Estudio del gen YKT6 y miRNAs asociados en la liberación de exosomas en pacientes quirúrgicos de cáncer de pulmón

Abstract

En los últimos años los exosomas han emergido como importantes mediadores en el desarrollo de cáncer, demostrándose su utilidad como biomarcadores para diagnóstico y pronóstico de pacientes oncológicos. Los exosomas son vesículas extracelulares de entre 30-100nm de diámetro de origen endosomal que pueden favorecer diferentes procesos importantes en el progreso tumoral, como la modulación del microambiente tumoral, inmunosupresión y preparación del nicho premetastático. El estudio de la biogénesis y liberación de los exosomas se ha centrado principalmente en los mecanismos ESCRT y de proteínas Rab, postulándose también la importancia de las proteínas SNARE en estos procesos. YKT6 es una proteína SNARE que se ha descrito como necesaria para la liberación de exosomas en diferentes tipos celulares. Sin embargo el papel que podría tener en la liberación de exosomas en cáncer de pulmón no se había investigado. El trabajo realizado nos ha permitido investigar la importancia de YKT6 en el proceso de liberación de exosomas en líneas celulares, sus mecanismos de regulación mediante microRNAs (miRNAs), así como también evaluar el posible papel pronóstico en pacientes de cáncer de pulmón de célula no pequeña. En el estudio in vitro con la línea celular A549 de cáncer de pulmón observamos que la inhibición de YKT6 producía una disminución drástica en la liberación de exosomas. Además, identificamos y validamos miR- 34a, miR-134, miR-135a y miR-135b como miRNAs capaces de regular la expresión del ARNm de YKT6. El efecto de la sobreexpresión de miR-134 y miR-135b, los miRNAs que más efectivamente disminuían la expresión de YKT6 también provocaron una disminución en la liberación de exosomas en las células A549. En los pacientes de cáncer de pulmón de célula no pequeña observamos que la expresión de YKT6 estaba infraexpresada y que en contraste la expresión de los miRNAs miR-134 y miR-135b se encontraban sobrexpresados en tejido tumoral respecto al tejido normal. Aunque en el tejido tumoral no se pudo apreciar ninguna correlación negativa entre los miRNAs y la expresión de YKT6, en el tejido normal si que observamos la correlación negativa significativa entre miR-135b y la expresión de YKT6. El análisis de la expresión de YKT6 en las muestras tumorales de los pacientes resultó en la clasificación de los pacientes según niveles de expresión alto o bajo de YKT6, observándose un peor pronóstico en el grupo de pacientes con alta expresión en términos de una menor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad. Estos resultados indican que el estudio de los procesos de liberación de exosomas y sus posibles mecanismos de liberación, en este caso YKT6 a través de miRNAs, pueden ser de utilidad en cáncer.

Cancer-derived exosomes are involved in metastasis. YKT6 is a SNARE protein that participates in the regulation of exosome production and release, but its role in non- small cell lung cancer (NSCLC) has not been examined. This study has allowed us to investigate the importance of YKT6 in the process of releasing exosomes in cell lines, its mechanisms of regulation by microRNAs (miRNAs), as well as to evaluate the possible prognostic role in patients with non-small cell lung cancer . In the in vitro study with the lung cancer cell line A549, we observed that the inhibition of YKT6 produced a drastic decrease in the release of exosomes. In addition, we identified and validated miR-34a, miR-134, miR-135a and miR-135b as miRNAs capable of regulating the expression of YKT6 mRNA. The effect of overexpression of miR-134 and miR-135b, miRNAs that most effectively decreased YKT6 expression also led to a decrease in the release of exosomes in A549 cells. In non-small cell lung cancer patients we observed that the expression of YKT6 was underexpressed and that in contrast the expression of miRNAs miR-134 and miR-135b were overexpressed in tumor tissue compared to normal tissue. Although no negative correlation between miRNAs and YKT6 expression in the tumor tissue was observed, in the normal tissue, we observed a significant negative correlation between miR-135b and YKT6 expression. Analysis of YKT6 expression in patient tumor samples resulted in the classification of patients according to high or low expression levels of YKT6, with a worse prognosis in the group of patients with high expression in terms of lower overall survival and disease-free survival. These results indicate that the study of the exosome release processes and their possible release mechanisms, in this case YKT6 through miRNAs, may be useful in cancer.