotelials. Els nanoliposomes, anomenats nanoGLA, van mostrar estabilitat i activitat enzimàtica durant dues setmanes. La direcció amb RGD va millorar la internalització en les cèl·lules endotelials, tot i que es va observar que la internalització no depenia de M6PR, un receptor implicat en altres mecanismes d’endocitosi. Els nanoGLA van ser més eficaços que els enzims lliures per reduir l’acumulació de Gb3 in vitro. Els estudis en ratolins Fabry KO van mostrar que els nanoliposomes es van acumular al fetge i la melsa, amb RGD millorant el lliurament als ronyons i el cor, tot i que no de manera significativa al cervell. La dosificació repetida de nanoGLA va provocar nivells més alts d’anticossos comparat amb els enzims lliures.

Es va estudiar també la formació d’una corona proteica (PC) a la superfície dels nanoliposomes després de la seva administració intravenosa. Aquesta PC, formada per proteïnes plasmàtiques, pot influir en la biodistribució. Es va observar que la formació de la PC ralentia la internalització cel·lular, destacant la importància de les interaccions amb les proteïnes plasmàtiques.

D’altra banda, es van estudiar les EVs carregades amb GLA (EV-GLA), obtingudes de cèl·lules CHO DG44 (expressió estable) i HEK 293F (expressió transient). Els resultats van mostrar que les EVs de CHO DG44 tenien més activitat enzimàtica que les de HEK 293F. Es va millorar la internalització de les EV-GLA mitjançant la direcció amb un pèptid penetrant cel·lular (rF7), la qual cosa va augmentar significativament l’eficàcia in vitro.

En resum, aquesta tesi demostra que l’ús de nanotecnologia a l’ERT, mitjançant nanoliposomes i EVs, pot millorar l’eficàcia i la biodistribució dels enzims terapèutics, oferint una estratègia prometedora per superar les limitacions de les teràpies actuals i tractar malalties rares com la malaltia de Fabry.

Las enfermedades de depósito lisosomal (LSDs) son trastornos genéticos raros causados por mutaciones en genes que afectan a las proteínas lisosomales, provocando la acumulación de sustratos no degradados en los lisosomas y desencadenando problemas en varios órganos. La enfermedad de Fabry (FD), una LSD ligada al cromosoma X, se caracteriza por una deficiencia en la enzima α-galactosidasa A (GLA), que provoca la acumulación de globotriaosilceramida (Gb3) en órganos como los riñones, el corazón y el sistema nervioso. La terapia de sustitución enzimática (ERT) con GLA recombinante es el tratamiento principal, pero presenta limitaciones como la baja estabilidad de la enzima, la biodistribución restringida, la formación de anticuerpos neutralizantes y la incapacidad de cruzar la barrera hematoencefálica.

La nanotecnología ha sido propuesta para mejorar la ERT aumentando la estabilidad y la biodistribución de las enzimas terapéuticas. Esta tesis explora dos sistemas de liberación de medicamentos: los nanoliposomas y las vesículas extracelulares (EVs). Los nanoliposomas, vesículas sintéticas, pueden encapsular medicamentos y ser funcionalizados para mejorar su internalización celular y liberación dirigida. Las EVs, estructuras naturales involucradas en la comunicación celular, pueden ser modificadas para transportar proteínas terapéuticas con baja inmunogenicidad y buena biocompatibilidad.

En esta tesis se investigaron nanoliposomas cargados con GLA recombinante (rh-GLA) y dirigidos con un péptido RGD, que mejora la interacción con las integrinas αvβ3 de las células endoteliales. Los nanoliposomas, llamados nanoGLA, mostraron estabilidad y actividad enzimática durante dos semanas. La dirección con RGD mejoró la internalización en las células endoteliales, aunque se observó que la internalización no dependía de M6PR, un receptor implicado en otros mecanismos de endocitosis. Los nanoGLA fueron más eficaces que las enzimas libres para reducir la acumulación de Gb3 in vitro. Los estudios en ratones Fabry KO mostraron que los nanoliposomas se acumularon en el hígado y el bazo, con RGD mejorando la liberación a riñones y corazón, aunque no significativamente al cerebro. La dosificación repetida de nanoGLA provocó niveles más altos de anticuerpos en comparación con las enzimas libres.

También se estudió la formación de una corona proteica (PC) en la superficie de los nanoliposomas tras su administración intravenosa. Esta PC, formada por proteínas plasmáticas, puede influir en la biodistribución. Se observó que la formación de la PC ralentizaba la internalización celular, destacando la importancia de las interacciones con las proteínas plasmáticas.

Por otro lado, se estudiaron las EVs cargadas con GLA (EV-GLA), obtenidas de células CHO DG44 (expresión estable) y HEK 293F (expresión transitoria). Los resultados mostraron que las EVs de CHO DG44 tenían más actividad enzimática que las de HEK 293F. Se mejoró la internalización de las EV-GLA mediante la dirección con un péptido penetrante celular (rF7), lo que aumentó significativamente la eficacia in vitro.

En resumen, esta tesis demuestra que el uso de nanotecnología en la ERT, mediante nanoliposomas y EVs, puede mejorar la eficacia y la biodistribución de las enzimas terapéuticas, ofreciendo una estrategia prometedora para superar las limitaciones de las terapias actuales y tratar enfermedades raras como la enfermedad de Fabry.

Lysosomal storage diseases (LSDs) are a group of rare genetic disorders caused by mutations in genes that impair lysosomal protein function, leading to the accumulation of undegraded substrates in lysosomes. This accumulation triggers a pathogenic cascade with widespread organ involvement. Fabry disease (FD), an X-linked LSD, occurs due to a deficiency in the lysosomal enzyme α-galactosidase A (GLA). This results in the accumulation of glycosphingolipids, particularly globotriaosylceramide (Gb3), in organs like the kidneys, heart, and nervous system. Enzyme replacement therapy (ERT), involving the intravenous administration of recombinant GLA, is the main treatment for FD. Though effective at slowing disease progression and improving quality of life, ERT faces challenges such as poor enzyme stability, limited biodistribution, development of neutralizing antibodies, and the inability to cross the blood-brain barrier.

Nanotechnology has emerged as a promising approach to enhance ERT by improving enzyme stability and biodistribution. This thesis explores two drug delivery systems (DDSs)—nanoliposomes and extracellular vesicles (EVs)—as methods to enhance ERT for FD. Nanoliposomes are synthetic vesicles made of phospholipid bilayers, capable of encapsulating drugs and being functionalized with peptides to enhance cellular uptake and targeted delivery. EVs, natural structures involved in cell communication, can be engineered to carry therapeutic proteins with low immunogenicity and good biocompatibility, making them ideal for drug delivery.

The thesis investigates nanoliposomes loaded with recombinant GLA (rh-GLA) and targeted with an RGD peptide, which enhances their interaction with αvβ3-integrins on endothelial cells. These nanoliposomes, called nanoGLA, exhibited good stability and maintained enzymatic activity for two weeks. RGD targeting enhanced the internalization of nanoGLA in endothelial cells and showed a potential interaction with the mannose-6-phosphate receptor (M6PR) of endothelial cells, although blocking M6PR did not reduce internalization, indicating an alternative endocytosis mechanism. NanoGLA formulations were more effective than free enzymes at reducing Gb3 accumulation in vitro. In vivo studies in Fabry knockout mice showed that nanoliposomes accumulated in the liver and spleen, with RGD improving delivery to the kidneys and heart, though not significantly to the brain. After repeated dosing, nanoGLA led to higher antibody levels compared to free enzymes. Overall, nanoGLA functionalized with RGD shows potential for improving ERT by enhancing cellular uptake and targeting affected tissues.

When nanoliposomes are administered intravenously, they can adsorb plasma proteins, forming a protein corona (PC), which can affect their biodistribution. Modifications to the nanoliposome surface, such as the addition of RGD peptides, influence the PC composition, which in turn can affect how the nanoliposomes interact with cells. The study found that the protein corona formation occurred rapidly, and its composition, including abundant proteins like albumin and fibrinogen, varied with the presence of RGD and rh-GLA. This protein corona slowed internalization by endothelial cells, highlighting the role of plasma proteins in modulating nanoliposomal interactions and biodistribution.

The thesis also examines EVs as DDSs for GLA enzyme delivery. EVs carrying GLA (EV-GLA) were produced in CHO DG44 cells (stable expression) and HEK 293F cells (transient expression). Different methods of isolating EVs, such as precipitation, filtration, and size exclusion chromatography, were compared, with size exclusion methods providing the highest concentration and efficacy. EVs from CHO DG44 cells showed higher enzymatic activity than those from HEK 293F cells. Additionally, EV-GLA demonstrated improved in vitro efficacy compared to free enzyme. To enhance EV-GLA internalization, EVs were targeted with a recombinant F7 cell-penetrating peptide (rF7), which significantly improved their uptake in endothelial cells, increasing in vitro efficacy.

In conclusion, these innovations address the limitations of current therapies and offer new opportunities for treating rare genetic diseases like Fabry disease.