Patró de metilació d'un panell de biomarcadors en l'adenocarcinoma pulmonar

Abstract

El desenvolupament del càncer de pulmó de cèl•lula no petita (CPCNP) és un procés amb múltiples etapes en el qual s’acumulen tant alteracions genètiques com epigenètiques. Com alteració epigenètica la metilació de “novo” dels promotors gènics es pot utilitzar com a eina de diagnòstic, factors pronòstics, i com a marcadors predictius de resposta al tractament. Per estudiar l’estat de metilació, els mètodes basats en la PCR són els més utilitzats en l’estudi d’un sol locus. No obstant això, la majoria d’aquests mètodes està subjecte a la conversió del DNA per Bisulfit sòdic, afectant al rendiment de l’amplificació i comportant una conversió incompleta del DNA i comportant falsos positius. Aquest fet fa que la translació a la pràctica clínica d’aquestes metodologies es vegi dificultada per la incertesa associada a la metodologia emprada. Però malgrat això, la prospecció de biomarcadors en aquest àmbit ajudarà a discernir el perquè alguns malalts amb adenocarcinoma pulmonar (ADC) estadi I es curen amb la cirurgia, mentre d’altres tenen una alta probabilitat de recidiva.

En aquesta tesi hem realitzat la nostra tècnica d’anàlisi amb un anàlisis de PCR amb dues etapes combinant-la amb un disseny específic dels primers a utilitzar. Aquesta metodologia, que hem anomenat “Bisulfite Specific – Melting Curve Analysis (BS-MCA)”, ofereix una elevada sensibilitat sense comprometre la especificitat i permet eliminar el fals positiu que es produeix per conversions incomplertes mitjançant el Bisulfit sòdic. A través d’aquesta tècnica hem avaluat un panell de marcadors de metilació en l’ADC establert per diferents gens supressors de tumors (p16, CDH13, IGFBP3, RASSF1A, APC i TMS1) i de miRNAs (miR-148a i miR-34b/c) associats a l’aparició de metàstasis, sobre una sèrie retrospectiva de biòpsies d’ADC corresponents a diferents estadis de la malaltia. Demostrant arrel dels resultats obtinguts que la presència d’hipermetilació en els promotors de miR-34b/c i CDH13 s’associa a la agressivitat tumoral en ADC per al conjunt dels estadis i que l’estat d’hipermetilació de miR-34b/c sol o en combinació amb miR-148a és un marcador molecular pronòstic independent en els ADC d’estadis I i II.

The non-small cell lung cancer (NSCLC) development is a multi-stage process where the genetic alterations accumulate as much as epigenetic. As an epigenetic alteration, the “de novo” methylation of the genes promoters can be useful as a diagnostic tool, prognosis factor and a predictive marker for treatment response. The PCR-based methods are the most used in order to assess the methylation status of a single locus. Despite this, most of these methods are subject to the DNA conversion by the Sodium bisulfite which affects the performance of the amplification and this fact can entail an incomplete DNA conversion and involves false positives. This means that the translation of these methods to the clinical practice is hampered by the associated uncertainty of the methodological approach. However, the biomarker research in this field would help to discern why some patients with lung adenocarcinoma (ADC) stage I are recovered with surgery while others have a high probability of relapse.

We have based our assessment method on a two-steps PCR combined with a specific design of primers that offers a great sensitivity without compromising the specificity. This method, which we named "Bisulfite Specific – Melting Curve Analysis (BS-MCA)", avoids the false positive results which occur by the incompletes conversions for Sodium bisulfite. Through this technique we evaluated a panel of methylation markers in ADC conformed by different tumor suppressor genes (p16, CDH13, IGFBP3, RASSF1A, APC and TMS1) and miRNAs (miR-148a and miR-34b/c) related to the appearance of metastases. The sample set was comprised by a retrospective series of ADC biopsies that correspond to different stages of the disease. We have demonstrated across our assessment that the presence of hypermethylation in the promoters of miR-34b/c and CDH13 is associated with tumor aggressiveness in ADC for all the stages and that the hypermethylation status of miR-34b/c single or in combination with miR-148a is an independent prognostic marker in ADC on stages I and II.