Caracterización de los linfocitos infiltrantes de tumor desde la perspectiva del TCR y la presentación antigénica en el cáncer de mama

Abstract

El càncer de mama és el tipus de càncer més freqüent en dones i, malgrat que en les darreres dècades la taxa de supervivència ha incrementat, alguns tipus de tumors, especialment aquells que no expressen receptors hormonals com el triple negatiu, segueixen sense alternatives terapèutiques. L’estudi del sistema immunitari pot ajudar a desenvolupar altres opcions de tractament. De fet, els tractaments basats en la immunoteràpia estan donant bons resultats en certs tipus de càncer, encara que alguns pacients segueixen sense respondre correctament a les teràpies. Fins i tot en aquells tumors en els que es presenten ràtios de limfòcits T CD8+/Treg infiltrants altes –considerat un bon marcador pronòstic en càncer de mama –no sempre s’assegura una bona resolució. D’altra banda, s’ha descrit que l’estudi del repertori de TCR pot tenir un valor pronòstic i predictiu de l’evolució de la malaltia, així com de resposta a tractament. Aquests antecedents indiquen que millorar la comprensió de la resposta antitumoral, així com la funcionalitat dels tipus cel·lulars que la realitzen, pot ajudar a desenvolupar millors tractaments. L’anàlisi del repertori de TCR podria ajudar a entendre la seva configuració. No obstant, la gran variabilitat del repertori de TCR i la seva modificació al llarg de la vida per diversos factors com l’edat, l’historial de vacunació, d’infecció o altres malalties, la presència d’autoimmunitat o la immunomodulació que causen certs tractaments, en dificulta l’estudi. El repertori de TCR està altament associat a l’haplotip d’HLA dels individus, el qual el configura ja des del seu origen al tim. Al lloc del tumor, el repertori estarà influenciat per la presència d’antígens immunogènics capaços d’activar una resposta immunitària i presentats, en forma de pèptids, formant un complex amb les molècules HLA. Per tant, l’haplotip és un factor determinant del repertori de TCR. La presència de cèl·lules dendrítiques és important per a l’activació dels limfòcits T CD4+ i CD8+ donada la seva capacitat de presentar pèptids mitjançant molècules d’HLA-II i HLA-I, respectivament. L’expressió de les molècules d’HLA-II està limitada a les APC, per tant, la seva presència és especialment necessària per activar les cèl·lules T CD4+. Altres factors externs com la presència de virus altament freqüents a la població, e. g., membres de la família herpesviridae, poden tenir un paper rellevant en la configuració de la resposta especialment quan aquests afecten cèl·lules del sistema immune. La resposta antitumoral requereix l’activació tant de limfòcits T CD4+, crucials per a l’orquestració inicial, sustentació de la resposta i generació de memòria immunològica, com de limfòcits T CD8+, per la seva capacitat de llisar específicament les cèl·lules tumorals. Tenint tot això en compte, aquesta tesi doctoral té com a objectiu l’estudi de limfòcits infiltrants de tumor en diferents tipus de tumors de càncer de mama, enfocada als subtipus cel·lulars CD4+ i CD8+ i amb especial interès en l’anàlisi del repertori de TCR en aquestes poblacions. D’altra banda, s’ha realitzat una primera prova de concepte orientada a l’estudi del repertori presentat per diferents al·lels de HLA DR en cèl·lules dendrítiques, polsades amb material d’un extracte de línia cel·lular tumoral, per tal de determinar si hi ha certes diferències en funció dels al·lels. Finalment, s’han analitzat limfòcits B EBV+ infiltrants de tumor en càncer de mama, obtinguts a partir d’un limfoma de cèl·lules B associat a un xenoempelt per estudiar el paper dels limfòcits B com a cèl·lules presentadores d’antigen i mantenir la resposta de certs limfòcits T.

El cáncer de mama es el tipo de cáncer más frecuente en mujeres y a pesar de que en las últimas décadas la tasa de supervivencia ha incrementado, algunos tipos de tumores, especialmente aquellos que no expresan receptores hormonales como el triple negativo, siguen sin alternativas terapéuticas. El estudio del sistema inmunitario puede ayudar a desarrollar otras opciones de tratamiento. Prueba de ello es que los tratamientos basados en la inmunoterapia están dando buenos resultados en ciertos tipos de cáncer, aunque algunos pacientes siguen sin responder a las terapias. Incluso en aquellos tumores que presentan una ratio de linfocitos T CD8+/Treg infiltrantes alta –considerada un buen marcador pronóstico en cáncer de mama –no siempre se asegura una buena resolución. Por otro lado, se ha reportado que el estudio del repertorio de TCR puede tener un valor pronóstico y predictivo de evolución de la enfermedad, así como de respuesta a tratamiento. Estos antecedentes indican que mejorar la comprensión de la respuesta anti-tumoral, así como la funcionalidad de los tipos celulares que la realizan puede ayudar a desarrollar mejores tratamientos. El análisis del repertorio de TCR podría ayudar a su comprensión. La gran variabilidad del repertorio de TCR y su modificación a lo largo de la vida por varios factores tales como la edad, el historial de vacunación, de infección u otras enfermedades, la presencia de autoinmunidad o la inmunomodulación que causan ciertos tratamientos, dificulta su estudio. El repertorio de TCR está altamente asociado al haplotipo de HLA de los individuos, el cuál lo configura ya des de su origen en el timo. En el sitio del tumor, el repertorio estará influenciado por la presencia de antígenos inmunogénicos capaces de activar una respuesta inmune y presentados en forma de péptidos formando complejo con las moléculas HLA. Por lo tanto, el haplotipo es un factor determinante del repertorio de TCR. La presencia de células dendríticas es importante para la activación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ dada su capacidad de presentar péptidos a través de HLA II y HLA I, respectivamente. Debido a que la expresión de las moléculas de HLA-II está limitada a las APC, su presencia es especialmente necesaria para la activación de las células T CD4+. Otros factores externos como la presencia de virus altamente frecuentes en la población, e. g., miembros de la familia herpesviridae, pueden tener un papel relevante en la configuración de la respuesta especialmente cuando éstos afectan a células del sistema inmune. La respuesta anti-tumoral requiere la activación tanto de linfocitos T CD4+, cruciales para la orquestación inicial, sustentación de la respuesta y generación de memoria inmunológica, como de linfocitos T CD8+, por su capacidad de lisar específicamente las células tumorales. Teniendo todo esto en cuenta, esta tesis doctoral ha tenido como objetivo el estudio de linfocitos infiltrantes de tumor en distintos tipos de tumores de cáncer de mama, enfocado en los subtipos celulares CD4+ y CD8+ y con especial interés en el análisis del repertorio de TCR en dichos subtipos. Por otro lado, se ha realizado una primera prueba de concepto orientada en el estudio del repertorio presentado por distintos alelos de HLA DR en células dendríticas pulsadas con material de un extracto de línea celular tumoral, con el fin de determinar si existen ciertas diferencias en función de los alelos. Por último, se han analizado linfocitos B EBV+ infiltrantes de tumor en cáncer de mama, obtenidos a partir de un linfoma de células B asociado a un xenoinjerto para estudiar el papel de los linfocitos B como células presentadoras de antígeno y mantener la respuesta de ciertos linfocitos T.

Breast cancer is the most common type of cancer in women and although in the last decades the survival rate has increased, some types of tumors, especially those that do not express hormone receptors such as triple-negative breast cancer, do not have therapeutic alternatives. The study of the immune system may be useful to develop other treatments. Proof of this is that the use of immunotherapy is beneficial in certain types of cancer, although some patients still do not respond. Even in those tumors with a high CD8+ T lymphocytes/Treg ratio –considered a good prognostic marker in breast cancer –some patients do not present a good outcome. On the other hand, it has been reported that the study of the TCR repertoire may have a prognostic and predictive value for the evolution of the disease, as well as for response to treatments. Overall, this indicates that better understanding the anti-tumor response, as well as immune cell types and functions, can help to develop better treatments. The analysis of the TCR repertoire can be useful for its study. However, the great variability of the TCR repertoire and its modification throughout life due to several factors such as age, history of vaccination, infection, or other diseases, as well as the presence of autoimmunity or immunomodulation caused by certain treatments, it hinders its study. The TCR repertoire is highly associated with the HLA haplotype of individuals, as it is configured from its origin in the thymus. At the tumor site, the repertoire will be influenced by the presence of immunogenic antigens capable of activating an immune response and presented as peptides by the HLA molecules. Therefore, the haplotype is a determining factor of the TCR repertoire. The presence of dendritic cells is important for the activation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes given their ability to present peptides through HLA II and HLA I molecules, respectively. As the expression of HLA-II molecules is limited to APCs, their presence is especially important for the activation of CD4+ T cells. Other external factors such as the presence of highly frequent viruses in the population, e. g., members of the herpesviridae family, may play a relevant role in shaping the immune response, especially when they are infecting cells from the immune system. The anti-tumor response requires the activation of both CD4+ T lymphocytes, crucial for the initial orchestration and sustainment of the response, and generation of immunological memory, as well as CD8+ T lymphocytes, due to their ability to specifically lyse tumor cells. Considering this, this doctoral thesis has the objective of studying tumor-infiltrating lymphocytes in different types of breast cancer tumors, focused on the CD4+ and CD8+ cell subtypes and with a special interest in the analysis of the TCR repertoire in both subsets. On the other hand, a first proof of concept has been carried out, focused on the study of the repertoire presented by different HLA DR alleles in dendritic cells pulsed with a tumor cell line extract, to determine if there are certain differences in the antigen presentation between different alleles. Finally, tumor-infiltrating EBV+ B lymphocytes in breast cancer, obtained from a xenograft-associated B-cell lymphoma, have been analyzed to study the role of B lymphocytes as antigen-presenting cells and maintain the response of certain lymphocytes T.