Control of S-phase progression in response to stress

Abstract

In response to multiple internal and external stresses, yeast cells activate a common transcriptional response known as the Environmental Stress Response (ESR), which can be problematic in S phase, when DNA is being replicated. Stress-dependent transcription can be induced unexpectedly at any moment of the cell cycle and therefore cells need a dedicated mechanism to prevent transcription-replication conflicts (TRCs) and genomic instability under these circumstances in S phase. Upon osmostress, the Hog1 SAPK is activated and phosphorylates Mrc1, a protein of the replication complex, which delays replication progression, and prevents transcription-associated recombination (TAR) and genomic instability. In this thesis, we show that the Mrc1-mediated mechanism is a general mechanism that prevents TAR and genomic instability upon heat, oxidative and low glucose stresses. In an unbiased kinome screening, we identified Mpk1, Psk1 and Snf1 as kinases able to phosphorylate the same three sites of Mrc1 and play an analogous role to Hog1 in response to heat, oxidative and low glucose stresses respectively. Finally, we also found that Mrc1 function is not restricted to environmental stress but it also plays a role upon other internal stresses that compromise cell fitness and induce the ESR response, such as the slow growth or genomic instability itself. Therefore, this thesis establishes the basis of a general mechanism, which we named “Mrc1 transcription-replication safeguard mechanism (MTR)” that protects genomic integrity from unscheduled transcriptional outbursts triggered by either environmental or internal stresses.

Aquesta tesis descriu un mecanisme clau per a evitar la inestabilitat genòmica causada pels Conflictes entre la Transcripció i la Replicació (TRCs) en resposta a estrès. Múltiples vies de senyalització, com les Proteïnes Quinasa Activades per Estrès (SAPKs), s’activen per assegurar una resposta coordinada a l’estrès actuant sobre el metabolisme cel·lular, l’expressió gènica, la traducció de proteïnes i el cicle cel·lular. Alhora, en resposta a diversos estressos tant d’origen intern com extern, les cèl·lules de llevat activen una mateixa resposta transcripcional que es coneix com la Resposta a l’Estrès Ambiental (ESR) que els hi permet sobreviure i adaptar-se a la nova situació. L’activació transcripcional massiva que es dona en resposta a estrès pot ser problemàtica en fase S, quan l’ADN està alhora sent replicat. Durant la fase S, les cèl·lules minimitzen la interacció entre la transcripció i la replicació mitjançant diverses estratègies per evitar conflictes que podrien causar inestabilitat genòmica. Malgrat això, l’estrès pot activar la transcripció en qualsevol fase del cicle cel·lular i, per tant, les cèl·lules necessiten tenir un mecanisme dedicat a prevenir els TRCs i la inestabilitat genòmica. Anteriorment, vam descriure un mecanisme dedicat a prevenir els TRCs i la inestabilitat genòmica en resposta a estrès osmòtic en S. cerevisiae. Vam mostrar com, en resposta a estrès osmòtic, la SAPK Hog1 s’activa i fosforila Mrc1, una proteïna del complex de replicació. La fosforilació de Mrc1 alenteix la replicació i, a més a més, preveu la Recombinació Associada a la Transcripció (TAR) i la inestabilitat genòmica (Duch et al., 2013a). A part de l’estrès xiv osmòtic, altres estressos activen la resposta transcripcional ESR. Per això, l’objectiu principal d’aquesta tesis consisteix en explorar si el mecanisme que havíem identificat amb anterioritat era en realitat un mecanisme general que permet prevenir els TRCs en resposta a diversos estressos més enllà de l’estrès osmòtic. En aquesta tesis demostrem que el mecanisme descrit per Mrc1 és un mecanisme general que preveu el TAR i la inestabilitat genòmica en resposta a estrès tèrmic, oxidatiu i a baixa glucosa. Alhora, en un cribratge de totes les quinases del llevat, hem identificat les quinases Mpk1, Psk1 i Snf1 com a quinases capaces de fosforilar Mrc1 en els mateixos residus que anteriorment havíem descrit com a residus de Hog1. Aquestes quinases tenen la funció anàloga a Hog1 però en resposta a estrès tèrmic, oxidatiu i a baixa glucosa respectivament. Finalment, també mostrem com aquesta funció de Mrc1 no es limita a les respostes als estressos ambientals, sinó que també és important davant situacions que comprometen la estabilitat cel·lular i alhora indueixen la ESR, com per exemple en cèl·lules amb creixement lent o amb inestabilitat genòmica basal. Per tant, aquesta tesis estableix la base d’un mecanisme general, que proposem anomenar “Mrc1 transcription-replication safeguard mechanism (MTR)”, que manté l’estabilitat genòmica davant l’activació massiva i no programada de la transcripció causada tant per estressos ambientals com per estressos cel·lulars interns.