Aproximació als mecanismes moleculars implicats en la regulació de la síndrome de fugida de l’ombra en Arabidopsis

Abstract

La llum és un element essencial per les plantes, ja que d’ella en treuen l’energia necessària per créixer. És normal doncs que hagin adquirit mecanismes per percebre diferents paràmetres d’aquesta, relacionats tant amb la seva quantitat com amb la qualitat. Dels diferents receptors de llum o fotoreceptors, els fitocroms són els més estudiats. Probablement la resposta controlada pels fitocroms més important per a les plantes a la naturalesa és la síndrome de fugida de l’ombra (SAS, de l’anglès shade avoidance syndrome). Aquesta síndrome agrupa una sèrie de respostes que han adoptat les plantes amb flors per evitar l’ombra de la vegetació propera. Tals respostes, com l’allargament de l’hipocòtil, la disminució de l'expansió foliar o la floració primerenca, impliquen a la fi una disminució de la biomassa en general. L’estudi de la SAS, per tant, es perfila com de gran interès biotecnològic, i ha estat objecte de la manipulació genètica per tal de millorar el rendiment dels cultius.

En la present tesi s’ha treballat amb dos factors prèviament identificats al laboratori i involucrats en les respostes de la SAS.

1. Estudi de la relació estructura-funció del factor regulador de la SAS ATHB4.

D’una banda s’ha estudiat el factor de transcripció ATHB4, una proteïna de la família HD-Zip (de l’anglès homeodomain-leucine zipper) classe II. La sobre-expressió d’ATHB4 produeix plàntules més petites i fosques, amb hipocòtil lleugerament allargat i cotiledons estrets, i respostes molt menors a tractaments d’ombra. Mitjançant la sobre-expressió de diferents regions d’ATHB4 s’ha vist que proteïnes sense la regió Ct mantenen la mateixa activitat biològica que la sobre-expressió de la proteïna sencera, suggerint que la regió Ct no té rellevància en les respostes a ombra aplicada al laboratori. D’altra banda, línies sobre-expressant diverses parts d’ATHB4 sense la regió Nt, o amb mutacions en residus conservats d’aquesta, perden gran part del fenotip visible en la línia sobre-expressora d’ATHB4 sencera, suggerint que aquesta regió Nt és essencial per l’activitat d’ATHB4 en les respostes a ombra. A més, formes truncades d’ATHB4 que podrien tenir la capacitat d’unió al DNA afectada mantenen les mateixes respostes a ombra que la proteïna sencera, suggerint que ATHB4 podria actuar en ombra de manera independent a la unió al DNA.

Conjuntament, els resultats fisiològics i moleculars de les diferents construccions analitzades en la present tesi, suggereixen que la regió Nt d’ATHB4 podria interaccionar amb altres proteïnes per tal de regular les respostes de la SAS.

2. Paper de les nucleoporines (NUPs) en la regulació de la SAS.

En un escrutini genètic es va obtenir el mutant recessiu dracula2 (dra2) amb una resposta a ombra simulada atenuada. Aquesta mutació afecta un gen que codifica una possible NUP. L’al•lel obtingut de l’escrutini es va anomenar dra2-1. En la present tesi s’ha realitzat una caracterització general d’aquest mutant, i d’altres al•lels mutants del mateix gen per inserció de T-DNA, mitjançant quantificacions dels nivells de pigments (clorofil•les i carotenoides), respostes a hormones (BRs, GAs i auxines) i respostes a ombra, tant fisiològiques com moleculars. S’ha vist que aquest mutant presenta alteracions en diverses respostes, inclosa l’exportació d’mRNAs del nucli cap al citoplasma. A més, altres NUPs també afecten les respostes de la SAS a nivell fisiològic, però dra2-1 és l’únic amb efectes moleculars. En conjunt, en la present tesi presentem les NUPs com a elements importants per les correctes respostes de la SAS, tenint DRA2 algun paper específic en la senyalització per llum.

Plants sense the presence of competing neighboring vegetation as a change in light quality: i.e. they sense the reduced ratio of red to far-red light. The responses to shade, generally referred to as the shade avoidance syndrome (SAS), involve various developmental changes intended to outgrow or outcompete the neighboring plants. A shade-responsive luciferase reporter line (PHYB::LUC) was used to carry out a high-throughput screen to identify novel SAS mutants. The dracula 2 (dra2) mutant, that showed a reduced avoidance of shade, affected a gene encoding a nucleoporine-like protein. Nucleoporins (NUPs) are the components of the nuclear pore complex (NPC), a structure that regulates the nucleocytoplasmic transport. Our work demonstrate that a proper nucleocytoplasmic transport is needed for SAS responses, as several plant NUP mutants display attenuated physiological shade responses. Despite the pleiotropic phenotype of the loss of function of specific NUPs, we found that dra2-1 has some specific and distinct molecular activity by reducing the expression of several shade molecular markers. In summary, we propose that DRA2 is a true NUP with a unique role regulating nucleocytoplasmic traffic of SAS related macromolecules. ATHB4, a transcription factor of the homeodomain-leucine-zipper class II (HD-Zip II) family, participates in integrating shade perception and hormone-mediated growth and, on the other hand, regulating leaf and cotyledon development. In this work we demonstrated that ATHB4 is a transcription factor that binds DNA and repress the expression of some members of its own family. By means of a structure-function approach, we go further in the study of the biological activity of ATHB4 in the shade-modulated hypocotyl elongation and control of gene expression in transgenic plants. We found that the HD and Zip domains, which hold the DNA-binding as a dimer, is not required for the role of ATHB4 in SAS responses. By contrast, the N-terminal region, which is conserved between most of the HD-Zip II members and contains a putative EAR domain, is essential for the proper SAS activity. Taking together our results indicate that ATHB4 plays two different roles, one in plant development and other in SAS responses, and that for the shade related activity is not working as a DNA-binding transcriptional repressor.