Anàlisi de la localització subcel·lular i propietats funcionals de DDP1, la vigilina de

Abstract

La vigilina és una proteïna molt conservada al llarg de l'evolució que s'ha vist implicada en dues grans funcions: la regulació de diferents aspectes del RNA i la contribució a la formació i manteniment de l'heterocromatina. La segona funció es basa sobretot en resultats obtinguts amb la vigilina de "Drosophila", DDP1, la qual s'ha vist associada a cromosomes politènics colocalitzant amb HP1, i en els fenotips mostrats per un mutant hipomorf "ddp1(15-1)", el qual es comporta com un supressor de la variegació i afecta la deposició de HP1 i me2K9H3 al cromocentre. La localització cromosòmica de DDP1 contrasta amb la localització majoritàriament citoplasmàtica de les vigilines de llevat i mamífers, i estudis recents a llevat semblen indicar que la contribució de la vigilina a l'heterocromatina podria ser indirecte. En aquest treball hem aprofundit en l'estudi de la localització subcel·lular de la vigilina de "Drosophila" DDP1, per poder analitzar millor la seva funció, especialment en relació a la contribució en l'estructura i funció de l'heterocromatina.<br/><br/>L'estudi de la localització de DDP1 a diversos órgans de "Drosophila" mitjançant anticossos, fusions GFP i microscopia electrònica indica que DDP1 és una proteïna citoplasmàtica, associada al reticle endoplasmàtic rugós. Ademés, experiments d'immunolocalització realitzats amb un nou mutant nul "ddp1(&#916;)" indiquen que, en absència de DDP1, l'anticòs aDDP1 reconeix inespecíficament una altre proteïna nuclear.<br/><br/>La idea d'una contribució de DDP1 en l'organització de l'heterocromatina es basava sobretot en els fenotips observats amb el mutant hipomorf "ddp1(1-51)". La localització majoritària de DDP1 al citoplasma feia raonable pensar que aquests efectes podien ser indirectes. Els efectes observats en experiments de PEV amb el mutant hipomorf "ddp1(15-1) no s'han pogut reproduir amb el mutant nul "ddp1(&#916;)": en aquest cas s'aprecia una supressió molt dèbil en les femelles, sense cap efecte en<br/>els mascles. L'expressió ectòpica de DDP1 a un gen "white reporter" mitjançant el sistema LacI confirma que DDP1 no indueix silenciament. Aquests resultats suggereixen que la contribució de DDP1 a PEV és indirecta, i que la forta supressió observada amb el mutant hipomorf podria ser causada per un efecte secundari.<br/><br/>L'estudi de la deposició de me2K9H3 i HP1 a cromosomes mutants "ddp1(&#916;)" dóna una lleugera modificació de les marques analitzades, amb una baixada dels nivells de me2K9H3 en un 50% dels casos (fort solament en un 25%), i una reducció de HP1 als braços eucromàtics però no al cromocentre també en un 50%, tot i que les dades obtingudes en els experiments de variegació i silenciament, juntament amb la localització citoplasmàtica de DDP1, suggereixen fortament que la contribución de DDP1 a la formació i/o manteniment de l'heterocromatina és indirecta.<br/><br/>Els nostres resultats suggereixen que la contribució de DDP1 a l'organització de l'heterocromatina és indirecta, i podria estar associada a canvis en la traducció de mRNAs específics, entre ells mRNAs implicats en la formació de l'heterocromatina, com s'ha suggerit per la vigilina de "S. cerevisiae," Scp160. Aquesta hipòtesi s'ha validat estudiant les proteïnes associades amb DDP1 mitjançant la purificació de la proteïna pel mètode TAP. La purificació de complexos ha permès identificar en la fracció citoplasmàtica set proteïnes ribosomals de les subunitats 40S i 60S del ribosoma, suggerint que DDP1 uneix ribosomes i es troba implicada en la traducció de proteïnes.<br/><br/>Els resultats obtinguts en aquesta tesi suggereixen que la localització citoplasmàtica, la unió a ribosomes i l'associació al reticle endoplasmàtic rugós, però no la contribució a l'heterocromatina són característiques de la vigilina conservades al llarg de l'evolució.

<i>Functional characterisation of vigilin, a highly conserved multiKHdomain protein that binds RNA and ssDNA, remains elusive and to some extent controversial. Vigilin was proposed to act both in the cytoplasm, regulating RNA metabolism, and the nucleus, regulating different aspects of chromosome structure and function. Whether this contribution is direct remains however unclear. In this work, we show that "Drosophila" vigilin, DDP1, localises to the cytoplasm all through development, being undetectable in the nucleus. We also show that DDP1 preferentially associates to RER and copurifies with several ribosomal proteins, suggesting a contribution to mRNA translation. Moreover, immunolocalisation experiments performed in null "ddp1(delt)" mutants indicate that, in the absence of DDP1, aDDP1 antibodies might recognise an unrelated nuclear protein(s), as significant reactivity is detected in the nucleus while no signal is detected in the cytoplasm DDP1 was proposed to contribute to heterochromatin organisation and function. At least in part, this hypothesis was based on our own previous work showing that a hypomorph "ddp1(15-1)" mutant is a dominant suppressor of PEV. These effects, however, have not been totally confirmed using the null "ddp1(delta)" mutant, which shows weak suppression only in females, males showing no significant suppression at all. Moreover, targeting DDP1 to an ectopic "white reporter" fails to induce silencing. These results strongly suggest that the contribution of DDP1 to PEV is indirect, strong suppression observed in "ddp1(15-1)" males being likely the consequence of a secondary mutation originated during its obtention.<br/><br/>Altogether, these results indicate that cytoplasmic localisation and association to RER, but not contribution to heterochromatin organisation, are evolutionarily conserved features of vigilin, favouring a model by which vigilin acts in the cytoplasm, regulating RNA metabolism, and affects nuclear functions only indirectly. </i>