Caracterización del lipopolisacárido de

Abstract

El género Aeromonas está constituido por bacilos Gram negativos y comprende patógenos de animales poiquilotermos y oportunistas en humanos. El lipopolisacárido (LPS) es un importante factor de virulencia de Aeromonas hydrophila, por lo que se planteó hallar los genes implicados en la biosíntesis del núcleo del LPS de la cepa AH-3. Con este fin, se aislaron tres mutantes por inserción del transposón mini-Tn5::Km1 con un fenotipo alterado del núcleo, lo que permitió la caracterización de tres regiones wa genómicas distintas. La construcción de mutantes en los genes en los que fue posible y la elucidación de la estructura química de su núcleo mediante ESI MS y el análisis de metilación de los monosacáridos, permitió, junto con el análisis fenotípico del LPS mediante SDS-PAGE y los datos obtenidos a partir de su secuencia y de ensayos de complementación, asignar funciones a cada uno de ellos. Las regiones 2 y 3 wa, constituidas por 4 y 2 genes, respectivamente, codifican las enzimas para la biosíntesis del núcleo interno. La región 1 wa contiene 7 genes que codifican la epimerasa HldD, la ligasa del antígeno O WaaL y las transferasas para la biosíntesis del núcleo externo y la incorporación de la L,D-HepIV. Además, se estudió la distribución de distintos genes del núcleo y se observó su elevada conservación entre diferentes serotipos de Aeromonas mesófilas.<br/>Por otro lado, se realizó el análisis y la caracterización funcional de algunos de los genes de la agrupación wb de la cepa AH-3 responsable de la biosíntesis del antígeno O:34, obtenida en un estudio anterior. Consta de 17 genes entre los que se incluyen genes para la biosíntesis de GDP-manosa y dTDP-6-desoxi-L talosa y para la transferencia de sus monosacáridos, para la modificación del antígeno O con acetilaciones, para el inicio de la síntesis de las subunidades O (wecA), su transporte (wzx) y su polimerización (wzy), y para la determinación de la longitud de la cadena (wzz). La región promotora del gen wzz, localizada en función de la determinación de su inicio de transcripción por 5'RACE, presentaba una regulación por temperatura, de manera que el nivel de transcripción/expresión del gen era menor a 37ºC que a 20ºC, según los ensayos de RT-PCR semicuantitativa y de la actividad &#946;-galactosidasa de la fusión transcripcional de la región promotora con el gen indicador lacZ.<br/>Este hecho ofrece una explicación a la diferente producción del LPS que presenta la cepa AH-3 a ambas temperaturas.

<I>The genus Aeromonas is composed of Gram-negative rod-shaped bacteria and comprises opportunistic and primary pathogens of poikilothermic and homeothermic animals, including humans. The lipopolysaccharide (LPS) is an important virulence factor of Aeromonas hydrophila. In order to identify the genes involved in the LPS core biosynthesis a mini-Tn5::Km1 transposon mutagenesis was carried out in strain AH-3 and three different mutants with an altered core phenotype were isolated, which enabled the characterization of three different wa genomic regions. By means of mutant construction in each gene when possible and their LPS core structures elucidation by ESI-MS and monosaccharides methylation analysis, together with LPS phenotypic analysis by SDS-PAGE and data obtained from the sequence analysis and complementation assays, it was possible to assign functions to each gene. Regions 2 and 3 wa, containing 4 and 2 genes, respectively, encode inner core biosynthesis enzymes. Region 1 wa includes 7 genes encoding HldD epimerase, WaaL Oantigen ligase and transferases involved in outer core biosynthesis and L,D-HepIV incorporation. Moreover, the LPS core genes distribution study showed a high conservation between different mesophilic Aeromonas serotypes. Analysis and functional characterization of some of the 17 genes of the AH-3 wb gene cluster responsible for the O:34-antigen biosynthesis, which had been identified in a previous work, was also performed. It contains genes for activated monosaccharides GDP manose and dTDP-6-deoxy-L-talose production and for transfer, for O-antigen acetylation, for the O-unit biosynthesis initiation (wecA), transport (wzx) and polymerization (wzy) and to determine the O-antigen chain length (wzz). The wzz promoter region was localized due to its transcription start site determined by 5'RACE. Semi-quantitative RT-PCR and &#946;-galactosidase fusion assays lead to the conclusion that the wzz gene transcription/expression level was much lower at 37ºC than at 20ºC, which explains the differential O:34-antigen production at both temperatures. </I>