Sistema de secreción de tipo III en

Abstract

<i>Aeromonas hydrophila</i> es un bacilo gram-negativo, patógeno oportunista de animales y humanos. La patogénesis de <i>A. hydrophila</i> es multifactorial. Con objeto de identificar genes implicados en la virulencia de la cepa PPD134/91 de <i>A. hydrophila</i>, se realizaron experimentos de sustracción génica, que llevaron a la detección de 22 fragmentos de ADN que codificaban 19 putativos factores de virulencia, incluyendo un gen que codificaba una proteína de sistema de secreción de tipo III (T3SS). La creciente importancia del T3SS en la patogénesis de diversas bacterias, llevó a identificar y analizar la agrupación génica del T3SS de las cepas AH-1 y AH-3 de <i>A. hydrophila</i>, así como también el efector AexT en la cepa AH-3. La inactivación de los genes de T3SS <i>aopB</i> y <i>aopD</i> en <i>A. hydrophila</i> AH-1, y <i>ascV</i> en <i>A. hydrophila</i> AH-3 conlleva una disminución de la citotoxicidad, un incremento de la fagocitosis, y una reducción de la virulencia en diferentes modelos animales, demostrando estos resultados que el T3SS es necesario para la patogenicidad del género <i>Aeromonas</i>. El mutante en el gen aexT de la cepa AH-3 de <i>A. hydrophila</i> muestra una ligera reducción de la virulencia, ensayada con diferentes métodos. Por otro lado, la proteína AexT presentó actividad ADP-ribosiltransferasa, y se demostró su translocación vía T3SS al interior de células eucariotas, sistema que a su vez parece ser inducible <i>in vitro</i> en condiciones de depleción de calcio. Mediante el uso de diferentes sondas de ADN, se determinó la presencia del T3SS en cepas tanto clínicas como ambientales de diferentes especies del género Aeromonas: <i>A. hydrophila</i>, <i>A. veronii</i>, y <i>A. caviae</i>, y la codistribución de esta agrupación génica y del gen <i>aexT</i>. Finalmente, con el fin de analizar la activación transcripcional de la agrupación génica de T3SS y del efector AexT en <i>A. hydrophila</i> AH-3, los promotores predichos del operón <i>aopN-aopD</i> y el gen <i>aexT</i> se fusionaron con el gen <i>reporter gfp (Green Fluorescence Protein)</i>. Además, se demostró que la expresión de ambos promotores depende de diferentes componentes bacterianos, como por ejemplo el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, el sistema de <i>quórum sensing</i> AhyI/AhyR, el sistema flagelar, el lipopolisacárido, la oxidoreductasa DsbA o el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa.

Aeromonas hydrophila is a gram-negative opportunistic pathogen of animals and humans and its pathogenesis is multifactorial. Genomic subtraction was used to identify putative virulence genes in A. hydrophila PPD134/91 and led to the identification of 22 unique DNA fragments encoding 19 putative virulence factors, including a gene encoding a type III secretion system (T3SS) protein. The increasing importance of the T3SS in the pathogenesis of several bacteria, led us to identify and further analyse the T3SS gene clusters in A. hydrophila AH-1 and AH-3. Insertional inactivation of the T3SS genes aopB and aopD in A. hydrophila AH-1 and ascV in A. hydrophila AH-3 led to decreased cytotoxicity, increased phagocytosis, and reduced virulence in several animal models. These results show that the T3SS is required for A. hydrophila pathogenicity. We also cloned and sequenced an ADP-ribosylating toxin (AexT) in A. hydrophila AH-3, and showed that this toxin is translocated via the T3SS, which also seems to be inducible in vitro under calcium depleted conditions. The A. hydrophila AH-3 aexT mutant showed a slight reduction in virulence assayed by several methods. By using several gene probes, we also determined the presence of the T3SS in clinical and environmental strains of different Aeromonas species: A. hydrophila, A. veronii, and A. caviae, and the co-distribution of this gene cluster and the gene encoding the toxin AexT. Finally, to study the transcriptional regulation of the T3SS gene cluster and the effector AexT in A. hydrophila AH-3, we isolated the predicted promoter regions of both operon aopN-aopD and gene aexT, which were fused with a green fluorescence protein reporter gene. Furthermore, we established that expression of the T3SS gene cluster and the effector AexT in A. hydrophila AH-3 depends on the expression of several bacterial components, such as the lipopolysaccharide, the polar flagellum, the two component regulatory system PhoP/PhoQ, the quorum sensing system based on AhyI/AhyR proteins, the pyruvate dehydrogenase complex and the periplasmic oxidoreductase DsbA.