Un model d'estrès oxidatiu en embrió de peix zebra. Aplicació per a l'avaluació de l'activitat protectora de substàncies antioxidants.

Abstract

L'estrès oxidatiu és el resultat del desequilibri entre la producció d'espècies reactives i l'activitat dels sistemes de defensa antioxidants. Les estratègies químiques i cultius cel•lulars utilitzats habitualment per a l'avaluació de l'activitat antioxidant de compostos presents en els aliments, no tenen la capacitat de predir clarament la seva eficàcia in vivo, ni de determinar els mecanismes d'acció pels quals actuen. L'embrió de peix zebra és un model animal que ha estat utilitzat per a l'estudi de processos oxidatius, ja que presenta gens i enzims antioxidants anàlegs als sistemes dels mamífers.

Els objectius de la tesi doctoral han inclòs el desenvolupament d'un model d'estrès oxidatiu basat en l'embrió de peix zebra per a l'avaluació de l'activitat antioxidant de diferents compostos i l'avaluació de l'efecte antioxidant in vivo i l'efecte neuroprotector de compostos polifenòlics presents en el vi negre, mitjançant el model d'estrès oxidatiu establert. Així mateix, s'han estudiat els efectes de l'estrès oxidatiu i d'alguns antioxidants en el model de neuroesferes humanes.

Primerament, s'han caracteritzat els efectes de diferents compostos inductors d'estrès oxidatiu en el creixement i el desenvolupament embrionari del peix zebra. La confirmació del mecanisme oxidatiu en els efectes observats en l'exposició als inductors d'estrès oxidatiu, s'ha realitzat mitjançant la modulació de la resposta a estrès oxidatiu amb compostos que poden augmentar o disminuir ('estatus antioxidant. Si el compost estudiat actua per un mecanisme d'estrès oxidatiu s'observen diferències estadísticament significatives en la comparació de les corbes concentració-resposta de la modulació i de l'exposició única als inductors d'estrès oxidatiu. S'han seleccionat els inductors tert-butil hidroperòxid (tBOOH) i 6- hidroxidopamina (6-ONDA) per a ser utilitzats en el model d'estrès oxidatiu. La verificació de la capacitat del model per a detectar l'efecte antioxidant dels compostos s'ha portat a terme amb diferents compostos amb activitat antioxidant coneguda. S'ha confirmat l'efecte antioxidant dels compostos estudiats i la capacitat del model d'estrès oxidatiu establert per a identificar efectes antioxidants in vivo. La identificació dels compostos polifenòlics presents en una mostra de vi negre desalcoholitzada i en una mostra d'homogenat d'embrions de peix zebra que havien estat exposats a aquesta s'ha realitzat mitjançant la tècnica HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. El model d'estrès oxidatiu amb tBOOH s'ha aplicat als compostos polifenòlics identificats amb major intensitat en la mostra de vi negre i s'ha observat un efecte antioxidant in vivo en tots ells. Els compostos polifenòlics de la mostra de vi negre també han produït un augment significatiu de la distància total recorreguda pels embrions i un augment significatiu del nombre de neurones dopaminèrgiques quan s'ha aplicat el model d'estrès oxidatiu amb 6-ONDA, indicant un efecte neuroprotector d'aquests compostos en els embrions de peix zebra.

Els efectes de la TCHQ com a inductor d'estrès oxidatiu i dels antioxidants hesperetina i kaempferol s'han estudiat en el model de neuroesferes humanes. La teoria de l'hormesi com a possible estratègia antioxidant, s'ha aplicat en les neuroesferes i s'ha observat que la pre-exposició d'aquestes a una concentració baixa de TCHQ protegeix enfront als efectes oxidants d'aquest compost en les neuroesferes. Així mateix, aquesta teoria s'ha reproduït en el model d'embrió de peix zebra. La pre-exposició dels embrions a una concentració baixa de TCHQ produeix un efecte protector hormètic antioxidant enfront als efectes oxidants d'aquest compost en els embrions de peix zebra. En resum, mitjançant la integració i combinació de diferents procediments experimentals, s'ha establert un model d'estrès oxidatiu en embrió de peix zebra que permet l'avaluació in vivo dels efectes antioxidants dels compostos i d'altres estratègies antioxidants. El model establert s'ha aplicat a l'avaluació dels efectes antioxidants i neuroprotectors de compostos polifenòlics del vi negre.

Oxidative stress is the result of an imbalance between reactive species production and antioxidant defence systems activity. Chemical strategies usually used for the evaluation of antioxidant activity are not able to predict antioxidant efficiency in vivo. The zebrafish embryo is a biological model which has been used in the study of oxidative processes. In the present work, an oxidative stress model in vivo based on the zebrafish embryo technique has been developed. The effects of oxidative stress inducers on the zebrafish embryo development have been characterised and its oxidative mechanism has been confirmed by strategies of modulation of the oxidative stress response. Tert-butyl hydroperoxide (tBOOH) and 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) were selected as the inducers to be used in the oxidative stress model. The capacity of the model to detect in vivo antioxidant effects of the compounds was performed with well-known antioxidant compounds. Polyphenolic compounds present in a red wine sample and in the homogenate of zebrafish homogenate were identified by the HPLC-LTQ-Orbitrap-MS technique. The compounds identified with major intensity were evaluated with the oxidative stress model and an in vivo antioxidant effect in all of them was established. The polyphenolic compounds also produced a neuroprotective effects in dopaminergic neurons and protected them against the neurotoxic effects of 6-OHDA. The human neurosphere model was applied to the study of the effects of oxidative stress inducers and antioxidants. The hormesis paradigm was studied and confirmed as an antioxidant strategy. Pre-exposure of neurospheres to a low concentration of an oxidative stress inducer protected against oxidant effects of the same compound at higher concentrations. This paradigm was also applied and confirmed in the zebrafish embryo model. In summary, an oxidative stress model using the zebrafish embryo model has been established with the integration and combination of different experimental procedures. This model allows the in vivo evaluation of antioxidant effects of compounds and other antioxidant strategies. It has been applied to the evaluation of antioxidant and neuroprotective effects of polyphenolic compounds present in a red wine sample.