Role of the Hippo pathway in planarians

Abstract

A successful cell renewal, which occurs throughout the life of an organism, relies on multiple events, including proliferation and differentiation of progenitor cell populations, and death of unnecessary cells. Out of the multiple molecular mechanisms involved in the control of cellular renewal, the Hippo signaling pathway currently appears as a hub. Although it was first identified as a key regulator of organ size through the control of cell death and proliferation, growing evidence suggests that it also plays pivotal roles in coordinating stem cell maintenance, cell differentiation, cell-fate decisions and cell survival. To further understand the role of the Hippo pathway in driving adult cellular renewal and, specifically, in promoting cellular sternness, we studied its function in planarians. Due to the presence of a population of pluripotent adult stem cells (neoblasts), planarians have the ability to constantly grow and degrow depending on food availability, and to regenerate any missing body part within a few days. This active and continuous regulation of the stem cell and post-mitotic cell compartments makes planarians an ideal ' in vivo' context to gain an integrated view of the different events underlying homeostatic cell renewal and tissue regeneration. Here, we address whether downregulation of Hippo signaling exerts its sternness­ promoting function by increasing the proliferation of resident stem cells or promoting cell dedifferentiation. We show that inhibition of Smed-hippo (to simplify, hippo) in planarians reduces apoptotic activity and increases mitotic rates. However, this imbalance between cell death and mitotic activity does not lead to an increase in planarian body size or cell number, since hippo (RNAi) does not increase the number of cycling cells but blocks mitotic exit. hippo (RNAi) animals develop overgrowths and extensive regions composed of undifferentiated cells, accompanied by a general decrease in the number of differentiated cells throughout their body. A detailed study of the epidermal lineage reveals that hippo is required to determine the hierarchical transitions required for proper epidermal differentiation, from epidermal-restricted

stem cells to differentiated epidermal cells. We also demonstrate that hippo is required to maintain the differentiated state in planarian cells, since hippo inhibition promotes dedifferentiation of post-mitotic cells. Overall, these results in di cate that thE overgrowths and undifferentiated regions observed after hippo inhibition in planarians are not caused by the unbalance between cell death and proliferation but to the inability of cells to reach and maintain the appropriate fate. Furthermore, during this study we demonstrate that the Hippo-Yki signaling cascade is conserved in planarians and plays a role in cell differentiation during planarian regeneration. We further show the conservation of the up-stream regulators of the Hippo pathway in planarians since the inhibition of Hippo up-stream regulators, as lg/- 2, phenocopies the hippo (RNAi) phenotype. Transcriptomic analysis of hippo (RNAi) animals allowed the identification of several putative Hippo pathway targets in planarians, which silencing reproduces the formation of overgrowths. Overall, we propose an essential role for Hippo signaling in restricting cell plasticity and thus in preventing tumoral transformation.

La renovación celular, que tiene lugar durante toda la vida en los organismos adultos, depende de multiples eventos, incluyendo el control de la proliferación, la diferenciación de las celulas progenitoras y la muerte de células innecesarias. La vía de señalización de Hippo ejerce un papel central en el control de todos estos procesos. A pesar de haber sido primeramente identificada como una vía reguladora clave en el control del tamaño de los órganos a través de la regulación de la proliferación y la muerte, evidencias recientes sugieren que esta vía puede estar también involucrada en el mantenimiento de las células madre, en la diferenciación celular, en el mantenimiento del estado diferenciado y en la supervivencia de las células. Para profundizar en el conocimiento del papel de la vía de Hippo durante la renovación celular en tejidos adultos, específicamente en su función reguladora del estado pluripotente de las células, abordamos su estudio en planarias. Debido a la presencia de una población de células pluripotentes adultas, los neoblastos, las planarias poseen la capacidad de crecer y decrecer dependiendo de la disponibilidad de alimento, así como de regenerar cualquier parte de su cuerpo en apenas algunos días. Esta activa y continua regulación de las células madre y de los compartimentos postmitóticos convierte a las planarias en un contexto "in vivo" ideal para obtener una vision integrada de los diferentes mecanismos que controlan la renovación celular durante la homeostasis y la regeneración de los tejidos. En esta tesis hemos abordado la cuestión de si el silenciamiento de la vía de señalización de Hippo afecta a la promoción del estado indiferenciado, concretamente a través del control de la proliferación de células madre o bien promoviendo la desdiferenciación celular. Los resultados obtenidos demuestran que la inhibición de Smed-hippo (para simplificar, hippo) en planarias reduce la actividad apoptótica y aumenta los índices mitóticos. Sin embargo, este desequilibrio entre muerte celular y actividad mitótica no conduce al aumento del tamaño de las planarias ni al aumento del número de células. Uno de los motivos es que la inhibición

de hippo no aumenta el numero de células que ciclan si no que bloquea la salida de mitosis. Sin embargo, aunque no hay un incremento en el numero de células, el silenciamiento de hippo produce la aparición de sobrecrecimientos, precedidos por la aparición de amplias regiones compuestas por células no diferen ciadas, yla reducción del numero de células diferenciadas en todo el animal. El estudio detallado del linaje epidermico, demuestra que hippo es necesario para determinar las transiciones jerarquicas requeridas para una correcta diferenciación de las células epidermicas. Ademas, demostramos que hippo es necesario para mantener el estado diferenciado de las células, ya que su inhibición promueve la desdiferen ciación de células postmitóticas. En conjunto, estos resultados indican que los sobrecrecimientos y regiones indiferenciadas observadas despues de la inhibición de hippo no son causados por el desequilibrio entre la muerte celular y la proliferac ión sino por la incapacidad de las células adquirir y mantener su estado diferenciado. Ademas, durante este estudio hemos demostrado que la cascada de sena lización Hippo-Yki esta conservada en planarias y desempeña un papel fundamental durante la regeneración. También hemos visto que los mecanismos reguladores "up-stream " de la via Hippo parecen estar conservados en planarias, ya que la inhibición de algunos elementos, como lg/2, fenocopia el fenotipo de los animales hippo (RNAi). A su vez, el analisis transcriptómico de los animales hippo (RNAi) ha permitido identificar genes diana de la vía Hippo en planarias. El silenciamiento de algunos de estos genes candidatos también promueve la aparición de sobrecrecimientos. Para finalizar, nuestros estudios nos permiten proponer que el papel principal de Hippo en las planarias es restringir la plasticidad celular y así prevenir la transformación tumoral.