Caracterització del gen GAS6 i associació amb malalties humanes

Abstract

El producte de <i>growth arrest-specific gene6</i> (<i>GAS6</i>) és un lligand per als receptors tirosina quinasa TYRO3, AXL i MERTK (TAM). Aquesta proteïna dependent de la vitamina K, està estructuralment relacionada amb la Proteïna S anticoagulant i ha estat implicada en diferents mecanismes de supervivència, proliferació i adhesió cel·lulars i la inhibició de l'apoptosi. El fet que el ratolí deficient en Gas6 estigués protegit en front d'episodis trombòtics demostrà la importancia del paper d'aquesta proteïna en el sistema cardiovascular. <br/>L'estructura genètica i proteica de <i>GAS6</i> és altament homòloga amb la de la Proteïna S. La present tesi tenia com a objectiu determinar l'estructura d'exons i d'introns del gen GAS6 per tal d'analitzar posteriorment la presència de variants al gen que puguessin estar associades a malalties humanes.<br/>L'anàlisi bioinformàtic ens va permetre localitzar 15 exons de GAS6, determinar-ne les seqüències d'aquests i de les seves regions intròniques flanquejants en una regió que ocupa 43,5 Kb al braç llarg del cromosoma 13. Un cop obtinguda aquesta estructura es procedí a identificar la presència de variants al·lèliques mitjançant l'anàlisi amb SSCP de productes amplificats de PCR (de mostres de DNA d'un grup d'individus control) que contenien les seqüències exòniques amb les seves regions intròniques flanquejants. Aquestes anàlisis revelaren la presència de diferents variants al·lèliques que varen ser confirmades com a polimorfismes de cadena senzilla (SNP). Un primer estudi d'associació d'aquests SNP identificats mostrà que un d'aquests polimorfismes (c.834+7G>A a l'intró 8 de <i>GAS6</i>) presentava una diferència estadísticament significativa en la distribució al·lèlica i genotípica en el grup de pacients respecte a la població control en una població amb malaltia aterotrombòtica, sobretot en el subgrup de malaltia cerebrovascular. Posteriorment, es va realitzar la confirmació d'aquests resultats en una població amb malatia cerebrovascular molt més gran i independent de l'anterior utilitzant estudis de genotips i haplotips, i es confirmà l'associació del genotip c.834+7 AA amb la reducció del risc per a la malaltia cerebrovascular. <br/>L'anàlisi d'alguns polimorfismes coneguts dels gens <i>PROZ</i> i <i>F5</i> i <i>F7</i> de la coagulació (situats a la mateixa regió cromosòmica que <i>GAS6</i>) que han estat implicats en malaltia cerebrovasculat tampoc indiquen cap associació entre aquest i la malaltia ni estan en desequilibri de lligament amb cap dels polimorfismes identificats a GAS6.<br/>L'anàlisi d'haplotips indicà que aquesta associació era encara més forta quan es combinava amb altres SNP, en un haplotip específic (CACA), per a 4 polimorfismes de GAS6 (rs8191973, rs7331124, rs7323932 (c.834+7G>A), rs8191974). D'una banda, aquests resultats suggereixen un paper protector que disminueix en més de dues vegades el risc a patir un accident cerebrovascular d'origen ateroscleròtic o el que afecta a la microvasculatura de l'al·lel c.834+7A i més concretament de l'haplotip CACA de <i>GAS6</i> D'altra banda, els estudis funcionals realitzats per a determinar el possible paper del polimorfisme de l'intró 8 de <i>GAS6</i> no mostraren diferències en plaques aterosclerosades d'artèries coronàries respecte a artèries sense placa. Així, l'efecte observat a nivell poblacional d'aquest polimorfisme identificat podria indicar l'efecte no conegut fins ara d'aquest o d'un altre polimorfisme en desequilibri de lligament amb aquest que estaria afectant la via de GAS6 i els seus receptors tirosina quinasa.

The product of the growth arrest-specific gene 6 (GAS6), a ligand for the TYRO3,AXL, and MERTK tyrosine kinase receptors, is a vitamin K-dependent protein, structurally related to anticoagulant protein S. Gas6-deficient mice are protected against thrombosis, demonstrating the importance of this protein in the cardiovascular system.<br/>The present thesis was aimed at determining the human GAS6 intron-exon structure and analyzing the gene for the presence of allelic variants that could be associated with human diseases. Online analyses allowed us to localize 15 GAS6 exons and to determine the sequence of their intron-flanking regions, in a chromosome 13 region spanning 43.5 kb of DNA. SSCP analysis of PCR-amplified GAS6 exons with their intron-flanking regions from control DNA samples, revealed the presence of different variants, which were confirmed to be single nucleotide polymorphisms (SNPs). A preliminary analysis of these SNPs in a group of patients with atherothrombotic disease revealed statistically significant differences between controls and stroke patients in the allelic distributions of one of these variants (c.834+7G>A in intron 8). We confirmed these results in a larger and independent stroke population using genotype and haplotype studies: the GAS6 c.834+7AA genotype was found associated with decreased risk for stroke (OR:0.59; 95%CI:0.37-0.93). Furthermore, haplotype analysis revealed that association was even stronger (OR:0.48;95%CI:0.28-0.83, for ischemic stroke) when the c.834+7 A allele was present in a specific haplotype (CACA) of four GAS6 polymorphisms (rs8191973, rs7331124, rs7323932, rs8191974).These results suggest a protective role for stroke of this haplotype.