Polyunsaturated fatty acids in amyotrophic lateral sclerosis: role of DHA, peroxidative modifications and sexual dimorphism

Abstract

In the present work we focus into the potential relevance of PUFAs in some models and human samples from patients suffering amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Due to its pathological implication, oxidative stress was our first goal. We started from simple oxidative methodology screening to search for an antioxidant substance (among 21 different candidates) available in a Mediterranean diet. The results demonstrated high heterogeneity in carbonyl (measured by DNP) accumulation, regarding the oxidative source, substrate suffering it and the antioxidant structure. Further, thanks to GC/MS and LCQTOF, we detailed the protection over specific accrual of protein and lipid peroxidation markers as well as lipid profile modifications (as % of total fatty acids -FA) in oxLDL thanks to those dietary compounds. Moreover, we demonstrated its in vitro relevance, in terms of survival, when two cell lines (HMEC-1, HepG2) were treated with this oxidized (and protected) compounds, and finally address in vivo importance of those findings, demonstrating decreased carbonyl and oxidative accumulation in hamsters under an atherogenic diet supplemented with antioxidants. Once described the protective effect of antioxidants and specific signatures found regarding lipid oxidation markers, we extend the study focusing in different ALS samples. From previous work, we demonstrated an altered docosohexaenoic acid (DHA) composition in different location for patients suffering sporadic ALS. Hence, we though necessary to define whether the enzymatic machinery aimed to synthesize DHA from its precursors, are affected in sALS. Interestingly, we found a tissue specific variation (spinal cord vs cortex), compatible with our previous FA results. Further, thanks to inmunohistochemistry, differential involvement was unveiled for motor neurons (MN) and surrounding glia. Therefore, trying to depict cellular contribution, we switch to a neuronal model (N2A under oxidative stressors and/or aggregation-prone-TDP-43) and a tissular one (OT). There, we showed decreased desaturase (Δ6) and drebrin expression as well as increased DHA synthesis and an unreported inverse correlation of drebrin loss and aberrant p-TDP-43 expression under oxidative conditions in the cell culture. In the OT model, lipidomic analysis showed specific accretion of 8-iso-PGF2α and NPD1 as well as increased DHA (and dramatically decreased precursors) and reduced AA concentrations (GC measured). Analysis of slice O2 consumption showed decreased O2 levels under excitotoxic treatment and alleviation by antioxidant (tocopherol) addition. Treatment of OT slices with Ω-3 precursors (better than final products) and DHA plus tocopherol ameliorated MNs number. Finally, we wanted to disclose PUFA’s implication and phenothype of an animal model (SODG93A) under a dietary intervention with opposed FA unsaturation levels. Not surprisingly, FA profile was difficult to be altered in nervous system, although subtle specific variations were found. More importantly, differences in survival and clinical manifestations, UPR (Ubiquitin inclusions), mt-DNA (8- oxo-dG) and protein oxidative modifications revealed sex as a relevant factor in lipid handling for this model. Hence, whereas male under a low PUFA diet showed increased survival, females lack this beneficial outcome. Last but not least, we wanted to dig deeper regarding this sexual dimorphism. For this purpose, we focused in mitochondria and analyzed spinal cord oxygen consumption, oxidative damage to proteins and lipid profile along disease progression and also in a neuronal model (N2A overexpressing SODG93A, treated with 17β-estradiol).We could demonstrate a clear sexual implication, with females having late onset clinical symptoms concomitant to an upgraded mitochondrial function and lower protein and mitochondrial damaged proteins compared with males. Finally, to further confirmed steroid potential as a protective element in disease progression, in vitro estradiol pretreatmet of N2A showed increased oxygen consumption, with no relation with the mitochondrial complex expression.

En el trabajo que aquí se presenta se ha profundizado en la relevancia que los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) puedan tener en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Dada su implicación en el desarrollo de la patología, el estudio del estrés oxidativo asociado fue uno de nuestros primeros objetivos. Para ello hemos empezado por un cribado metodológico simplista, tratando de encontrar una sustancia antioxidante (entre 21), biodisponible en una dieta Mediterránea equilibrada y que fuese capaz de reducir un daño oxidativo generado desde diversos frentes (medido como acumulación de carbonilos) y sobre diferentes substratos. Los resultados demostraron una alta heterogeneidad, dificultando así la elección de un único antioxidante. Aún así, gracias a la GCMS y la LCQTOF pudimos detallar la acumulación específica diferenciada de marcadores de daño oxidativo proteico y daño lipoxidativo producido cuando partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son oxidadas bajo la acción de diversos compuestos. Además se pudo objetivar el cambio en la composición lipídica de estas LDL (medida como % del total presente) y su relevancia biológica in vitro, medida en términos de supervivencia, cuando se exponen a dos líneas celulares (HMEC-1, HepG2). Por último se demostró la importancia in vivo, puesto que se pudo observar una menor acumulación de productos carbonílicos en hámsters alimentados con una dieta aterogénica, pero suplementada con antioxidantes. Una vez se demostró el papel jugado por estos antioxidantes en la acumulación diferenciada de productos de oxidación, extendimos el estudio a muestras y modelos de ALS. En trabajos previos habíamos evidenciado una composición tisular diferenciada en diversas localizaciones del sistema nervioso en pacientes diagnosticados de ALS. Por ello consideramos interesante el estudio de la expresión de la maquinaria enzimática necesaria para la síntesis lipídica. De un modo destacado, pudimos ver de nuevo una variación tisular, compatible con niveles reducidos de docosohexaenoico (DHA), y gracias a la inmunohistoquímica también se observaron diferencias entre las motoneuronas (MNs) y la glia circundante. Así pues, para poder revelar las aportaciones diferenciales de los distintos tipos celulares, utilizamos una línea celular (N2A) a la que sometíamos a diferentes estresores (daño oxidativo y sobreexpresión de una versión de TPD-43 que causa agregados) y a un cultivo tisular de médula espinal (OT), dónde se produce una muerta progresiva y selectiva de las MNs. Tras estos experimentos, observamos un descenso tanto en la expresión de la Δ6 desaturasa como de drebrin (marcador presináptico) tras la sobreexpresión de TDP-43, así como una mayor síntesis de DHA y una correlación inversa entre la pérdida de drebrina y la expresión de pTDP- 43 bajo condiciones de estrés oxidativo. Por otro lado, en el modelo OT, el análisis lipidómico reveló la acumulación especifica de 8-iso-PGF2α y NDPD1 (posiblemente en respuesta a un incremento del daño oxidativo) así como el aumento en la concentración de DHA (con un descenso muy marcado de sus precursores) y el descenso de araquidónico. Quisimos analizar también el consumo de oxígeno, tanto en tejido intacto como permeabilizado, pudiendo observar como la excitoxicidad reducía considerablemente su capacidad y como ésta era, en parte, rescatada con el uso de tocoferol. Además, el tratamiento del OT con precursores Ω-3 mejoró también el número de MNs. Por último, quisimos caracterizar la implicación que los PUFA dietarios podrían tener en un modelo animal bien conocido (SODG93A). No fue sorprendente encontrar que el perfil lipídico en el sistema nervioso fue muy difícil de alterar. Aún así, se observaron diferencias en supervivencia, en el devenir clínico, la respuesta UPR (con acumulaciones de Ub), el daño al DNA mitocondrial (8-oxo-dG) y modificaciones oxidativas en las proteínas y cómo éstas tenían un grado de afectación diferencial cuando considerábamos el sexo de los animales. Esto es, mientras que los machos sometidos a una dieta baja en PUFAs de cadena larga demostraron una mayor supervivencia, en las hembras no se apreció mejoría. Por último, pero no menos importante, quisimos profundizar más respecto a este dimorfismo. Centrándonos en la mitocondria, pudimos hacer un seguimiento del consumo de oxígeno a lo largo de la enfermedad, el daño oxidativo a proteínas y el perfil lipídico. Por lo tanto pudimos demostrar una clara implicación sexual, siendo las hembras las que más tarde comienzan su manifestación clínica, con mejores funciones mitocondriales asociadas a un menor daño oxidativo. Finalmente, la relevancia del papel protector de los estrógenos se pudo comprobar in vitro, mediante el pretratamiento con 17β-estradiol en la línea N2A que sobreexpresa SOD1G93A, relacionado con la ALS familiar, proponiéndose el estradiol como un nuevo elemento que juega un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad.

En aquest treball s’ha intentat profunditzar en la possible rellevància dels àcids grassos poliinsaturats (PUFA) en el tractament de l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA). Atesa la seva implicació en el desenvolupament de la patologia, l’estudi de l’estrès oxidatiu associat fou un dels primers objectius. Per això, es va començar amb un cribratge metodològic simplista, intentant trobar una substància antioxidant biodisponible en una dieta mediterrània equilibrada i que fos capaç de reduir el dany oxidatiu generat des de diferents fronts i sobre diferents substrats. Els resultats van demostrar una alta heterogeneïtat, dificultant així l’elecció d’un únic antioxidant. Malgrat això, mercès a tècniques de GC-MS i LC-QTOF, es va poder detallar l’acumulació específica diferenciada de marcadors de dany oxidatiu proteic i dany lipoxidatiu produït quan partícules de lipoproteïna de baixa densitat (LDL) s’oxiden per l’acció de diversos compostos. A més, es va poder objectivar el canvi en la composició lipídica d’aquestes LDL i la seva rellevància in vitro, mesurada en termes de supervivència, quan es cocultiven amb les línies cel·lulars. Per últim, es va demostrar la importància in vivo, atès que es va observar una menor acumulació de productes carbonílics en hàmsters alimentats amb una dieta aterogènica suplementada amb antioxidants. Un cop es va demostrar el paper d’aquests antioxidants en l’acumulació diferenciada de productes d’oxidació, es va estendre l’estudi a mostres i models d’ELA. En treballs previs s’havia evidenciat una composició tissular diferenciada en diverses localitzacions del sistema nerviós central en pacients d’ELA (respecte l’àcid docosahexaenoic (DHA), depleció en medul·la espinal i acumulació en còrtex). Per aquesta raó es va considerar interessant l’estudi de l’expressió de la maquinària enzimàtica necessària per la síntesi lipídica. D’una manera destacada, es va poder veure de nou una variació tissular, compatible amb nivells reduïts de DHA i, per tècniques d’immunohistoquímica, es van observar diferències entre les motoneurones i la glia circumdant. Per tant, per poder revelar les aportacions diferencials dels diferents tipus cel·lulars, es va utilitzar la línia cel·lular N2A, sotmesa a diferents estressos (dany oxidatiu i sobreexpressió d’una forma de TDP-43 que causa agregats) i un cultiu tissular de medul·la espinal, en el que es produeix una mort progressiva i selectiva de les motoneurones. Es va observar un descens en l’expressió de FADS2 i de drebrina, un marcador sinàptic, així com una major síntesi de DHA i una correlació inversa entre la pèrdua de drebrina i l’expressió de TDP-43 sota condicions d’estrès oxidatiu. Per altra banda, en el model organotípic, l’anàlisi lipidòmica va revelar l’acumulació específica de 8-isoPGF2α i NDPD1, així com l’augment de la concentració de DHA i el descens motl marcat del seus precursors a mes del àcid araquidònic. Es va mesurar també el metabolisme oxidatiu, observant-se que l’excitotoxicitat reduïa considerablement la seva capacitat i, en part, es rescatava amb l’ús de tocoferol. A més, el tractament dels cultius organotípics amb precursors d’àcids grassos n-3 va millorar el nombre de motoneurones. Per últim, es va caracteritzar la implicació dels PUFA dietaris en un model animal d’ELA. Malgrat que el perfil lipídic del sistema nerviós central era difícil d’alterar, es van observar diferències en supervivència, fenotip clínic, resposta al malplegament de proteïnes (UPR) amb acumulació d’ubiquitina, dany en el DNA mitocondrial i modificacions oxidatives en les proteïnes, amb un grau d’afectació diferencial quan es considerava el sexe dels animals. En aquest sentit, mentre que els mascles sotmesos a una dieta baixa en PUFA de cadena llarga van mostra una major supervivència, en les femelles nomes va apreciar cap efecte millora. Per profunditzar en el dimorfisme sexual en ELA, i especialment la disfunció mitocondrial, es va analitzar mitjançant respirometria d’alta resolució la medul·la espinal durant tot el desenvolupament de la malaltia. Es va revelar una clara diferència de gènere, amb una manifestació clínica més tardana en femelles que correlaciona amb una millor conservació de la funció mitocondrial i un menor dany oxidatiu. El possible paper protector dels estrògens es va demostrar in vitro mitjançant el pretractament amb estradiol de cèl·lules N2A que sobreexpressen una forma de SOD1 humana mutada associada a l’ELA familiar (G93A-SOD1).