Circular RNAs : from host RNA molecules to novel broad-spectrum antivirals

Abstract

La rellevància clínica dels virus transmesos per mosquits, com el virus del dengue (DENV), el virus del zika (ZIKV), el virus del chikungunya (CHIKV) i el virus del Nil Occidental (WNV), ha augmentat dràsticament durant els darrers anys, provocant un problema de salut global. Actualment, no hi ha cap tractament disponible ni cap vacuna efectiva per tractar aquestes infeccions. Tots aquests virus causen infeccions agudes que han de ser tractades ràpidament després de l’aparició dels símptomes inicials perquè els medicaments siguin efectius. Tot i això, el diagnòstic precoç continua sent un repte no resolt. Això evidencia la necessitat de descobrir noves interaccions essencials entre el virus i la cèl·lula que podrien ser utilitzades com a noves dianes terapèutiques; i la necessitat de desenvolupar teràpies antivirals d’ampli espectre, eficients, que puguin ser administrades abans que s’aconsegueixi un diagnòstic precís. En aquesta tesi hem abordat aquests dos grans problemes centrant-nos en els ARNs circulars (circRNAs). Els circRNAs són una classe d’ARN generats a partir de progenitors lineals d'ARN mitjançant un mecanisme alternatiu de splicing anomenat back-splicing. En comparació amb els seus homòlegs lineals, els circRNAs són molt estables a causa de la seva resistència a les exonucleases. Actualment, s’ha descrit la implicació dels circRNAs en les infeccions virals, tanmateix, no es coneix el seu rol precís. El primer capítol de la tesi intenta respondre a aquest buit de coneixement utilitzant el virus de l’hepatitis C (HCV) com a sistema model i analitza l'efecte dels circRNAs identificats en altres virus de la mateixa família, en concret, els virus transmesos per mosquits. Mitjançant anàlisis de seqüenciació d’ARN, hem identificat 73 circRNAs cel·lulars induïts pel HCV. Aquest canvi en l’expressió dels circRNAs no pot ser explicat a través de canvis paral·lels en els ARNs lineals. A més a més, hem identificat que el silenciament de cinc d’aquests circRNAs provoca canvis en la infectivitat viral, actuant com a molècules pro- o anti- virals. Un d’aquests circRNAs, cPSD3, és clau per a la infectivitat del virus del dengue. El segon capítol de la tesi se centra en desenvolupament d’una nova plataforma basada en circRNAs que sigui versàtil, dificulti l’aparició de mutants resistents i permeti desenvolupar antivirals d’ampli espectre. En contrast amb altres teràpies basades en ARN, els circRNAs són molècules altament estables, una característica que simplificarà el seu ús terapèutic. Els circRNAs sintètics dissenyats contenen seqüències llargues que s’hibriden a regions del genoma viral implicades en formar estructures d’RNA essencials per a la supervivència del virus. Com a prova de concepte, hem validat amb èxit circRNAs que inhibeixen el HCV, el DENV, el CHIKV o el WNV. A més, hem generat circRNAs amb capacitat antiviral d’ampli espectre i hem optimitzat la producció in vitro d’aquestes molècules per obtenir quantitats elevades a baix preu. En conclusió, els nostres resultats (i) emfatitzen la complexitat de la interacció entre els circRNAs cel·lulars i els virus i (ii) descobreixen el gran potencial dels circRNAs artificials com a noves plataformes per al desenvolupament de fàrmacs.

The clinical importance of the mosquito-borne viruses, such as dengue virus (DENV), zika virus (ZIKV) chikungunya virus (CHIKV) and West Nile virus (WNV), has dramatically increased over the last years, resulting in a global health problem. Currently, there are no available treatments or effective vaccines to treat these infections. All these viruses produce acute infections that require to be treated early after the onset of the symptoms for drugs to be effective. However, an early diagnosis remains still as an unsolved challenge. This brings to the spotlight the need to uncover novel fundamental virus-cell interactions that could be targeted and to develop efficient broad-spectrum antiviral therapies that could be administered before an accurate diagnosis is achieved. In this thesis we addressed these two major concerns with a focus in circular RNAs (circRNAs). CircRNAs are a class of RNAs generated from linear RNA progenitors by an alternative splicing mechanism termed back splicing. They are highly stable relative to their linear spliced counterparts due to exonuclease resistance. Currently, cellular circRNAs are described to be involved in viral infections. However, their precise role is mainly unknown. The first chapter of the thesis addresses this intriguing issue using HCV as a model system and analyzing the effect of the identified circRNAs in mosquito-borne viruses that belong to the same viral group. By RNA-Seq analyses we identified 73 HCV-differentially expressed circRNAs whose changes could not be explained by parallel changes in linear mRNAs. Silencing of five selected HCV-induced up-regulated circRNAs altered viral infectivity, acting either as anti-viral or pro-viral molecules. Further characterization of one of the selected circRNAs, cPSD3, show, that it also impaired DENV infections. The second chapter focuses on the generation of a novel circRNA-based platform that is versatile, hampers the emergence of resistant mutants, and allows developing broad-spectrum antivirals. In contrast to other RNA-based therapies, circRNAs are highly stable molecules, a trait that will simplify their therapeutic use. The designed synthetic circRNAs contain long sequences that hybridize to multiple target sequences in the viral RNA genome involved in forming RNA structures essential for virus survival. As a proof of concept, we have successfully validated circRNAs that inhibit HCV, DENV, CHIKV or WNV. Furthermore, we have generated circRNAs with broad-spectrum antiviral capacity and optimized the production in vitro of these molecules to obtain high amounts at low price. In conclusion, our results (i) emphasize the complexity of the interaction between cellular circRNAs and viruses and (ii) uncover the great potential of artificial circRNAs as novel platforms for drug development.