Nuevas aportaciones al diagnóstico de las enfermedades causadas por las micobacterias

Abstract

Las micobacterias se pueden detectar por examen microscópico, por demostración de su ADN o rRNA específico tras amplificación del ácido nucleico correspondiente o por cultivo. Para aislarlas por cultivo, hace falta tratar las muestras con flora comensal (esputos, orinas, etc.) con diferentes sustancias, proceso llamado descontaminación.<br/>El objetivo de la Tesis ha consistido en evaluar: a) un nuevo método de descontaminación de muestras clínicas con C18-carboxypropilbetaína (CB-18) y compararla con el método de Tacquet-Tison, b) evaluar un sistema de amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Ligasa (sistema LCxMTB de Abbott, USA) con otro de amplificación de rRNA (AMTDT de Gen-Probe, USA) para detectar Mycobacterium tuberculosis en 74 biopsias pleurales parafinadas y c) comparar un nuevo medio de cultivo líquido no radiométrico (MB/BacT) con otro radiométrico BACTEC 12B y el medio sólido de Löwenstein-Jensen (L-J) para aislar micobacterias.<br/>Para evaluar el nuevo método CB-18 se procesaron 1201 muestras y se compararon los resultados con los obtenidos por el método de Tacquet-Tison. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la detección de micobacterias por tinción. Se aislaron un 14% más de micobacterias tras descontaminar con CB-18, diferencia estadísticamente significativa tanto para el total de micobacterias como para micobacterias ambientales. No hubo diferencias entre los métodos para aislar M.tuberculosis. Este bacilo se detectó 2 días antes tras descontaminar con Tacquet (13 d.) que tras CB-18 (15 d.) Hubo más contaminaciones en los medios de cultivo tras descontaminar con CB-18, predominando los estreptococos del grupo viridans, los estafilococos y las levaduras.<br/>Se analizaron 57 biopsias pleurales parafinadas (BPP) de pacientes con tuberculosis pleural y 17 BPP de pacientes sin tuberculosis. Las 70 BPP se desparafinaron con xileno, se digerieron con proteinasa K, se inactivaron a 95ºC, se centrifugaron a 13.000 rpm. El sobrenadante se usó para realizar ambas técnicas de amplificación según los protocolos recomendados por los fabricantes. La sensibilidad para detectar M.tuberculosis fue del 52,6% para el AMTDT y del 63,2% para el LCxMTB, diferencia no significativa. La especificidad de ambas técnicas fue del 100%. Utilizando ambas técnicas conjuntamente se alcanza una sensibilidad del 80,7%. La sensibilidad para diagnosticar tuberculosis pleural mediante la baciloscopia, el cultivo de esputos y de líquidos pleurales había sido del 73,7% y si se añaden los resultados obtenidos por las técnicas de amplificación se eleva hasta el 96,5%. Las reacciones de amplificación aportaron un 22,8% de diagnósticos adicionales de las tuberculosis pleurales.<br/>Para evaluar el nuevo sistema de cultivo de micobacterias MB/BacT se descontaminaron 600 muestras por el método de Tacquet-Tison. Se compararon los resultados con los otros sistemas de uso habitual. Se aislaron 79 cepas de M.tuberculosis y 27 cepas de micobacterias ambientales. Se aislaron el 92%, 91% y 94% de las cepas, respectivamente, en L-J, BACTEC 12B y MB/BacT. Al combinar dos de estos medios de cultivo se aislaron prácticamente todas las cepas. De las muestras baciloscopia-negativas se aislaron significativamente más M.tuberculosis en MB/BacT que en BACTEC 12B. Las micobacterias crecieron en una media de 11,7 días en BACTEC, 2,5 días más tarde en MB/BacT y 15 días después en L-J. Las contaminaciones fueron más frecuentes en el MB/BACT, debidas a bacterias gram-positivas, por lo que se recomienda la adición de 1 mcg/mL de vancomicina al MB/BACT.<br/>Se concluye que el método CB-18 es adecuado como sistema de descontaminación de muestras clínicas para aislar micobacterias, que ambos sistemas de amplificación tienen una sensibilidad intermedia para detectar M.tuberculosis en BPP y que MB/BacT es un medio de cultivo líquido, no radiométrico, menos laborioso y alternativa adecuada al BACTEC para el aislamiento de micobacterias de muestras clínicas.

Mycobacteria can be detected by means of a microscopic exam, by recognizing their specific DNA or rRNA after having amplified its nucleic acid or for culture. In order to isolate them for culture, samples with commensal flora (sputum, urine, etc.) have to be treated with different substances, in a process known as decontamination.<br/>The objective of this thesis was to evaluate: a) a new method of decontamination of clinical samples using C18-carboxypropylbetaine (CB-18) and compare it with the method of Tacquet-Tison, b) compare a system of amplification of DNA by ligase chain reaction (LCxMTB, Abbott, USA) with an amplification of rRNA (AMTDT, Gen-Probe, USA) to detect Mycobacterium tuberculosis in 74 paraffinized pleural biopsies and c) compare a new liquid non radiometric culture medium (MB/BacT) with the radiometric BACTEC 12B and with the solid medium Löwenstein-Jensen (L-J) to isolate mycobacteria<br/>In order to evaluate the new CB-18 method, 1201 samples were processed and its results were compared to those obtained using the method of Tacquet-Tison. There were no statistical differences in the detection of mycobacteria by Ziehl-Neelsen staining. A 14% more of mycobacteria were isolated after being decontaminated with CB-18, which represents a significant statistical difference not only for all kinds of mycobacteria but also for nontuberculous mycobacteria. No difference was noticed among the methods used for isolating M.tuberculosis. This species was detected 2 days before in samples decontaminated with Tacquet-Tison(13 d.) than in samples by CB-18 (15 d.). There were more contaminations in culture mediums decontaminated with CB-18 and there was a predominance of group viridans Streptococcus, Staphylococcus spp. and yeasts.<br/>Forty-seven paraffin-embedded pleural biopsies (PEB) from patients with plural tuberculosis and 17 PEB from patients without tuberculosis were analysed. They were deparaffinized with xylene, digested with proteinase K, inactivated at 95º and centrifuged at 13,000 rpm. The supernatant was used in both techniques of amplification according to the protocols recommended by the manufacturers. The sensitivities of the AMTDT and LCxMTB were 52.6% and 63.2%, respectively (not stadistically significant). The specificity of both techniques was 100%. A sensitivity of 80.7% was achieved by using both techniques together. In fact, the sensitivity when diagnosing pleural tuberculosis by means of Zeehl-Neelsen staining, the sputum culture and of pleural liquids had been of 73.7%. The overall diagnostic yield with both culture and amplification techniques was 96.5%, with amplification techniques adding 22.8% of the diagnosis.<br/>Six hundred samples were decontaminated by using the Tacquet-Tison method in order to evaluate the new culture system of mycobacteria (MB/BacT). Seventy-nine strains on M.tuberculosis and 27 of nontuberculous mycobacteria were isolated, 92%, 91% and 94% respectively in L-J, BACTEC 12-B and MB-BacT. By combining two of these mediums practically all of the strains were isolated. From the Ziehl-Neelsen negative samples more M.tuberculosis were isolated using MB/BacT than using BACTEC 12B. The average number of days to detection of a single mycobacterial isolates was 14.2 days for MB/BacT, 26.1 days for egg-based media and 11.7 days for BACTEC. The contaminations were more frequent in MB/BacT, owing to the gram-positive bacteria; that's why, it seems recommended to add 1 mcg/mL of vancomycin to the MB/BacT. <br/>We can therefore conclude firstly that the CB-18 method is appropriate as a system of decontamination of clinical samples in which mycobacteria are supposed to be found; secondly, that both systems of amplification have an intermediate sensitivity to detect M.tuberculosis in PEB and, finally, that the MB/BacT is a reliable, nonradiometric, less labor-intensive alternative to BACTEC 12B for recovery of mycobacteria from clinical samples.