Caracterització de l’expressió de klotho en cervell durant l’envelliment. estudi dels efectes de la seva sobreexpressió / inhibició en el desenvolupament de dèficits cognitius associats a l’edat

Abstract

Tenint en compte que l’edat és el principal factor de risc per patir deteriorament cognitiu, elucidar si els factors que prolonguen la vida també poden prevenir, retardar o contrarestar la disfunció neuronal associada a l’envelliment o a processos neurodegeneratius esdevé un gran repte amb importants implicacions terapèutiques. Així doncs, en el context d’aquesta tesi centrada en la búsqueda de factors neuroprotectors per retardar la progressió del deteriorament cognitiu associat a l’edat, i en particular hem caracteritzat l’expressió de Klotho, un gen anti-­‐envelliment, en cervell. Per fer-­‐ho, s’ha estudiat el perfil d’expressió de klotho en cervell tant en condicions d’envelliment normal com en condicions patològiques. En aquest sentit, s’han analitzat els nivells d’expressió de les dos isoformes de klotho (m-­‐KL i s-­‐KL) en diferents àrees cerebrals: còrtex prefrontal, còrtex cerebral, hipocamp i cerebel. D’aquesta manera, s'ha pogut comprovar que durant l’envelliment cerebral fisiològic els nivells d'expressió de las dos isoformes de klotho es veuen reduïts significativament. També s'ha observat que aquesta disminució es veu accelerada en condicions d'envelliment patològic, gràcies als estudis fets en el ratolí 3xTg-­‐AD. A més, els resultats obtinguts suggereixen que donat que els nivells de klotho en aquest model es troben disminuïts significativament als 6 mesos d’edat, en etapes primerenques de la progressió de la malaltia, podria tenir un ús potencial com a biomarcador de diagnòstic precoç d'Alzheimer. Per contra, s'ha vist que l'exposició a uns hàbits de vida saludable, com la pràctica d’ exercici físic moderat continuat durant l’etapa adulta, alenteix la baixada en els nivells d’expressió de klotho en cervell. De manera important, per primer cop, s’ha detectat la proteïna secretada de klotho produïda per splicing alternatiu (s-­‐KL) utilitzant un nou anticòs dissenyat i generat en aquest treball (K113). S’ha pogut observar que malgrat l’mRNA de s-­‐KL s’expressa de manera similar en cervell que en ronyó, a nivell de proteïna s-­‐KL és 9-­‐10 vegades més abundant en cervell que en ronyó, suggerint que el seu paper principal és a SNC. És més, els resultats del nostre estudi mostren que s-­‐KL presenta un perfil d'expressió espacio-­‐temporal diferent del de m-­‐KL, suggerint que ambdues isoformes poden tenir funcions diferents en cervell. Per últim, s’han estudiat els efectes de la sobreexpressió/inhibició de klotho en SNC (utilitzant estratègies de teràpia gènica amb vectors adenoassociats de tropisme neuronal) sobre les capacitats cognitives de ratolins adults i ancians. . S’ha vist que la modificació dels nivells de les dues isoformes de klotho (m-­‐KL i s-­‐KL) també té efectes sobre els símptomes neuropsiquiàtrics associats a la demència (BPSD). A més, la sobreexpressió de klotho (sobretot m-­‐KL) també presenta un cert efecte ansiolític, i la seva inhibició, l’efecte contrari. Finalment, destacar que també s'ha pogut comprovar que, independentment de l’edat, la sobreexpressió de m-­‐KL i s-­‐KL permet millorar les capacitats cognitives dels animals en relació a la memòria de treball (T-­‐maze) i als processos d’aprenentatge i memòria espacial (Morris Water Maze). Aquests resultats suggereixen que Klotho podria ser una diana amb potencial terapèutic pel tractament dels dèficits cognitius associats a l’envelliment.

Given that the aging process is susceptible to change, and taking into account that age is the main risk factor for the development of age-­‐related cognitive decline, elucidate whether the factors that prolong lifespan also can prevent, delay or counteract neuronal dysfunction associated to aging or neurodegenerative processes becomes a challenge with important therapeutic implications. For this reason, we decided to focus in the search for neuroprotective factors to slow the progression of cognitive decline associated to aging , particularly we have analyzed and characterized Klotho brain expresion , an anti-­‐aging gene. To this end , we have studied Klotho expression profile in brain both in normal aging and in pathological conditions . In this regard, we have characterized the expression levels of the two isoforms Klotho (m-­‐KL and s-­‐KL ) in different brain areas : prefrontal cortex, cerebral cortex , hippocampus and cerebellum. Thus, we have seen that during physiological aging expression levels of the two Klotho isoforms in brain are significantly reduced. We have also found that this decrease is accelerated during pathological brain aging in our studies in the 3xTg -­‐AD micel. Since the levels of Klotho in this model are significantly decreased at 6 months of age, before b-­‐ amyloid plaques formation , Klotho could be used as a biomarker for early diagnosis of the disease Alzheimer. Conversely , exposure to healthy lifestyle habits , such as the practice of moderate continuois exercise during adulthood significantly slows the decrease in t Klotho levels in the brain. Importantly , for the first time, we have detected the secreted Klotho protein produced by alternative splicing (s-­‐KL) using a new antibody designed and generated in this work (K113). We have observed that despite s-­‐KL mRNA is expressed similarly brain and in kidney, at protein level, s-­‐KL is 9-­‐10 times more abundant in brain than in kidney, suggesting that its main role could be in Central Nervous System. Furthermore, the results of our study show that s-­‐ KL isoform presents a different spatio-­‐temporal expression profile from m-­‐KL, suggesting that both isoforms may have different functions in the brain. We have also studied the effects of Klotho overexpresion/ inhibition in CNS (using gene therapy strategies with AAV vectors with neuronal tropism) on cognitive abilities of adult and old mice. We have seen that modifying the levels of both Klotho isoforms (m-­‐KL and s-­‐KL) also has effects on neuropsychiatric symptoms associated with dementia (BPSD). Thus, its overexpression increased exploration activity in adult mice, while silencing it made animals become less active. In addition, overexpression of Klotho (especially m-­‐KL also has a certain anxiolytic effect, and its inhibition the opposite. Finally, it’s important to highlight that, regardless of the age, overexpression of m-­‐KL and s-­‐KL can improve cognitive abilities of animals in relation to both working memory (T -­‐ maze) and spatial learning and memory (Morris Water Maze). These results suggest that Klotho could be a potential therapeutic target for the treatment of age-­‐related cognitve impairments.