Clues to the function of AWR effector proteins by expression on heterologous systems = Caracterització funcional de les proteïnes efectores AWR mitjançant l’expressió en sistemes heteròlegs

Abstract

The soil-borne plant pathogen Ralstonia solanacearum is the causing agent of bacterial wilt, a devastating disease of wide geographical distribution and host range with enormous economic impact worldwide. To cause disease, R. solanacearum injects a suite of type Ill effector (T3E) proteins into its hosts, from which only a few have been assigned a function, as it is the case for the T3E repertoires of other bacterial pathogens. Using yeast as a model system, we show that expression of the R. solanacearum awr type Ill effector family caused growth inhibition to different extents, and AWR5 displayed the most dramatic effect on yeast cells. Production of the full-length AWR5 protein in yeast targeted a cellular process leading to a growth inhibition and reduced cell size, but not involving an evident cell cycle arrest or cell death. Furthermore, we demonstrate that AWR5 is an inhibitor of TOR (target of rapamycin), a central regulator in eukaryotes that controls the switch between cell growth and stress responses in response to nutrient availability. Heterologous expression of awr5 in yeast caused autophagy induction coupled to massive transcriptomic changes, unmistakably reminiscent of TOR inhibition by rapamycin or by nitrogen starvation. The observation that deletion of two components of the PP2A heterotrimeric forms -CDC55 and TPD3- and mutation in SCH9 abolished the dramatic growth defect of cells expressing awr5 indicates AWR5 might exert its function by directly or indirectly inhibiting the TOR pathway upstream PP2A and Sch9. We speculate targeting of TOR pathways might be conserved among AWR2, AWR4 and AWR5, since their expression in yeast leads to similar downstream transcriptional responses. Also, we present evidence in planta that AWR5 T3E caused a reduction in TOR-regulated plant nitrate reductase activity and that the bacterial growth inhibition caused by delivery of AWR5 into host cells was mediated by TOR. Our work demonstrates that yeast is a powerful model for T3E function discovery and reveals not only a new mode of action for T3Es but also a new virulence target that might be conserved across kingdoms.

El patogen vegetal Ralstonia solanacearum és l'agent causant del marciment bacterià, una malaltia devastadora amb una àmplia distribució geogràfica i un extens ventall d'hostes que té un enorme impacte econòmic a nivell mundial. Per tal de causar malaltia, R. solanacearum injecta un conjunt de proteïnes efectores de tipus III (T3Es) als seus hostes. Tant a R. solanacearum com a altres patògens bacterians, pocs T3Es han sigut caracteritzats funcionalment. Utilitzant el llevat com a sistema model, demostrem que l'expressió de la família de T3Es awr provoca una inhibició del creixement de les cèl•lules del llevat en diferents graus segons l'efector, éssent AWR5 el que mostra l'efecte més dramàtic. L'expressió de la proteïna AWR5 en llevat resulta en la inhibició del creixement i la reducció de la mida de la cèl•lula, sense aturar el cicle cel•lular o la mort cel•lular. A més, hem demostrat que l'AWR5 és un inhibidor de la via TOR (target of rapamycin), un regulador central en eucariotes que integra els estímuls cel•lulars i prioritza creixement o resposta a estrés. L'expressió heteròloga d'awr5 en llevat causa una inducció de l'autofàgia acoblada a canvis transcriptòmics massius, que recorden a la inhibició de la via TOR per rapamicina o per manca de nitrogen. La fosfatasa PP2A i la kinasa SCH9 són dos components essencials de la via TOR. L'observació que la deleció de dos components de la forma heterotrimèrica PP2A -CDC55 i TPD3- i la mutació en SCH9 aboleixen els defectes de creixement en cèl•lules que expressen awr5 indiquen que AWR5 podria exercir la seva funció directa o indirectament mitjançant la inhibició de la via TOR, aigües amunt de PP2A i Sch9. En base als perfils transcripcionals d'AWR2 i AWR4, similars als d'AWR5, especulem que aquests efectors actuarien de forma similar, inhibint la via. També presentem evidència que l'AWR5 té un efecte sobre la via TOR in planta, ja que que aquest efector causa una reducció en l'activitat nitrat reductasa, regulada per la via TOR. A més a més, la inhibició del creixement bacterià causada pel lliurament d'AWR5 en les cèl.lules hostes també està mediada per TOR. El nostre treball demostra que el llevat és un model molt efectiu per descobir noves funcions dels T3Es i revela no només un nou mode d'acció per T3Es sinó també una nova diana de virulència que podria estar conservada entre els regnes biològics.