Litiasis renal oxalocálcica. Avances en la comprensión de su etiología y mejoras en la metodología analítica para su estudio

Abstract

La urolitiasis es una enfermedad común, que afectará al 12% de la población de la Unión Europea a lo largo de su vida, caracterizada por una alta prevalencia e incidencia, alta morbilidad y altas tasas de recurrencia. Hoy en día, se acepta un origen multifactorial para el proceso litógeno: el fenómeno central corresponde a la sobresaturación de diversos compuestos en orina que pueden cristalizar formando concreciones sólidas, influenciado por la escasez de inhibidores de la cristalización, la presencia de promotores de la precipitación y factores morfoanatómicos del aparato urinario.<br/>Las tasas de recurrencia a cinco años se sitúan entre el 44-75%, independientemente que el episodio litiásico se resuelva espontáneamente o mediante intervención urológica. Este hecho es debido a la persistencia de la alteración urinaria responsable de la formación del cálculo. Estas alteraciones son susceptibles de diagnóstico a través de la caracterización del cálculo y de la orina del paciente, y de tratamiento por modificaciones dietéticas o tratamiento farmacológico, disminuyendo así la agresividad de la enfermedad y, consecuentemente, el número de recurrencias. <br/>En el momento presente, los esfuerzos principales en el campo de la urolitiasis deberían dirigirse a reducir las tasas de incidencia y recurrencia de la enfermedad, especialmente si tenemos en cuenta los menores costes asociados a los tratamientos profilácticos y la prevención de la enfermedad en relación con los métodos de extracción de cálculos. En este sentido, se requiere un mejor conocimiento de la etiología litiásica y una mejor eficacia en el diagnóstico de las alteraciones litógenas. Bajo este contexto, los principales objetivos de la presente tesis incluyen el desarrollo de metodologías analíticas eficientes para la determinación de marcadores litógenos, la caracterización de las fluctuaciones diarias y estacionales de la composición urinaria en relación al riesgo litógeno y el efecto de varias sustancias químicas (y sus mezclas) sobre la cristalización de oxalato cálcico.<br/>Desarrollo de metodologías simples para el análisis de marcadores litógenos<br/>La evaluación adecuada de anormalidades urinarias en pacientes litiásicos es vital para el diagnóstico y tratamiento de la urolitiasis. Por tanto, el desarrollo de métodos analíticos más eficientes para la determinación de marcadores litógenos es crucial para la caracterización adecuada de la urolitiasis, especialmente si tenemos en cuenta los conocidos inconvenientes prácticos de algunos de los métodos existentes. Además, algunos parámetros urinarios (por ejemplo, fitato y pirofosfato) no son analizados de manera rutinaria, probablemente debido a la escasez de metodologías eficientes para su determinación, a pesar de que su conocimiento puede ser de valor para propósitos de diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. En este sentido, se identificó una necesidad de metodologías analíticas eficientes que ofrezcan información relevante sobre el manejo de la urolitiasis. <br/>La investigación en este campo se centró en 6 marcadores litógenos: oxalato, citrato ácido úrico, creatinina, fitato y pirofosfato. Los principales limitaciones asociadas a las metodologías existentes para estos analitos incluyen su carácter monocomponente, largos y tediosos tratamientos de muestra (requiriendo a menudo etapas como dilución, filtración, centrifugación, ajuste de pH, incubación, purificación, hidrólisis, derivatización...) con consecuentes largos tiempos de análisis, falta de especificidad o la necesidad de componentes especiales (enzimas) que pueden resultar caros en algunos casos (oxalato). El desarrollo de métodos más eficientes, con carácter multicomponente y, por tanto, de mayor rapidez incluyó un método para el análisis de metabolitos urinarios (oxalato, citrato, ácido úrico y creatinina) mediante la electroforesis capilar de zona y un método para la determinación de fitato y pirofosfato en orina mediante la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Los parámetros de validación fueron evaluados en ambos casos, indicando rangos lineales y límites de detección adecuados, ausencia de interferencias y buena exactitud y precisión, demostrando, por tanto, su aplicabilidad en el campo clínico. Las principales ventajas de estos métodos (facilidad de tratamiento de muestra, bajos requerimientos de reactivos y muestra, capacidad de análisis multicomponente, cortos tiempos de análisis y alta capacidad de tratamiento de muestra) hacen posible su implementación en laboratorios clínicos para un mejor diagnóstico de la enfermedad litiásica, siendo el principal inconveniente la limitada disponibilidad de la instrumentación requerida en laboratorios clínicos.<br/>Caracterización de fluctuaciones diarias y estacionales del riesgo litógeno<br/>En la segunda parte de esta tesis, el estudio de las fluctuaciones diarias y estacionales de la composición urinaria reveló importantes variaciones temporales, produciendo picos relevantes de riesgo incrementado de cristalización patológica de oxalato cálcico. En este sentido, la identificación de periodos de riesgo incrementado de litogénesis es de interés en diseño de tratamientos terapéuticos, encaminados a reducir la sobresaturación urinaria o incrementar la capacidad inhibidora de la orina, mediante cambios dietéticos o tratamiento farmacológico en la etapa en que pueden ser más efectivos. <br/>En relación con el curso circadiano, se encontraron fluctuaciones significativas en el sistema sobresaturación / promoción / inhibición de la orina, de especial relevancia en algunos parámetros íntimamente relacionados con la litiasis (volumen/h, calcio, oxalato, magnesio y fitato), que conducen a una variación del riesgo litógeno durante 24 horas. Se identificó un periodo de riesgo incrementado para la cristalización de oxalato cálcico durante el periodo de descanso nocturno, indicando, por tanto, que la orina de 24 horas no refleja de manera apropiada las propiedades de cristalización de la orina. Además, la aplicación de herramientas de análisis multivariable (análisis en componentes principales y análisis de conglomerados jerarquizados) a las orinas de 24-horas fraccionadas reveló que las orinas nocturnas pueden ser diferenciadas de la diurnas en función de su litogenicidad, indicando además cierta homogeneidad en la composición urinaria de dichas muestras. Ambos factores, litogenicidad naturalmente incrementada durante la noche y homogeneidad en la composición urinaria, sugieren que las orinas nocturnas pueden representar un espécimen más adecuado para la evaluación del riesgo de cristalización de oxalato cálcico.<br/>Con respecto a la fluctuación de la composición estacional de la orina, se encontraron variaciones remarcables que indican un mayor riesgo de cristalización de oxalato cálculo durante el periodo estival, provocado por una disminución de la diuresis, un aumento de la sobresaturación y la ausencia de una capacidad inhibidora incrementada. Estos resultados indican una necesidad de mantener unos niveles de hidratación adecuados durante el verano, así como incrementar la capacidad inhibidora de la orina por cambios dietéticos o tratamiento farmacológico en aquellos pacientes con gran riesgo de recurrencia. <br/>Efecto de varias sustancias (y sus mezclas) sobre la cristalización de oxalato cálcico<br/>En la tercera parte de esta tesis, se estudió el efecto de múltiples sustancias (y sus mezclas) sobre la cristalización de oxalato cálcico. Se utilizó un ensayo de riesgo litógeno para seguir la cristalización de oxalato cálcico en muestras de orina artificial en presencia de diversas sustancias (fitato, pirofosfato, citrato, sulfato de condroitina y algunos metales traza como Zn2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Pb2+, Al3+, Ni2+, Cd2+ y Mn2+), los cuales fueron ensayados en concentraciones fisiológicas. <br/>Algunas sustancias como fitato, pirofosfato, citrato y sulfato de condroitina demostraron su capacidad para reducir la cristalización de oxalato cálcico, tanto en muestras de orina artificial como orina natural litógena. <br/>Además se examinó la existencia de interacciones relevantes entre estas sustancias y sus efectos sobre la inhibición de la cristalización de oxalato cálcico, indicando que dichas interacciones entre los inhibidores y los cristales incipientes en orina pueden resultar en efectos sinérgicos, aditivos o negativos sobre la cristalización de oxalato cálcico. Los efectos sinérgicos se producen cuando sustancias con gran afinidad por el calcio (por ejemplo, mezclas de fitato y pirofosfato) son adsorbidos selectivamente sobre los sitios activos de cristalización de oxalato cálcico, distorsionando la superficie cristalina de manera más efectiva que el mero efecto aditivo de los inhibidores individuales. Los efectos negativos tienen lugar cuando una sustancia con gran afinidad por el calcio (fitato) se encuentra en presencia de altas concentraciones de otra sustancia con menor afinidad (citrato), resultando en un desplazamiento efectivo del primero de los sitios activos de cristalización de oxalato cálcico, disminuyendo así la inhibición total por debajo del efecto aditivo esperado. Finalmente, los efectos meramente aditivos parecen tener lugar cuando las sustancias involucradas en el proceso de inhibición tienen afinidades similares por los sitios activos de cristalización de oxalato cálcico y/o están presentes en orina en concentraciones que no exceden considerablemente entre ellas.<br/>Como consecuencia de los efectos relatados, puede concluirse que la capacidad inhibidora de la orina no puede ser asignada a la capacidad inhibidora de cada sustancia individual, sino también a las posibles interacciones entre estas sustancias en el medio complejo que constituye la orina, conteniendo cristales incipientes. En este sentido, las posibles abundantes interacciones de estas sustancias con otros componentes de la orina (formación de complejos, precipitación, quimisorción sobre la superficie cristalina, desplazamiento de la superficie cristalina...) pueden determinar la incapacidad de una determinada sustancia para influir sobre el desarrollo de una sal insoluble. Por ejemplo, las interacciones de concentraciones fisiológicas de citrato con el fitato urinario, pueden limitar la alta capacidad inhibidora potencial de éste, con la consiguiente desventaja en la prevención de la cristalización de oxalato cálcico. <br/>Por otro lado, se demostró que concentraciones fisiológicas de metales traza en orina no tienen una influencia significativa sobre la cristalización de oxalato cálcico. En este sentido, el catión Fe3+, que es el único metal traza que exhibe una alta capacidad inhibidora en concentraciones fisiológicas, es probablemente incapaz de actuar como inhibidor potente en presencia de concentraciones fisiológicas de citrato, como consecuencia del efecto negativo producido por mezclas de citrato y Fe3+, debido a la formación de complejos estables en solución sin actividad inhibidora. <br/>Dado el escaso conocimiento de estas interacciones, podemos afirmar que investigaciones futuras en este campo pueden contribuir a un mejor diseño de los tratamientos profilácticos basados en inhibidores. <br/>Evaluación de la orina nocturna como espécimen más apropiado para el estudio de la urolitiasis<br/>Finalmente, se llevó a cabo una evaluación preliminar de la eficacia del diagnóstico de alteraciones litógenas por parte de la orina nocturna, utilizada como espécimen urinario alternativo para el estudio de la urolitiasis. En este sentido, el principal objetivo de este trabajo fue obtener un esquema simplificado para un primer diagnóstico simple y exacto de alteraciones litógenas, superando, además, algunas de las limitaciones de los actuales esquemas basados en orinas de 24 horas. Así, las orinas nocturnas permitieron discriminar de manera efectiva los principales factores litógenos de la litiasis oxalocálcica, relacionados principalmente con la deficiencia de la capacidad inhibidora de la orina (bajas concentraciones de fitato, pirofosfato y citrato) para la litiasis de oxalato cálcico monohidrato y elevados valores de pH urinario y calciuria para la litiasis de oxalato cálcico dihidrato. Así, las orinas nocturnas parecen representar un espécimen urinario más apropiado para la evaluación del riesgo litógeno, pudiendo simplificar las investigaciones metabólicas en pacientes litiásicos, dada su fácil implementación en la práctica clínica. Las ventajas de la utilización de este espécimen hacen referencia a la mayor representatividad en relación con el riesgo litógeno y la facilidad de recogida de la muestra urinaria por parte del paciente. En este sentido, la implantación del análisis de la orina nocturna como herramienta de estudio rutinario de la litiasis requiere todavía una serie de estudios complementarios (actualmente en desarrollo), encaminados a establecer los nuevos valores de referencia para los factores litógenos, a extender el estudio a los otros principales tipos de litiasis (fosfatos cálcicos y ácido úrico) y a comparar la capacidad diagnóstica de las orinas nocturnas con el espécimen de orina de 24 horas. <br/>Las diferentes contribuciones de esta tesis pueden contribuir a un mejor conocimiento de la etiología litiásica y a un mayor eficacia del diagnostico de las alteraciones litógenas. Ambos factores pueden permitir aumentar la eficacia de la evaluación y seguimiento de la urolitiasis, con el objetivo final de reducir las tasas de recurrencia por adopción de las medidas preventivas más adecuadas.

Urolithiasis is a common disease, which will affect 12% of the European Union population along their life, characterized by high prevalence and incidence, high morbidity and high rates of recurrence. Nowadays, multifactorial origin is accepted for the lithogenic process: the main phenomena is the supersaturation of several compounds in urine that might crystallise forming solid concretions, influenced by the scarcity of crystallization inhibitors, the presence of crystallization promoters and morphoanatomic factors of the urinary tract. <br/>The recurrence rate during five years lies between 44-75%, independently that the lithiasic episode is being solved spontaneously or by urologic intervention. This fact is due to the persistence of the urinary alteration which causes the renal stone formation. Such alterations are susceptible to be diagnosed by calculi and urine characterization and treated by dietetic modifications, pharmacological treatment or both, decreasing the aggressiveness of the disease and, consequently, the number of recurrences.<br/>At the moment, main efforts in the urolithiasis field should be addressed to reduce incidence and recurrence rates, especially if we consider the lower costs associated to prophylactic treatments and prevention of this disease against to those of calculi extraction. In this sense, better understanding of lithiasic etiology and better efficacy in the diagnosis of lithogenic alterations are required to increase efficacy in the prevention of urolithiasis. Under this context, the main objectives of the present thesis include the development of efficient analytical methodologies for urolithiasis markers, the characterization of diary and stational fluctuations in urinary composition regarding lithogenic risk and the effect of various chemical substances (and its mixtures) on calcium oxalate crystallization. <br/>Development of simple analytical methodologies for urolithiasis markers<br/>Accurate evaluation of urinary abnormalities in lithiasic patients is known to have vital importance in the reliable diagnosis and treatment of urolithiasis. Thus, the development of more efficient analytical methodologies for urolithiasis markers is crucial for the accurate characterization of urolithiasis, especially if we consider the well-known drawbacks of some existing analytical methods. Moreover, some urinary parameters (i.e. phytic acid and pyrophosphate) are not routinely analysed probably because of the scarcity of efficient methodologies for their determination, despite its knowledge is most valuable for diagnostic and treatment purposes. In this sense, a need for efficient analytical methodologies offering relevant information for urolithiasis management was identified.<br/>Research in this field has been focused on 6 urolithiasis markers: oxalate, citrate, uric acid, creatinine, phytic acid and pyrophosphate. Main drawbacks associated to existing methodologies for these analytes include individual determination, large and tedious sample treatment (often requiring dilution, filtration, centrifugation, pH adjusting, incubation, purification, hydrolysis, derivatization.) with consequent large times of analysis, lack of specificity or the need of especial component (enzymes) which could be rather expensive in some cases (oxalate). The development of more efficient, multicomponent and, thus, faster analytical methodologies involved a method for analysis of urinary metabolites (oxalate, citrate, creatinine and uric acid) by capillary zone electrophoresis and a method for the determination of phytic acid and pyrophosphate in urine by inductively coupled plasma mass spectrometry. Validation parameters were evaluated in both cases, indicating appropriate lineal ranges and limits of detection, lack of interferences and good accuracy and precision, thus, demonstrating their applicability. Main advantages of these methods (ease of sample treatment, low requirements of reagents and sample amounts, multicomponent analysis capabilities, short times of analysis and high sample throughput, adequate accuracy and precision.) make feasible its implementation in clinical laboratories for a better diagnosis of urolithiasis illness, being the main associated drawback the limited (but increasing) availability of the required instrumentation.<br/>Characterization of diary and stational fluctuations in lithogenic risk<br/>In the second part of this thesis, the study of the diary and stational fluctuations of urinary composition revealed important temporal variations producing relevant peaks of increased risk for the pathologic crystallization of calcium oxalate. In this sense, the identification of periods with increased risk of lithogenesis is of interest in the therapeutic treatment design, by trying to reduce the supersaturation of urine or to increase the inhibitory capacity of given urine by dietary changes of pharmacological treatment at a stage when they could be more effective.<br/>With respect to circadian course, relevant fluctuations in the supersaturation / promotion / inhibition system for crystallization in urine, related with some of the urolithiasis-related measured urinary parameters (volume/h, calcium, oxalate, magnesium, phytic acid) were found, leading to a variation on the lithogenic risk during 24 hours. An increased risk period for calcium oxalate crystallization was identified at the nocturnal rest period, thus indicating that 24-hour urines do not reflect properly the crystallization properties of urine. Moreover, application of multivariate statistical analysis (PCA and HCA) to fractionated 24-h urines revealed that nocturnal urines can be differentiated from the diurnal ones by their lithogenecity, also indicating some homogeneity in urinary composition of such samples. Both facts, lithogenecity naturally increased at night and homogeneity in urinary composition, suggested that analysis of nocturnal urines can represent an objective for more appropriate evaluation of calcium oxalate lithogenic risk. <br/>With respect to stational fluctuation in urinary composition, remarkable variations were found indicating an increased risk of calcium oxalate crystallization in the summer period, provoked by both a decrease in diuresis with an associated increased supersaturation and a non-increased inhibitory capacity. These results indicate the need for both maintaining adequate hidratation levels during the summer and increasing the inhibitory activity of urine by dietary changes or pharmacological treatment in those patients with higher risks of recurrence.<br/>Effect of various substances (and its mixtures) on calcium oxalate crystallization<br/>In the third part of this thesis, the effect of several substances (and its mixtures) on calcium oxalate crystallization were studied. A test of urinary lithogenic risk was used to follow the crystallization of calcium oxalate from artificial urine in presence of several substances (phytate, pyrophosphate, citrate, chondroitin sulphate and some trace metals including Zn2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Pb2+, Al3+, Ni2+, Cd2+ y Mn2+), which were assayed in physiological concentrations. <br/>Several substances such as phytate, pyrophosphate, citrate and, chondroitin sulphate were proved to significantly decrease the calcium oxalate crystallization, both in artificial and natural lithogenic urines. However, the existence of relevant interactions between these substances and their effect on modulating the inhibition capacity of calcium oxalate crystallization were also examined, indicating interactions between different urinary inhibitors of calcium oxalate crystallization and incipient crystals in urine can result either in synergic, additive or negative effects on the overall inhibition of insoluble urinary salts. Synergistic effects occur when substances with high affinity for calcium (i.e. phytate + pyrophosphate mixtures) are selectively adsorbed on actives sites of calcium oxalate crystallization, disturbing the crystal surface more effectively than the mere additive effect of the individual inhibitors. Negative effects take place when a substance with high affinity for calcium (i.e. phytate) is in presence of high amounts of another substance with lower affinity (i.e. citrate), resulting in a effective displacement of the former from actives sites of calcium oxalate crystallization, thus decreasing the overall inhibition below the expected additive effect. Finally, merely additive effects seem to occur when the substances involved in the inhibition have similar affinities for actives sites of calcium oxalate crystallization and/or they are present in urine in concentrations that do not exceed considerably from each other. <br/>As a consequence of the related effects, it can be concluded that the crystallization inhibitory capacity of urine could not be assigned to the inhibitory capacity of each individual substance but also to the possible interactions between these substances in the complex media of urine containing incipient crystals. In this sense, the abundant likely interactions of this compound with other components of urine (complex formation, precipitation, chemisorption on crystal surface, displacement from crystal surface.) can determine the inability of a given substance to disturb the development of a specific insoluble salt. For example, the interactions of physiological concentrations of citrate with urinary phytate, can limit the high inhibitory potential of phytate, with the consequent disadvantage in prevention of calcium oxalate crystallization. <br/>On the other hand, physiological concentrations of trace metals in urine do not have a significant influence on calcium oxalate crystallization. In this sense, Fe3+, which is the unique trace metal that exhibit an intrinsic high inhibitory capacity of calcium oxalate crystallization at physiological concentrations, even increased by concomitant presence of phytate and pyrophosphate, is probably unable to act as a powerful inhibitor in presence of physiological concentrations of citrate, as a consequence of the negative effect produced for citrate and Fe3+ mixtures, due to the formation of highly stable complexes in solution without inhibitory activity.<br/>Because of the scarce knowledge of such interactions, further investigation in this concern will contribute to best assessment on designing prophylactic treatments with inhibitors. <br/>Evaluation of nocturnal urine as most appropriate urinary specimen for study of urolithiasis<br/>Finally, efficacy in the diagnosis of lithogenic alterations by the use of nocturnal urines as reference urinary specimen for study of urolithiasis was preliminary evaluated. In this sense, the main objective was to obtain a simplified scheme for a first simple and accurate diagnostic of urinary lithogenic alterations, also overcoming the known limitations of current schemes based on 24-hours urines. Nocturnal urines were able to effectively discriminate the main lithogenic factors of oxalocalcic lithiasis, mainly related to deficient inhibitory capacity (phytic acid, pyrophosphate and citrate concentrations) for calcium oxalate monohydrate and high urinary pH and high calciuria for calcium oxalate dihydrate. Thus, nocturnal urines can represent an objective for more appropriate evaluation of calcium oxalate lithogenic risk, that can be useful and suitable in diagnosing and monitoring of preventive therapy. This analysis, against the 24-hours urinalysis, can also simplify the necessary metabolic investigations in patients, being easy its implementation in clinical practice, with relevant advantages related to greater representativity with respect to lithogenic risk and easy of sample collection by the patient. In this sense, further study (now under development) is required before implementation of nocturnal urines for urolithiasis evaluation in order to establish new reference values for lithogenic risk assessment based on nocturnal urines, to extend the study to the other main kinds of lithiasis (phosphate and uric acid) and to compare the diagnostic power of nocturnal urines with respect to 24-hours specimens. <br/>The different contributions of this thesis could deserve for a better understanding of lithiasic etiology and better efficacy in the diagnosis of lithogenic alterations, both required to increase efficacy in the evaluation and monitorization of urolithiasis and to decrease incidence and recurrence rates by adoption of preventive measures.