The tumor microenvironment in lung cancer pathogenesis: A hint to therapeutic agents and the influence of chronic obstructive pulmonary disease

Abstract

Introducció: La malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) és un factor de risc independent per el desenvolupament de càncer de pulmó (CP) en els pacients. Els mecanismes encara s’han de dilucidar per a comprendre les relacions entre MPOC i CP.

Hipòtesi: Els components del microambient tumoral poden diferir en els tumors de pacients amb CP amb i sense MPOC. La immunoteràpia també pot reduir la càrrega tumoral a través de diversos mecanismes biològics.

Objectius: 1) Pacients: estudiar el paper del microambient tumoral, les cèl·lules immunitàries, les característiques de l’estroma i la sobreactivació de PARP en el procés de tumorigènesi en pacients amb CP amb i sense MPOC. 2) Ratolins: avaluar els efectes de la immunoteràpia en la grandària tumoral mitjançant l’anàlisi de diversos mecanismes biològics com l’estrès oxidatiu, l’apoptosi i l’autofàgia.

Mètodes: 1) Pacients: es van reclutar 90 pacients amb MPOC-CP i 43 pacients només amb CP procedents de la cohort Càncer de Pulmó Mar (Barcelona) des de l’any 2008 fins al 2019. Es van obtenir mostres pulmonars tumorals i no tumorals en els pacients mitjançant toracotomia/cirurgia toracoscòpica assistida per vídeo (VATS), sempre previ a la quimioteràpia i/o radioteràpia. 2) Ratolins: dos grups de ratolins Balb/c amb CP induït mitjançant la inoculació subcutània de cèl·lules d’adenocarcinoma pulmonar LP07: ratolins tractats i no tractats, n = 9/grup. Al grup tractat se li va administrar un còctel d’anticossos monoclonals (anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-CD19 i anti-CD137) i una solució tampó (PBS) als ratolins control. Es van obtenir els tumors en tots els ratolins per dur a terme l’estudi (30 dies). Anàlisi biològic: es van utilitzar Western-blot, immunohistoquímica, ELISA, cultius cel·lulars, i immunofluorescència per avaluar els marcadors biològics objecte d’estudi en cada model i tipus de mostres.

Resultats: 1) Pacients: els tumors pulmonars de pacients amb MPOC van mostrar nivells més baixos d’estructures limfoides terciàries (ETLs) i centres germinals (CG) respecte dels pacients sense MPOC. Els nivells més baixos de ETLs i cèl·lules B en els tumors pulmonars es van associar amb una pitjor supervivència a 10 anys, especialment en aquells amb MPOC. En l’estroma tumoral, la presència de MPOC no es va associar a diferències en els components de l’estroma com ara la matriu extracel·lular, els fibroblasts associats al càncer o les cèl·lules endotelials. A més, els nivells de dany de l’ADN i la consegüent activació de PARP estaven més elevats només en els tumors pulmonars dels pacients amb MPOC, mentre que l’expressió dels enzims PARP-1 i PARP-2 estaven disminuïdes en els tumors pulmonars respecte de les no tumorals, independentment de la presència de MPOC. 2) Ratolins: la immunoteràpia va reduir la càrrega tumoral a través de l’augment dels nivells de l’estrès oxidatiu, apoptosi, autofàgia i de vies de senyalització com NF-kB i sirtuin-1 en tumors dels ratolins tractats comparant amb els ratolins amb CP sense immunoteràpia.

Conclusions: El microambient immunològic tumoral, els components de l’estroma i l’activitat de PARP s’expressen de forma clarament diferenciada en els tumors pulmonars de pacients amb CP amb MPOC respecte dels pacients sense MPOC. La reducció en la formació de ELTs i CGs, l’augment en el dany de l’ADN i la sobreactivació de PARP probablement contribueixin a la major susceptibilitat per desenvolupar CP en pacients amb MPOC. En ratolins tractats amb la immunoteràpia, l’augment dels nivells d’estrès oxidatiu juntament amb l’activació d’apoptosi i autofàgia poden ser part dels mecanismes mitjançant els quals la immunoteràpia redueix la càrrega tumoral. En resum, la presència de MPOC s’ha de tenir en compte en el disseny de teràpies per al CP, incloses la immunoteràpia i la inhibició de l’activació de PARP.

Introducción: La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un factor de riesgo independiente para el desarrollo de cáncer de pulmón (CP) en los pacientes. Los mecanismos aún se quedan por dilucidar a comprender las relaciones entre EPOC y CP.

Hipótesis: Los componentes del microambiente tumoral pueden diferir en los tumores de pacientes con CP con y sin EPOC. La inmunoterapia también puede reducir la carga tumoral a través de varios mecanismos biológicos.

Objetivos: 1) Pacientes: estudiar el papel del microambiente tumoral, las células inmunes, las características del estroma y la sobreactivación de PARP en el proceso de tumorigénesis en pacientes con CP con y sin EPOC. 2) Ratones: evaluar los efectos de la inmunoterapia en el tamaño tumoral mediante el análisis de varios mecanismos biológicos como el estrés oxidativo, la apoptosis y la autofagia.

Métodos: 1) Pacientes: se reclutaron 90 pacientes con EPOC-CP y 43 pacientes solo con CP procedentes de la Cohorte Cáncer de Pulmón Mar, Barcelona, desde el año 2008 hasta el 2019. Se obtuvieron muestras pulmonares tumorales y no tumorales en los pacientes mediante toracotomía/cirugía toracoscópica asistida por video (VATS), siempre previo a la quimioterapia y/o radioterapia. 2) Ratones: dos grupos de ratones BALB /c con CP inducido mediante la inoculación subcutánea de células de adenocarcinoma pulmonar LP07: ratones tratados y no tratados, n= 9/grupo. Al grupo tratado se le administró un cóctel de anticuerpos monoclonales (anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-CD19 y anti-CD137) y una solución tampón (PBS) a los ratones control. Se obtuvieron los tumores en todos los ratones al final del estudio (30 días). Análisis biológico: se utilizaron Western-blot, inmunohistoquímica, ELISA, cultivos celulares, y inmunofluorescencia para evaluar los marcadores biológicos objeto de estudio en cada modelo y tipos de muestras.

Resultados: 1) Pacientes: los tumores pulmonares de pacientes con EPOC mostraron niveles más bajos de estructuras linfoides terciarias (ETLs) y centros germinales (CG) respecto de los pacientes sin EPOC. Los niveles más bajos de ELTs y células B en los tumores pulmonares se asociaron con una peor supervivencia a 10 años, especialmente en aquéllos con EPOC. En el estroma tumoral, la presencia de EPOC no se asoció a diferencias en los componentes del estroma tales como la matriz extracelular, los fibroblastos asociados al cáncer o las células endoteliales. Además, los niveles de daño del ADN y la consiguiente activación de PARP estaban más elevados solamente en los tumores pulmonares de los pacientes con EPOC, mientras que la expresión de las enzimas PARP-1 y PARP-2 estaban disminuidas en los tumores pulmonares respecto de las no tumorales, independientemente de la presencia de EPOC. 2) Ratones: la inmunoterapia redujo la carga tumoral a través del aumento de los niveles del estrés oxidativo, apoptosis, autofagia y de vías de señalización como NF-kB y sirtuin-1 en tumores de los ratones tratados comparando con los ratones con CP sin inmunoterapia.

Conclusiones: El microambiente inmunológico tumoral, los componentes del estroma y la actividad de PARP se expresan de forma claramente diferenciada en los tumores pulmonares de pacientes con CP con EPOC respecto de los pacientes sin EPOC. La reducción en la formación de ELTs y CGs, el aumento en el daño del ADN y la sobreactivación de PARP probablemente contribuyan a la mayor susceptibilidad para desarrollar CP en pacientes con EPOC. En ratones tratados con la inmunoterapia, el aumento de los niveles de estrés oxidativo junto con la activación de apoptosis y autofagia pueden ser parte de los mecanismos mediante los cuales la inmunoterapia reduce la carga tumoral. En resumen, la presencia de EPOC debe tenerse en cuenta en el diseño de terapias para el CP, incluidas la inmunoterapia y la inhibición de la activación de PARP.

Background: Lung cancer (LC) is a leading cause of death worldwide. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a highly prevalent lung disease. COPD has been well established as an independent risk factor for lung tumorigenesis in patients. However, the biological mechanisms that explain the possible associations between lung cancer and COPD remain to be fully elucidated.

Hypothesis: The tumor microenvironment components (immune profile, stroma, cytokines, and PARP activation) may differ in tumors of lung cancer patients with and without COPD. Immunotherapy may also reduce tumor burden through several biological events.

Objectives: 1) Studies in patients: to elucidate the role of the biological events: tumor microenvironment, immune cell composition, stroma characteristics, and PARP overactivation in the process of tumorigenesis in tumors of patients with and without underlying COPD; 2) Mouse study: to evaluate the effects of immunotherapy on tumor burden through the analyses of several biological mechanisms such as oxidative stress, apoptosis, and autophagy.

Methods: Two models were used: 1) Studies in patients: 90 LC patients with underlying COPD and 43 LC-only patients were recruited from 2008 to 2019 from the Lung Cancer Mar Cohort, Barcelona. Lung tumor and the surrounding non-tumor lung specimens were obtained from all study patients through thoracotomy or video-assisted thoracoscopic surgery (VATS) prior to chemotherapy and/or radiotherapy; 2) Mouse study: Two groups of wild-type BALB/C mice with experimental lung cancer (subcutaneous inoculation of LP07 adenocarcinoma cells in the left flank of mice) were established: treated and non-treated mice, n=9/group. In the treatment group, lung cancer mice were treated with a cocktail of monoclonal antibodies (intraperitoneal injection, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-CD19, and anti-CD137). Lung tumors were obtained from all mice. Biological analysis: laboratory techniques such as western-blot, immunohistochemistry, ELISA, cell culture, and immunofluorescence were used to assess the target biological markers in each study.

Results: 1) Studies in patients: lung tumors of patients with underlying COPD showed lower levels of tertiary lymphoid structures (TLSs) compared to lung cancer only patients. Moreover, lower levels of TLS and B cells in lung tumors were associated with poorer 10-year overall survival rates of patients, especially in those with underlying COPD. In tumor stroma, the presence of COPD did not elicit any significant difference in levels of extracellular matrix, cancer-associated fibroblasts or endothelial cells. In addition, DNA damage and PARP activation levels were higher only in lung tumors of patients with underlying COPD, while PARP-1 and PARP-2 enzyme expression levels were lower in lung tumors compared to non-tumor specimens irrespective of the presence of COPD. 2) Mouse study: treatment with immunotherapy reduced tumor burden through increased levels of oxidative stress, apoptosis, autophagy, and signaling pathways such as NF-kB and sirtuin-1 in tumors of the treated mice compared to tumors of non-treated animals.

Conclusions: Tumor immune microenvironment, stroma components, and PARP are differentially expressed in lung tumors of lung cancer patients with underlying COPD. The reduction in TLS and GC formation, the rise in DNA damage, and PARP overactivation probably contribute to the greater susceptibility of COPD patients to develop lung tumors. In mice treated with the combination of monoclonal antibodies, increased levels of oxidative stress along with activated apoptosis and autophagy may be part of the mechanisms whereby immunotherapy may reduce tumor burden. In conclusion, the presence of COPD should be considered when designing therapeutic strategies of lung cancer including immunotherapy as well as PARP activity inhibition.