Efectes de la reperfusió després de la isquèmia cerebral: proteïnes d'estrès cel·lular, estrès oxidatiu i activació del complement

Abstract

Globalment, aquesta tesi mostra diversos fenòmens que s’associen a la reperfusió després de la isquèmia cerebral. Per una banda, la inducció de la proteïna Hsp-70, a la que s’atribueixen propietats anti-apoptòtiques i protectores, promourà la supervivència neuronal en la zona de la penombra. La generació d’animals transgènics que expressen una proteïna fluorescent sota el promotor del gen Hsp-70 ens ha permès visualitzar en animals vius la zona de penombra mitjançant tècniques de microscòpia confocal intravital, així com monitoritzar aquesta expressió en regions cerebrals utilitzant tecnologia FRI. Malgrat la inducció de molècules protectores que facilitaran la supervivència neuronal a la zona de penombra, la reperfusió també comporta danys secundaris que s’associen principalment a estrès oxidatiu i inflamació. Aquests danys per reperfusió no s’observen en tots els animals sinó que es posen de manifest en aproximadament la meitat dels animals sotmesos a isquèmia transitòria seguida de reperfusió. Hem trobat que la hiperèmia reactiva en el moment de la reperfusió és un biomarcador de dany per reperfusió. El subgrup d’animals amb hiperèmia reactiva és el que és susceptible de respondre a tractaments antioxidants, com hem demostrat amb l’anàleg sintètic de la vitamina E, CR-6. L’administració oral de CR-6 dues hores després de l’inici de la isquèmia, protegeix els animals hiperèmics disminuint el volum d’infart cerebral i atenuant els dèficits neurològics. Aquesta protecció està relacionada amb una disminució de l’estrès oxidatiu a nivell de la vasculatura cerebral, menor alteració de la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica, menor infiltració leucocitària i menor inflamació. La isquèmia/reperfusió també activa el complement. Hem demostrat que la via de les lectines està implicada en la lesió cerebral donat que els animals deficients en la proteïna MBL d’aquesta via tenen lesions de menor mida i presenten menys alteracions neurològiques. Hem demostrat que els efectes perjudicials de la MBL són deguts a la disminució del flux sanguini cerebral durant les hores que segueixen a la reperfusió post-isquèmia. Aquesta disminució està relacionada amb el dipòsit de fibrina/fibrinògen en la microvasculatura cerebral de la zona afectada i amb l’activació de la trombina, tal com demostren els efectes beneficiosos de l’inhibidor de trombina argatroban, que s’observen en els animals que tenen MBL però no en els animals deficients. Els resultats d’aquest treball permeten concloure que diferents estratègies per minimitzar el dany per reperfusió podrien incloure la inducció de l’expressió de Hsp-70 per afavorir la supervivència de les neurones de la penombra, i la inhibició tant de l’estrès oxidatiu com de l’activació del complement per la via de les lectines per evitar la trombosis secundària durant la reperfusió, atenuar l’estrès oxidatiu a l’endoteli vascular i prevenir la ruptura de la barrera hematoencefàlica i la inflamació tissular.

Stroke induces strong expression of the 72-kDa heat-shock protein (HSP-70) in the ischaemic brain, and neuronal expression of HSP-70 is associated with the ischaemic penumbra. The aim of this study was to image induction of Hsp-70 gene expression in vivo after brain ischaemia using reporter mice. A genomic DNA sequence of the Hspa1b promoter was used to generate an Hsp70-mPlum far-red fluorescence reporter vector. The construct was tested in cellular systems (NIH3T3 mouse fibroblast cell line) by transient transfection and examining mPlum and Hsp-70 induction under a challenge. After construct validation, mPlum transgenic mice were generated. Focal brain ischaemia was induced by transient intraluminal occlusion of the middle cerebral artery and the mice were imaged in vivo with fluorescence reflectance imaging (FRI) with an intact skull, and with confocal microscopy after opening a cranial window. Cells transfected with the Hsp70-mPlum construct showed mPlum fluorescence after stimulation. One day after induction of ischaemia, reporter mice showed a FRI signal located in the HSP-70-positive zone within the ipsilateral hemisphere, as validated by immunohistochemistry. Live confocal microscopy allowed brain tissue to be visualized at the cellular level. mPlum fluorescence was observed in vivo in the ipsilateral cortex 1 day after induction of ischae- mia in neurons, where it is compatible with penumbra and neuronal viability, and in blood vessels in the core of the infarction. This study showed in vivo induction of Hsp-70 gene expression in ischaemic brain using reporter mice. The fluorescence signal showed in vivo the induction of Hsp-70 in penumbra neurons and in the vasculature within the ischaemic core. Several lines of evidence support the involvement of mannose-binding lectin (MBL) in stroke brain damage. The lectin pathway of the complement system facilitates thrombin activation and clot formation under certain experimental conditions. In the present study, we examine whether MBL promotes thrombosis after ischemia/reperfusion and influences the course and prognosis of ischemic stroke. Middle cerebral artery occlusion/reperfusion was performed in MBL-deficient and wild-type mice, and the brain lesion was assessed by MRI at days 1 and 7. Relative cerebral blood flow was monitored up to 6 hours after middle cerebral artery occlusion with laser speckle contrast imaging. Fibrin(ogen) was analyzed in the brain vasculature and plasma, and the effects of thrombin inhibitor argatroban were evaluated to assess the role of MBL in thrombin activation. Infarct volumes and neurological deficits were smaller in MBL knockout mice than in WT mice. Relative cerebral blood flow values during middle cerebral artery occlusion and at reperfusion were similar in both groups, but decreased during the next 6 hours in the WT group only. Also, the WT mice showed more fibrin(ogen) in brain vessels and a better outcome after argatroban treatment. In contrast, argatroban did not improve the outcome in MBL knockout mice. MBL promotes brain damage and functional impairment after brain ischemia/reperfusion in mice. These effects are secondary to intravascular thrombosis and impaired relative cerebral blood flow during reperfusion. Argatroban protects WT mice, but not MBL knockout mice, emphasizing a role of MBL in local thrombus formation in acute ischemia/reperfusion.