Study of the diffusive properties of extracellular matrix gels used in 3D cultures

Abstract

The extracellular matrix (ECM) hinders diffusion in both tissues and hydrogels used in 3D cultures. However, how geometric and non-geometric ECM properties contribute to diffusion hindrance remains poorly understood. To address this question, the effective diffusivity D of FITC-dextrans with molecular weight (Mr, 4-70 kDa) spanning the physiological range of signaling factors was measured in a panel of acellular ECM gels with an optical macroscopic assay. Gels included reconstituted basement membrane/Matrigel, fibrin and type I collagen, and exhibited an average pore size much larger than any dextran size. Unexpectedly, a decay of D with Mr following a power-law with an exponent that matched that predicted by the Stokes-Einstein law in all gels (D ~ Mr-1/3, r2=0.99) was observed, revealing that hindered diffusion is dominated by nongeometric viscous factors. This law predicted that Matrigel and fibrin exhibited similar viscosities, which was confirmed with microrheology measurements by atomic force microscopy. Moreover, gels with the lowest D exhibited diffusion hindrance comparable to the extreme physiologic hindrance of brain tissue, which has a typical pore size much smaller than ECM gels. In contrast, diffusion hindrance in sparse (</=1 mg/ml) gels was very weak and below any reported tissue diffusivity data. These observations reveal a major role for the enhanced viscosity of the extracellular space in regulating the passive transport in both 3D culture and tissues, and indicate that dense ECM gels (>/=3 mg/ml) are suitable tissue surrogates in terms of macromolecular diffusion.

Additionally, it is unknown to what extent current 3D culture protocols provide physiologic oxygen tension conditions. To address this limitation, oxygen tension was measured within the acellular or cellularized ECM gels with A549 cells, and analyzed in terms of oxygen diffusion and consumption. Oxygen diffusivity in acellular gels was up to 40% smaller than that of water, and the lower values were observed in the denser gels. In 3D cultures, physiologic oxygen tension was achieved after 2 days in dense (>/=3 mg/ml) but not sparse gels, revealing that the latter gels are not suitable tissue surrogates in terms of oxygen distribution. In dense gels, a dominant effect of ECM composition over density in oxygen consumption as observed. All diffusion and consumption data were used in a simple model to estimate ranges for gel thickness, seeding density and time-window that may support physiologic oxygen tension. Thus, critical variables for oxygen tension in ECM gels were identified, and a model to assess initial values of these variables was introduced, which may short-cut the optimization step of 3D culture studies.

Tradicionalmente, las células han sido cultivadas en placas Petri en un entorno bidimensional por más de un siglo. Sin embargo, las células de un organismo vivo tienen un entorno tridimensional. Todas las células del tejido se unen a una matriz extracelular (ECM). Además, la difusión y la vinculación de muchas proteínas tales como factores de crecimiento, está regulada por la matriz 3D. El reconocimiento del importante papel regulador de la ECM in vivo ha extendido los usos de los cultivos en 3D basados en el crecimiento de las células dentro de geles con componentes nativos de ECM . El objetivo general de esta tesis fue estudiar las características de los cultivos celulares tridimensionales de matriz extracelular más comunes en términos de difusión. Los resultados ilustran que la relación de Stokes-Einstein derivada para fluidos newtonianos puede extenderse a la compleja estructura enmarañada de geles de ECM para partículas esféricas mucho más pequeñas que el tamaño de poro medio de la ECM. Además, el impedimento a la difusión (tortuosidad) en geles de ECM está dominada por factores no-geométricos hidrodinámicos (es decir, viscosidad ECS) en lugar de las propiedades geométricas (estérica) del gel tal y como se asume en la literatura. Los cultivos en 3D basados en geles densos (3 mg/ml) son sustitutos adecuados de los tejidos en términos de difusión y son incluso capaces de reproducir la tortuosidad fisiológica extrema del tejido cerebral. Estos resultados apoyan que la ECM es un importante aporte a la tortuosidad del tejido, particularmente en grandes densidades de ECM y se destaca la importancia de utilizar los portadores con baja RH en la entrega de fármacos. Se han proporcionado las primeras mediciones del consumo de oxígeno en células A549 en cultivos 3D, las cuales han revelado un efecto dominante de la composición de ECM sobre la densidad en el consumo de oxígeno. Las predicciones de modelos pueden ser útiles como puntos de partida para el grosor y la densidad celular inicial en los estudios de cultivos 3D, reduciendo así la optimización inicial. Muchos de los efectos no deseados de difusión pueden ser superados mediante simples modificaciones experimentales como el espesor del gel o la densidad de siembra inicial.