Engineering human pluripotent stem cells to understand kidney development and disease

Abstract

During the last years, the development of procedures to direct the differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) towards different renal cell types has resulted in the establishment of approaches focused on the generation of kidney organoids. In addition, the possibility to modify the genome of hPSCs using the novel CRISPR-Cas9 editing technology has provided an unprecedented opportunity to study the role of specific proteins during nephrogenesis and renal pathogenesis in the human context. In the light of these findings, the main aim of this thesis was to develop new organoid model systems to investigate early steps of human kidney development and disease. Towards this goal, we first genetically engineered hPSCs to introduce loss-of-function and patient-specific mutations in WT1 and PAX2 renal transcription factors. The resulting CRISPR/Cas9 engineered hPSC clonal cell lines were further differentiated towards the renal lineage by the development of new culture methods including two-dimension (2D) and three-dimension (3D) settings. These cell culture platforms have allowed to properly dissect the role of WT1 and PAX2 in early stages of renal differentiation in vitro. Collectively, our results showed that lack of WT1 and PAX2 resulted in kidney differentiation impairment as well as the acquisition of relevant kidney disease-related phenotypes. In addition, a WT1 hPSC reporter cell line was generated and validated as a valuable tool to isolate WT1-expressing cellular populations for further characterization. Altogether, this work demonstrates that genetically engineered kidney organoids represent an unvaluable model system to dissect the role of the renal markers WT1 and PAX2 in human kidney development and disease in vitro.

Durante los últimos años, el desarrollo de procedimientos para dirigir la diferenciación de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) hacia diferentes tipos celulares renales ha resultado en el establecimiento de estrategias enfocadas en la generación de organoides de riñón. Además, la posibilidad de modificar el genoma de las hPSC utilizando la nueva tecnología de edición génica CRISPR-Cas9 ha brindado una oportunidad sin precedentes para estudiar el papel de proteínas específicas durante la nefrogénesis y la patogénesis renal en el contexto humano. En base a estos hallazgos, el objetivo principal de esta tesis fue desarrollar nuevos sistemas de modelos de organoides para investigar los primeros pasos del desarrollo y la enfermedad del riñón humano. Con este objetivo, primero modificamos genéticamente las hPSC para introducir mutaciones de pérdida de función y mutaciones específicas de pacientes en los factores de transcripción renal WT1 y PAX2. Las líneas celulares clonales de hPSC que resultaron de la modificación genética usando CRISPR / Cas9 se diferenciaron hacia el linaje renal mediante el desarrollo de nuevos métodos de cultivo que incluyen configuraciones de dos dimensiones (2D) y tres dimensiones (3D). Estas plataformas de cultivo celular han permitido diseccionar adecuadamente el papel de WT1 y PAX2 en las primeras etapas de la diferenciación renal in vitro. En conjunto, nuestros resultados mostraron que la falta de WT1 y PAX2 dio como resultado un deterioro de la diferenciación renal, así como la adquisición de fenotipos relevantes relacionados con enfermedades renales. Además, se generó una línea hPSC para reportar la expression de WT1 y se validó como una herramienta valiosa para aislar poblaciones celulares que expresan la proteína WT1 y caracterizarlas en profundidad posteriormente.