Heavy metal uptake in the environmental isolated bacterium Ochrobactrum anthropi DE2010: Morphological responses, genomic insights and cellular strategies

Abstract

La contaminació ambiental és una de les condicions extremes que pot alterar els ecosistemes naturals i afectar tots els organismes vius. Entre els contaminants ambientals, els metalls tenen un paper rellevant degut a la seva elevada toxicitat. De fet, es pot considerar que els microorganismes que habiten zones contaminades per metalls formen freqüentment consorcis, la qual cosa els permet desenvolupar estratègies cel·lulars per sobreviure en presència de metalls evitant així els seus efectes nocius.

En els darrers anys, el nostre grup de recerca ha aïllat diferents consorcis de microorganismes dels tapets microbians del delta de l’Ebre (Tarragona). Aquests consorcis estan formats per un únic microorganisme fotòtrof i diferents heteròtrofs. En la present tesi doctoral, a partir del consorci on domina la microalga Scenedesmus sp. DE2009, s’ha aïllat, caracteritzat i identificat un bacteri heteròtrof com a Ochrobactrum anthropi DE2010. En estudis preliminars, aquest bacteri ha mostrat la capacitat per fixar nitrogen atmosfèric, presentar pleomorfisme cel·lular i resistir a antibiòtics del grups dels betalactàmics. Encara que prèviament s’ha investigat l’efecte de diversos metalls pesants en el consorci Scenedesmus sp. DE2009, no se sap res sobre l’efecte d’aquests en la viabilitat cel·lular d’O. antropi DE2010 i el seu paper en la captació de metalls pesants.

Els objectius de la present tesi s’han desenvolupat tenint en compte que O. anthropi DE2010 creix de manera fàcil i ràpida tant en medi líquid com sòlid, esdevenint un model adequat per a la investigació front a toxicitat per metalls pesants. A més a més, s’ha analitzat l’efecte citotòxic i la capacitat de resposta de O. anthropi DE2010 per superar l’estrès front a l’exposició a Cd, Pb(II), Cu(II), Cr(III) i Zn així com els patrons de localització cel·lular d’aquests metalls i les estratègies emprades per aquest bacteri per immobilitzar-los. Aquesta tesi s’ha organitzat en diferents capítols. Concretament, el capítol 2 correspon als articles publicats on els resultats obtinguts de la investigació realitzada es troben a les seccions de la 2.1 a la 2.4 i es discuteixen globalment en el capítol 3.

Els resultats obtinguts en aquest estudi indiquen que O. anthropi DE2010 mostra una elevada resistència als cinc metalls assajats tolerant concentracions de fins a 20 mM de Zn i de 10 mM per a Cd, Pb(II), Cu(II) i Cr(III). A més, aquest bacteri té una gran capacitat per eliminar metalls del medi, captant fins a un 90% de Pb (II) i un 40% de Cr (III), ambdós a 10 mM. Analitzant la seqüencia del genoma d’O. anthropi DE2010 s’ha observat que presenta sis gens relacionats amb el metabolisme del polifosfat, i que l’anàlisi del contingut cel·lular de polyP indica que aquest bacteri el sintetitza i l’acumula de manera directament proporcional a la concentració de metall. D’altra banda, les cèl·lules d’O. anthropi DE2010 immobilitzen metalls pesants en grànuls i/o inclusions de polyP mitjançant tres patrons específics de localització subcel·lular: extracel·lularment en grànuls de polifosfat (Cu (II)); a l’espai periplasmàtic formant cristalls amb el fòsfor (Pb (II)), i intracel·lularment en inclusions de polifosfat (Pb (II), Cr (III) i Zn). Per tant, O. anthropi DE2010 genera respostes cel·lulars (estratègies de supervivència) específiques per a cada metall, com ara bioacumulació en el cas de Pb (II), Cu (II), Cr (III) i Zn, biosorció per al Cr (III) i Cd i biomineralització per al Pb (II). L’elevada resistència i la capacitat de segrestar metalls d’O. anthropi DE2010 posen de manifest el seu gran potencial com a possible agent bioremediador, especialment en zones contaminades per Pb i Cr.

La contaminación ambiental es una de las condiciones extremas que puede alterar los ecosistemas naturales y afectar a todos los organismos vivos. Entre los contaminantes ambientales, los metales tienen un papel relevante debido a su elevada toxicidad. De hecho, se puede considerar que los microorganismos que habitan zonas contaminadas por metales forman frecuentemente consorcios, lo que les permite desarrollar estrategias celulares para sobrevivir en presencia de metales evitando así sus efectos nocivos.

En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha aislado diferentes consorcios de microorganismos de los tapetes microbianos del delta del Ebro (Tarragona). Estos consorcios están formados por un único microorganismo fotótrofo y varios heterótrofos. En la presente tesis doctoral, a partir del consorcio donde domina la microalga Scenedesmus sp. DE2009, se ha aislado, caracterizado e identificado una bacteria heterótrofa como Ochrobactrum anthropi DE2010. En estudios preliminares, esta bacteria ha mostrado la capacidad para fijar nitrógeno atmosférico, presentar pleomorfismo celular y resistir a antibióticos del grupo de los betalactámicos. Aunque previamente se ha investigado el efecto de varios metales pesados en el consorcio Scenedesmus sp. DE2009, poco se conoce del efecto de estos en la viabilidad celular de O. antropi DE2010 y su papel en la captación de metales pesados.

Los objetivos de la presente tesis se han desarrollado teniendo en cuenta que O. anthropi DE2010 crece de manera fácil y rápida tanto en medio líquido como sólido, lo que permite considerarlo como modelo para la investigación frente a la toxicidad por metales pesados. Además, se ha analizado el efecto citotóxico y la capacidad de respuesta de O. anthropi DE2010 para superar el estrés frente a la exposición a Cd, Pb(II), Cu(II), Cr(III) y Zn así como los patrones de localización celular de estos metales y las estrategias empleadas por esta bacteria para inmovilizarlos. Esta tesis se ha organizado en diferentes capítulos. Concretamente, el capítulo 2 corresponde a los artículos publicados donde los resultados obtenidos se encuentran en las secciones de la 2.1 a la 2.4 y se discuten globalmente en el capítulo 3.

Los resultados obtenidos en este estudio indican que O. anthropi DE2010 muestra una elevada resistencia a los cinco metales ensayados tolerando concentraciones de hasta 20 mM de Zn y de 10 mM para Cd, Pb(II), Cu(II) y Cr(III). Además, esta bacteria tiene una gran capacidad para eliminar metales del medio, captando hasta un 90% de Pb (II) y un 40% de Cr (III), ambos a 10 mM. Analizando la secuencia del genoma de O. anthropi DE2010 se ha observado que presenta seis genes del metabolismo del polifosfato, y que el análisis del contenido celular de polyP indica que esta bacteria lo sintetiza y acumula de manera directamente proporcional a la concentración de metal. Por otro lado, las células de O. anthropi DE2010 inmovilizan metales pesados en gránulos y/o inclusiones de polyP mediante tres patrones específicos de localización subcelular: extracelularmente en gránulos de polifosfato (Cu (II)); en el espacio periplasmático formando cristales con el fósforo (Pb (II)), e intracelularmente en inclusiones de polyP (Pb (II), Cr (III) y Zn). Por lo tanto, O. anthropi DE2010 genera respuestas celulares (estrategias de supervivencia) específicas para cada metal, como bioacumulación en el caso de Pb (II), Cu (II), Cr (III) y Zn, biosorción para el Cr (III) y Cd y biomineralitzación para el Pb (II). La elevada resistencia y la capacidad de secuestrar metales de O. anthropi DE2010 ponen de manifiesto su gran potencial como posible agente bioremediador, especialmente en zonas contaminadas por Pb y Cr.

Environmental pollution remains as one of the extreme conditions that can disrupt the existing natural ecosystems and affect all the living organisms. Among the environmental stressors, metals play a significant role as potential toxicants. Consequently, it can be considered that the microorganisms inhabiting metal polluted areas frequently form consortia and they can develop cellular strategies to survive in the presence of heavy metals for avoid their negative effects.

In the last years, our research group has isolated different consortia of microorganisms from Ebro Delta microbial mats (Tarragona). These consortia are formed by a single type of phototrophic microorganism and different heterotrophic bacteria. In the present doctoral thesis, an heterotrophic bacteria from the consortium dominated by the microalga Scenedesmus sp. DE2009, have been isolated, characterized and identified as Ochrobactrum anthropi DE2010. In preliminary studies, this bacterium showed the ability to fix atmospheric nitrogen, present cellular pleomorphism and beta-lactam antibiotic resistance. Despite the effect of some heavy metals in the microalgae consortium had previously been investigated, nothing is known about the effect of them on the cell viability of O. anthropi DE2010 and the role of this bacterium in heavy metal sequestration.

The goals of this thesis have been developed taking into account the fact that O. anthropi DE2010 grows easily and fast in both liquid and solid media culture, which it becomes a suitable model for heavy metal experimental research. Thus, cytotoxic effects of heavy metals and cellular responses on O. anthropi DE2010 cultures exposed to increasing concentrations of Cd, Pb(II), Cu(II), Cr(III), and Zn, and the cellular metal localization patterns and the strategies and pathways used by this bacterium to immobilize them have extensively been analyzed. This thesis has been organized in different Chapters. Specifically, the Chapter 2 correspond to the published articles; thus, the obtained results from the research carried out are therefore in sections from 2.1 to 2.4 and are discussed globally in Chapter 3.

The results of this study indicate that O. anthropi DE2010 shows high resistance to the five tested metals, supporting concentrations up to 20 mM of Zn and up to 10 mM for Cd, Pb(II), Cu(II) and Cr(III). Moreover, this bacterium has a high ability to remove metals from the environment, highlighting up to 90% for Pb(II) and 40% for Cr(III) both at 10 mM. Analyzing the sequenced genome of O. anthropi DE2010 it has been observed that it presents six genes linked to the metabolism of the polyphosphate and that the analysis of polyP content indicates that this bacterium synthesizes and accumulates it in a metal concentration-dependent manner. O. anthropi DE2010 cells immobilized heavy metals in polyP granules and/or inclusions in three metal-specific patterns for subcellular localization: extracellular in polyphosphate granules (Cu(II)); in the periplasmic space forming crystals with phosphorus (Pb(II)), and intracellular in polyphosphate inclusions (Pb(II), Cr(III) and Zn). Therefore, O. anthropi DE2010 generates specific cellular responses for each heavy metal as survival strategies, such as bioaccumulation for Pb(II), Cu(II), Cr(III) and Zn, biosorption for Cr(III) and Cd and biomineralization for Pb(II). The high resistance and the capacity to uptake metals evidenced by O. anthropi DE2010 prove its great potential as a possible candidate to bioremediate, especially Pb and Cr polluted areas.