Integrated devices for the concentration and detection of waterborne bacteria

Abstract

La monitorització de la qualitat microbiana de l’aigua té com a objectiu protegir els consumidors de malalties causades pels patògens transmesos per ingestió, aspiració o contacte amb aigües contaminades. En les darreres dècades, la tecnologia dels biosensors s’ha postulat com una de les alternatives més prometedores per substituir els mètodes convencionals tediosos, voluminosos i que requereixen de llargs temps. No obstant això, la majoria de biosensors no tenen la capacitat de processar els grans volums d’aigua necessaris per a la regulació de la qualitat microbiana, que es tradueix en límits alts de detecció. En aquest sentit, el desenvolupament de dispositius capaços d’integrar la concentració de bacteris presents en grans volums d’aigua i la seva detecció esdevé un tema rellevant.

Aquesta tesi presenta el desenvolupament d’un dispositiu capaç d’utilitzar membranes de microfiltració com a suport de tots dos processos, el de concentració i el de detecció. El dispositiu consta d’una plataforma de concentració modelable, que es pot modificar segons les necessitats de detecció del bacteri objectiu. En aquet treball, s’han seleccionat tres microorganismes diferents com a possibles escenaris de treball del prototip de concentració i detecció. Escherichia coli ha estat seleccionada per la seva àmplia utilització com a bacteri model de la contaminació fecal, Legionella pneumophila, per la seva importància per a la salut i Shynechocystissp. com a cianobacteri model per el seu impacte en la salut i al medi ambiental.

Com és el cas de la majoria de bacteris, cal que Escherichia coli i Legionella pneumophila siguin etiquetats per detectar-los. Així, s’ha desenvolupat un immunoassaig sobre filtre que empra la membrana utilitzada per a la concentració, i també com a suport per a la immunodetecció. Tot i això, l’inconvenient més gran d’utilitzar membranes de microfiltració com a suport per a la immunodetecció és la unió inespecífica dels anticossos a la membrana, donant per tant, falsos positius. Així, s’han provat diferents materials de membrana, reactius de bloqueig de membrana i rentats d’anticossos per trobar la millor combinació per a la detecció ràpida de E. coli i Legionella.

La immunodetecció es realitza mitjançant anticossos marcats enzimàticament i un substrat colorimètric o redox, demostrat que el immunoassaig sobre filtre es pot combinar tant a mesures d’absorbància com a de cronoamperomtría. L’assaig complet triga 2 h reduint significativament el temps necessari pels mètodes convencionals (2-10 dies) i obtenint límits de detecció per sota dels 10 CFU·mL-1, cosa que podria permetre assolir els límits establerts per les normes de regulació.

El dispositiu desenvolupat també s’ha adaptat a la detecció de cianobacteris. Els cianobacteris contenen pigments capaços d’absorbir llum i emetre fluorescència de manera natural, actuant com a bioreceptors intrínsecs. Per tant, el dispositiu de concentració s’ha dotat d’elements òptics per a la detecció de cianobacteris sobre el filtre. S’ha implementat un díode emissor de llum (LED) per excitar la PhC i un detector que recull la seva emissió de fluorescència, a més d’integrar l’electrònica necessària per al seu control. El sistema desenvolupat és capaç de detectar concentracions de cianobacteris dins del nivell de vigilància establert per l’OMS en menys de 10 minuts fins i tot en mostres reals. A més, l’ús de components òptics miniaturitzats de baix cost ha permès obtenir un prototip portàtil i senzill adequat per a l’avaluació ràpida i in-situ de cianobacteris.

El rendiment i la versatilitat mostrats per la plataforma dissenyada i provada en aquesta tesi, ens permet preveure aquesta nova tecnologia com una alternativa ràpida i rentable per a la supervisió de la qualitat de l’aigua microbiana.

La monitorización de la calidad del agua tiene como objetivo proteger a los consumidores de enfermedad causadas por patógenos transmitidos por ingestión, aspiración (transmisión por aire), o contacto con aguas contaminadas. En las últimas décadas, la tecnología de biosensores se ha postulado como una de las alternativas más prometedoras para sustituir los métodos convencionales tediosos, voluminosos y que requieres largos tiempos de ensayo. Sin embargo, la mayoría de los biosensores carecen de la capacidad para procesar los grandes volúmenes de agua requeridos por las regulaciones actuales establecidas para calidad microbiana del agua, lo que se traduce en altos límites de detección. En este sentido, el desarrollo de dispositivos capaces de integrar la concentración de bacterias presentes en grandes volúmenes de agua, y su detección se convierte en un tema de relevancia.

Como es el caso de la mayoría de las bacterias, Escherichia coli y Legionella pneumophila requieren ser marcados para ser detectables. Por lo tanto, se ha desarrollado un inmunoensayo en el filtro, que emplea la membrana utilizada para la concentración, también como soporte para la inmunodetección. El mayor inconveniente del uso de membranas de microfiltración como soporte para la inmunodetección es la unión inespecífica de anticuerpos a la propia membrana, dando como resultado falsos positivos. Por lo tanto, se han probado diferentes materiales de membrana, reactivos de bloqueo de membrana y lavados de anticuerpos para encontrar la mejor combinación para la detección rápida de E. coli y Legionella.

La inmunodetección se lleva a cabo utilizando anticuerpos marcados enzimáticamente con horseradish peroxidasa (HRP) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. Por lo tanto, como TMB se usa ampliamente como sustrato colorimétrico o redox, se ha demostrado que el inmunoensayo desarrollado en el filtro se puede acoplar tanto a medidas de absorbancia como de cronoamperometría. El ensayo completo lleva 2 h, reduciendo significativamente el tiempo necesario para los métodos convencionales (2-10 días) y proporcionando un límite de detección inferior a 10 UFC·mL-1, lo que podría permitir alcanzar los límites establecidos por los estándares de regulación.

El dispositivo desarrollado también se ha adaptado para la detección de cianobacterias. Las cianobacterias contienen pigmentos capaces de absorber la luz y emitir fluorescencia de forma natural, actuando como biorreceptores intrínsecos. Además, el pigmento fotosintético ficocianina (PhC) permite distinguir las cianobacterias de las algas eucariotas. Por lo tanto, el dispositivo de concentración se ha provisto de elementos ópticos necesarios para la detección de cianobacterias en el filtro. Se ha implementado un diodo emisor de luz (LED) para excitar la PhC y un detector que recolecta su emisión de fluorescencia, además de integrar la electrónica necesaria para su control. El sistema desarrollado puede detectar concentraciones de cianobacterias dentro del nivel de vigilancia establecido por la OMS (<500 células·mL-1) en menos de 10 minutos, incluso en muestras reales. Además, el uso de componentes ópticos miniaturizados de bajo coste ha permitido el diseño y desarrollo de un prototipo simple y portátil para la detección y cuantificación rápida e in-situ de cianobacterias en muestras de agua. El rendimiento y la versatilidad demostradas por la plataforma de detección microbiana diseñada y probada en esta tesis, nos permite pensar en esta nueva tecnología como una alternativa viable hacia un sistema de detección rápido y rentable para la monitorización de la calidad microbiana del agua.

Microbial water quality monitoring aims to protect consumers from diseases caused by pathogens transmitted by ingestion, aspiration (air transmission), or contact with contaminated waters. In the last decades, biosensor technology has been postulated as one of the most promising alternatives to substitute the tedious, bulky, and long-time requiring conventional methods. Nevertheless, most biosensors lack the ability to process large water volumes required for current microbial water quality regulations, which is translated into high detection limits. In this regard, the development of devices able to integrate the concentration of bacteria present in large water volumes, and their detection becomes an issue of relevance.

This thesis presents the development of a device able to use microfiltration membranes as support for both processes, concentration, and detection. The device consists of a flexible concentration platform, which is modified according to the detection needs of the target bacteria. Herein, three different microorganisms have been selected as the work scenarios for the concentration/detection prototype. Escherichia coli has been selected for its extensive use as indicator of fecal pollution, Legionella pneumophila, for its health importance and Shynechocystis sp. as model cyanobacterium for their health and environmental impact.

As is the case of most bacteria, Escherichia coli and Legionella pneumophila require labeling in order to make them detectable. Thus, an on-filter immunoassay has been developed, employing the membrane used for concentration, also as the support for the immunodetection. The biggest drawback of using microfiltration membranes as support for immunodetection is the nonspecific binding of antibodies to the membrane, consequently giving false positives. Thus, different membrane materials, membrane blocking reagents, and antibody washings have been tested to find the best combination for both E. coli and Legionella fast detection.

The immunodetection is carried out using antibodies enzymatically labeled with horseradish peroxidase and 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) as substrate. Hence, as TMB is widely used either as colorimetric or redox substrate, it has been demonstrated that the developed on-filter immunoassay can be coupled to both absorbance and chronoamperometric measurements. The whole assay takes 2 h reducing significantly the time needed by conventional methods (2-10 days) and providing a detection limit lower than 10 CFU·mL-1, which could permit achieving the limits established by regulation standards.

The developed device has also been adapted to detection of cyanobacteria. Cyanobacteria contain pigments able to absorb light and emit fluorescence naturally, acting as intrinsic bioreceptors. Moreover, the photosynthetic pigment phycocyanin (PhC) allows to distinguish cyanobacteria from eukaryotic algae. Therefore, the concentration device has been provided with optical elements required for on-filter cyanobacteria detection. A light-emitting diode (LED) to excite PhC and a detector that collects its fluorescence emission have been implemented, in addition to integrating the electronics necessary for their control. The developed system is able to detect cyanobacteria concentrations within the vigilance level established by WHO (<500 cell·mL-1) in less than 10 min even in real samples. Moreover, the use of low cost miniaturized optical components has allowed the design and development of a portable and straightforward prototype suitable for fast and in-situ detection and quantification of cyanobacteria in water samples.

The performance and versatility shown by the microbial detection platform designed and tested in this thesis allows us to envision this new technology as a viable alternative towards a fast and cost-effective detection system for microbial water quality monitoring.