Estudi del fenotip miofibroblast i la seva implicació en l'expressió de ciclooxigenasa-2 i en la secreció de prostaglandina E2 en la fibrosi pulmonar idiopàtica

Abstract

La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una pneumònia intersticial de causa desconeguda i de mal pronòstic, amb una supervivència mitjana de 2 a 5 anys des del moment del diagnòstic. La hipòtesi fisiopatològica més acceptada en l’actualitat és que una lesió reiterada a l’epiteli alveolar causaria l’apoptosi massiva de les cèl·lules epitelials, l’alliberament de factors solubles pro-fibròtics com el TGF-β1 i el descens de la producció de factors anti-fibròtics com la prostaglandina E2 (PGE2). En aquestes circumstàncies s’induiria la formació de focus fibroblàstics, formats per fibroblastes, miofibroblastes i matriu extracel·lular excessiva. La PGE2 prové de la via de l’àcid araquidònic a través dels enzims ciclooxigenasa (COX). La COX-2 és induïble per estímuls pro-inflamatoris com la interleuquina-1b (IL-1b). En primer lloc, vam obtenir un cultiu enriquit de miofibroblastes in vitro tractant fibroblastes primaris de pulmó humà control i amb FPI amb TGF-b1 durant 72h. En aquestes condicions es va induir la transició fibroblast a miofibroblast i també la transició epiteli-mesenquimal (EMT) en cèl·lules de la línia A549. Els cultius de miofibroblastes van presentar un increment en l’expressió d’alfa actina del múscul llis (α-SMA), proteïna característica d’aquest fenotip, i en la síntesi de col·lagen. Analitzant la capacitat de migració i proliferació d’aquestes cèl·lules realitzant una ferida al cultiu in vitro, vam observar que els cultius de miofibroblastes procedents de pacients amb FPI presentaven una capacitat invasiva superior als controls. Aquesta no era deguda a la proliferació, ja que la seva inhibició no comportava diferències. La proliferació dels miofibroblastes era baixa tant en cultius control com en FPI. Vam avaluar la capacitat de tancament d’una ferida in vitro per par d’aquestes cèl·lules i vam observar que els fibroblastes són el fenotip principal encarregat del tancament d’una ferida in vitro i que la proliferació és una component important en aquest tancament. Vam analitzar l’expressió de α-SMA, COX-2 i secreció de PGE2 en cultius control i FPI i en cultius enriquits de miofibroblastes. Els cultius FPI van presentar una major expressió d’α-SMA respecte els controls i alhora una menor capacitat d’inducció de l’expressió de COX-2 per part d’IL-1β. En els cultius enriquits de miofibroblastes, aquest efecte va ser encara més marcat, fins al punt de no haver-hi coincidència entre l’expressió de COX-2 i la d’α-SMA. La deficiència en la inducció de COX-2 va implicar una disminució de l’expressió de PGE2. Tot plegat va afectar a la capacitat de migració i proliferació d’aquestes cèl·lules. Els mateixos resultats es van observar en el fenotip tipus-miofibroblast procedent de la EMT de les cèl·lules epitelials A549. En tincions immunohistoquímiques de teixit normal i de FPI no vam observar coincidència entre el marcatge de COX-2 i d’α-SMA en els focus fibroblàstics. Així doncs, els resultats observats in vitro es corroborarien in vivo. Finalment, vam analitzar l’expressió del receptor d’interleuquina-1 tipus 1 (IL-R1) com a possible causa de la deficient inducció de COX-2 en aquestes cèl·lules. IL-1RI és el receptor específic pel qual la IL-1β realitza les seves accions pro-inflamatòries. Els fibroblastes FPI van presentar una menor expressió basal de IL-1RI en comparació amb els control. La IL-1β va ser capaç d’induir l’expressió del seu propi receptor. En miofibroblastes en canvi, el TGF-β va inhibir-ne l’expressió i va eliminar la capacitat d’inducció per part de la IL-1β. Així doncs, en un ambient pro-fibròtic, el TGF-β induiria de manera permanent la transició de fibroblastes i cèl·lules epitelials del pulmó cap a miofibroblastes. El fenotip miofibroblast estaria associat a una deficiència del receptor IL-1RI que impediria a la IL-1β induir l’expressió de COX-2 i la secreció de PGE2. La baixa PGE2 afavoriria la migració i proliferació d’aquestes cèl·lules i per tant la progressió de la fibrosi pulmonar. Aquest pot ser un mecanisme destacat en el manteniment de la FPI i presenta una possible diana terapèutica per aturar i arribar a reverir el procés fibròtic.

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an interstitial lung disease with bad prognosis and mean survival from 2 to 5 years from the diagnosis. The most accepted hypothesis of its cause is that a repeated epithelial lung damage would cause epithelial cells apoptosis and the release of pro-fibrotic factors, like TGF-b1 and the diminishing of anti-fibrotic factors, like prostaglandin E2 (PGE2). In this profibrotic environment fibroblast foci are formed by fibroblasts, myofibroblasts and extracellular matrix deposits. PGE2 is synthesized via cyclooxygenase enzimes, COX-1 and COX-2. COX-2 is inducible by several pro-inflammatory stimuli, for example IL-1b. We obtained an enriched myofibroblast culture treating primary fibroblasts obtained from control and IPF lung tissue with TGF-b1 during 3 days. This treatment induced an upregulation of aSMA expression, a myofibroblast associated protein, and collagen synthesis. It also induced epithelial to mesenchymal transition (EMT) in A549 epithelial lung cell line. Myofibroblasts obtained from FPI cultures showed increased migratory capacity in comparison with control ones. Proliferation associated with this phenotype was very low. We also measured the closure of an in vitro wound by these cell types and we observed that fibroblasts are actually the most important phenotype associated to wound healing, and not myofibroblasts. Moreover, we analized aSMA and COX-2 expression and PGE2 secretion in those cells. IPF cultures showed increased aSMA levels but decreased COX-2 induced expression by IL-1b. Myofibroblast enriched cultures also showed these features, also associated to a suppressed PGE2 secretion. Both in cell cultures and in tissue inmunohisochemistry no coincidence was observed between aSMA and COX-2 positive cells, associating myofibroblasts to an altered COX-2 and PGE2 metabolism. A549-derived myofibroblasts shared the ssame alterations. We analyzed IL-1 specific receptor IL-1RI in order to stablish if it was an stimuli-dependent alteration, and we observed that both IPF and myofibroblasts showed diminished IL-1R expression. IL-1b failed to upregulate its own receptor expression specifically in myofibroblasts. In the profibrotic environment, miofibroblast transition is chronically induced by TGF-b. Moreover this phenotype is associated to a downregulated IL-1RI expression and therefore IL-1b is uncapable of inducing COX-2 expression and PGE2 secretion, worsening migratory and proliferative features of these cells and contributing to fibrotic progression.