Interacciones funcionales entre el receptor de melanocortinas 1, B-arrestinas y mahogunina

Abstract

El receptor de melanocortinas 1 (MC1R), un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) expresado en los melanocitos epidérmicos, es el principal determinante de las respuestas biológicas cutáneas a la radiación ultravioleta de origen solar. El gen MC1R es un gen de susceptibilidad al cáncer de piel bien establecido. La señalización por MC1R, que transcurre por la cascada del AMPc y la vía de las MAP quinasas ERK1 y ERK2, está estrechamente regulada por mecanismos generales comunes a todos los GPCRs, como los mediados por β-arrestinas (ARRBs), y mecanismos específicos como los dependientes de Mahogunina (MGRN1), una proteína que presenta en su secuencia un dominio “RING finger” característico de las E3-ubiquitina ligasas, así como señales de localización nuclear. Las ARRBs participan en la desensibilización homóloga e internalización de muchos GPCRs, mientras que MGRN1 compite con la proteína G por su unión a MC1R. La mutación mahoganoide, que inactiva el gen murino (Mgrn1), genera ratones de pelaje oscuro con una alta letalidad embrionaria y propensión al desarrollo de encefalopatías de tipo espongiforme. Con estos antecedentes, nos propusimos estudiar: i) el efecto diferencial de las principales isoformas de ARRB sobre la señalización dual del MC1R, ii) las consecuencias de la interacción ARRB-MC1R en las propias ARRBs, iii) la posible participación de MGRN1 como ligasa responsable de la ubiquitinación de ARRBs y iv) posibles dianas de MGRN1 responsables del fenotipo mahoganoide. Para abordar estos objetivos utilizamos melanocitos de ratón normales o mutados en Mgrn1 (obtenidos del ratón mahoganoide), células de melanoma humano y sistemas de expresión heteróloga, en los que se sobreexpresaron o silenciaron genes de interés y variantes de las proteínas objeto de estudio obtenidas por mutagénesis dirigida. La función del MC1R se analizó mediante ensayos de producción de AMPc, de activación de ERK1/2 y de unión de radioligandos para determinar la expresión de MC1R en la membrana plasmática. Los extractos celulares se analizaron por técnicas electroforéticas y transferencia Western. Para la búsqueda de dianas de MGRN1 hicimos uso de micromatrices de expresión de ARNm y PCR cuantitativa. La validación funcional de cambios en la expresión génica de algunos genes candidatos previsiblemente regulados por Mgrn1 se llevó a cabo por ensayos de proliferación y análisis del ciclo celular. Demostramos que tanto ARRB1 como ARRB2 interaccionan competitivamente con MC1R, aunque solo ARRB2 lo desacopla de la vía del AMPc e induce su internalización por un mecanismo independiente de clatrina y adaptina. Ninguna de las dos ARRB tiene efecto sobre la señalización mediada por ERKs. Como consecuencia de esta interacción, las ARRBs sufren poliubiquitinación dependiente de MC1R funcional expresado en la membrana plasmática, de forma independiente de agonista. Esta poliubiquitinación disminuye la funcionalidad de ARRB2, transcurre en su dominio C-terminal, implica a Lys400, y se relaciona con una proteólisis alrededor de la posición 170 que origina un péptido de 31 kDa. MGRN1 participa en la poliubiquitinación de las ARRBs y para ello necesita el dominio RING-finger funcional y la presencia de MC1R, que actúa como andamio molecular facilitando la formación de un complejo ternario ARRB-MC1R-MGRN1. Además, se produce una mono- o diubiquitinación en residuo(s) de lisina del dominio N-terminal de ARRB, asociada a una menor capacidad para interaccionar con MC1R. Por otra parte, Mgrn1 regula postraduccionalmente a tubulina β III (TUBB3), y su carencia en melanocitos mahoganoides altera la estructura de los microtúbulos. Además, Mgrn1 afecta a la expresión de múltiples genes reguladores del ciclo celular. Así, la falta de Mgrn1 provoca una parada del ciclo celular en fase S asociada a una tasa de proliferación significativamente menor. c-Myc y Creb1 podrían ser los principales factores de transcripción regulados por MGRN1 responsables de este efecto.

The melanocortin 1 receptor (MC1R), a G protein-coupled receptor (GPCR) expressed in epidermal melanocytes, is the main determinant of the cutaneous biological responses to solar ultraviolet radiation. The MC1R gene is a well characterized skin cancer susceptibility gene. MC1R signaling involves activation of the cAMP and the MAP kinase ERK1 and ERK2 pathways. These processes are tightly regulated by general mechanisms involving the β-arrestins (ARRBs) that act on most if not all GPCRs, as well as by specific mechanisms such as those dependent on Mahogunin (MGRN1), a protein containing the RING finger domain characteristic of E3-ubiquitin ligases and nuclear localization signals. The ARRBs mediate the homologous desensitization and internalization of many GPCRs, and MGRN1 desplaces the Gs protein from MC1R. The mahoganoid mouse mutation, which inactivates the Mgrn1 gene, causes a dark fur phenotype and is associated with high embryonic lethality and neurodegeneration with spongiform-like encephalopathy. With this in mind, our aims were to study: i) the differential effect of the main ARRB isoforms on dual signaling downstream of MC1R, ii) the consequences of the ARRB-MC1R interaction on ARRB structure, iii) the involvement of MGRN1 as an E3-ligase responsible for ARRB ubiquitination and iv) possible targets of MGRN1 accounting for the mahoganoid phenotype. To achieve these goals, we used cultured melanocytes from normal and mahoganoid mutant mice, human melanoma cells and heterologous expression systems. We overexpressed or silenced the genes of interest, as well as variants obtained by site-directed mutagenesis. MC1R function was assessed by cAMP production and ERK activation assays, as well as by radioligand binding experiments to determine MC1R cell surface expression. Cell extracts were analyzed by electrophoretic techniques and Western blotting. To identify MGRN1 targets, we used gene expression microarrays and quantitative PCR. Functional validation of changes in the expression of selected candidate genes likely regulated by Mgrn1 was carried out by cell proliferation assays and cell cycle analysis. We showed that whereas both ARRB1 and ARRB2 bind competitively to MC1R, only ARRB2 uncouples the receptor from the cAMP pathway and triggers its internalization by a mechanism independent on clathrin and adaptin. Conversely, neither ARRB has any effect on ERK-dependent signaling. As a result of the MC1R-ARRB interaction, the ARRBs undergo polyubiquitination in a process strictly dependent on the expression of functional MC1R on the plasma membrane, but independent on MC1R agonists. This polyubiquitination impairs ARRB2 function. It occurs in the C-terminal domain of the protein, it involves Lys400, and it is related with a proteolytic event near residue 170 which generates a 31 kDa polypeptide. In addition, the ARRBs likely undergo a mono- or diubiquitination in lysine residue(s) of the N-terminal domain of the ARRBs, associated with a lower affinity for MC1R. MGRN1 is involved in ARRB polyubiquitination in a manner dependent on a functional RING finger domain and on MC1R, which acts as a scaffold to enable the formation of an ARRB-MC1R-MGRN1 ternary complex. On the other hand, Mgrn1 acts to regulate at the post-translational level tubulin β III (TUBB3), and its downregulation in mahoganoid melanocytes dramatically alters the structure of the microtubules. Moreover, Mgrn1 has a profound effect on the expression on many cell cycle regulatory genes. Accordingly, lack of Mgrn1 impairs cell cycle progression through the S phase and is associated with a significantly lower rate of proliferation. c-Myc and Creb1 appear to be the main Mgrn1-regulated transcription factors responsible for this effect of Mgrn1.