Multiplex optical detection system for prosthetic joint infection diagnosis

Abstract

La infección de prótesis articular (IPA) es una patología de difícil manejo terapéutico que produce tanto morbilidad física como psicológica en los pacientes afectados y, además, está asociada con un impacto económico sustancial sobre el sistema sanitario. Su incidencia oscila entre 0.8 y 2.4% dependiendo de la articulación afectada, tales como la muñeca, el hombro, el codo, la rodilla o la cadera. A pesar de la baja incidencia de la IPA, el coste económico que se desprende ella es considerable (566M$ en 2009 para el sistema sanitario Americano). Por otro lado, un reconocimiento y manejo adecuados son críticos para preservar y restablecer la correcta funcionalidad de la articulación así como para evitar la morbilidad. Sin embargo, las infecciones crónicas tardías son difíciles de diagnosticar y normalmente están causadas por microorganismos que crecen en biopelículas. En ese estado, los microbios están protegidos contra agentes antimicrobianos así como de la respuesta inmune del huésped. Por lo tanto, una combinación de procedimientos complejos y de larga duración son necesarios para el diagnóstico de la IPA. Eso incluye, hallazgos clínicos, resultados de laboratorio de sangre periférica o líquido sinovial, datos microbiológicos, evaluación histológica del tejido periprotésico, inspección intraoperatoria y, en algunos casos, resultados radiográficos. Hoy en día, la técnica más usada para la identificación del agente infeccioso sigue siendo el cultivo celular. Desgraciadamente, esta técnica requiere entre 4 y 14 días para proporcionar un diagnóstico concluyente y dispone de una baja sensibilidad lo cual afecta al pronóstico de la infección. En este trabajo se desarrolló un dispositivo basado en partículas plasmónicas modificadas con anticuerpos o aptámeros y Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS) para la mejora del diagnóstico de la IPA. Dicho dispositivo fue capaz de identificar, con una sensibilidad por debajo de una unidad formadora de colonia, diferentes bacterias en un fluido biológico. Se obtuvo una detección simultanea y específica para cuatro agentes bacterianos (S. Aureus, E. Coli, S. Agalactiae y P. Aeruginosa). Para cada patógeno a identificar, se prepararon nanopartículas altamente eficientes en SERS con una combinación única de marcador Raman y anticuerpo/aptámero. Las partículas produjeron una señal Raman relativamente débil cuando estaban dispersas en el fluido. No obstante, cuando uno o más de los patógenos a identificar estaba presente, se produjo una acumulación de las nanopartículas asociadas sobre la membrana del microorganismo. Debido a ello, se formaron un numero considerable de “puntos calientes” en los que la señal Raman fue intensificada varios órdenes de magnitud (103) comparado con la señal que producían el mismo número de partículas dispersas en el fluido. De esta manera, la señal SERS fue lo suficientemente intensa para registrar cualquier agente bacteriano recubierto de nanopartículas que pasaba por el sistema de microfluidos. Este método fue capaz de monitorizar mililitros de diferentes fluidos biológicos (suero, sangre, orina y líquido pleural o ascítico) con un caudal de 0.1 mL/min. El estudio solo se realizó con cuatro patógenos pero el método de detección puede ser usado para la identificación simultánea de muchos otros microorganismos gracias al gran número de marcadores raman y anticuerpos/aptámeros selectivos disponibles. Por otro lado, pese a que el dispositivo aun no es capaz de discernir entre microorganismos resistentes o no resistentes, ofrece un diagnóstico preciso y en muy poco tiempo (menos de 15 minutos) comparado con los métodos de identificación comunes más usados (cultivo celular, reacción en cadena de polimerasa, ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas y analizador de tiempo de vuelo/desorción mediante láser asistida por matriz). Además, es capaz de monitorizar el efecto del tratamiento durante la evolución de la infección, aportando una herramienta muy útil para el correcto tratamiento de la IPA.

Prosthetic Joint infection (PJI) is a disease of difficult therapeutic management that causes significant physical and psychological morbidity on patients and is associated with substantial financial burden on the healthcare system. Its incidence oscillates between 0.8-2.4% depending on the affected joint such as wrist, shoulder, elbow, hip and knee. In spite of the relatively low incidence of PJI, the financial burden remains enormous (i.e., $566 million in 2009 alone to the American health care system). Appropriate recognition and management are critical to preserving or restoring adequate function and preventing morbidity. However, late chronic infections are challenging to predict and typically caused by microorganisms that grow in biofilms. In that state, microbes are protected from antimicrobial agents and host immune responses. Therefore, a complex and time-consuming combination of procedures is required for its diagnosis. They include clinical findings, laboratory results from peripheral blood and synovial fluid, microbiological data, histological evaluation of periprosthetic tissue, intraoperative inspection, and, in some cases, radiographic results. Nowadays, microbial culture remains the most widespread technique for identifying the infectious agent, but unfortunately it requires 4-14 days to provide a conclusive diagnosis and has low sensitivity, affecting the prognosis of the infection. In order to develop a fast, accurate, and inexpensive method to improve the diagnosis of PJI, a device based on antibody/aptamer-modified plasmonic nanoparticles and Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) spectroscopy was developed in this work. This device for infection diagnosis recognized, with sensitivity down to the single colony-forming unit, the presence of bacterial pathogens in biological fluids. The concept was confirmed with four bacterial agents (S. aureus, E. coli, S. agalactiae and P. aeruginosa). For each targeted pathogen receptor, high SERS efficient nanoparticles with a unique combination of a Raman label and an antibody/aptamer were prepared. The nanoparticles produced a relatively weak Raman signal when they are dispersed in a fluid. In contrast, the presence of one of the targeted pathogens triggered the accumulation of its partner nanoparticles on the antigen-carrying membrane of the microorganism, rapidly reaching full random coverage. Multiple gaps between nanoparticles are then formed that act as optical hotspots in which Raman scattering is enhanced by several orders of magnitude (103) relative to the same number of non-interacting nanoparticles. The resulting surface-enhanced Raman scattering signal is sufficiently intense as to record pathogen-specific inelastic light spectra from the nanoparticle-covered bacteria by driving the sample through a millifluidic channel. The method screened milliliters of different biological fluids (i.e., serum, blood, urine and pleural and ascites fluids) at a flow rate close to 0.1 mL/min. Although the concept was only confirmed with four bacterial agents, the detection method can be expanded to simultaneously identify more pathogens by using the large number of available spectral codes and selective antibodies/aptamers. On the other hand, this device is not yet capable of discerning directly in between resistant and non-resistant microorganisms, but it offers an accurate diagnosis in very short time (less than 15 minutes) as compared with all other currently available methods (i.e., cell culturing, matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight, polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay), and it can monitor the effect of the treatment on the time evolution of the infection.