Detecció d'Helicobacter pylori en aigua

Abstract

Aquesta Tesi Doctoral té com objectius principals l’estudi d’Helicobacter pylori en mostres aquàtiques de Catalunya, en aigües procedents de sistemes dentals de consultes de dentistes, en saliva i en femtes de pacients amb símptomes gastrointestinals mitjançant el mètode de la PCR. També es va estudiar la supervivència d’Helicobacter pylori en aigua dolça usant un model de laboratori aplicant diferents tècniques d’anàlisi i es va interpretar el canvi de morfologia, la viabilitat i la culturabilitat de la bactèria així com la detecció i quantificació del seu ADN durant un període de temps concret.

Per aconseguir aquests objectius, primer es va escollir la llet descremada al 40% v/v com a millor crioprotector i el medi agar Columbia suplementat amb 5% de sang desfibrinada de cavall com a medi de cultiu.

Durant el desenvolupament de la tesi es va millorar la tècnica de PCR escollida inicialment basada amb l’estudi de Clayton i col•laboradors (1992) on s’usaven els iniciadors HPU1 i HPU2 en la PCR pel gen ureA, gen estructural de l’enzim ureasa. La tècnica de la hibridació seguida per aquests investigadors es va substituir per una segona PCR ja que aquesta permetria obtenir resultats més ràpidament. En aquesta PCR semiimbricada es va introduir un tercer iniciador intern, HPUI1, i mantenint HPU2 com a extern. Pel gen 16S rRNA, gen usat per a la detecció del gènere Helicobacter, es van usar els iniciadors 1F i 1R per a la primera PCR i els 1F i 2R per a la PCR semiimbricada.

El mètode d’extracció escollit en aquest treball basat en partícules de sílice i tiocianat de guanidina descrit per Boom i col., (1990) i l’optimització de les barreges de reacció de les PCR semiimbricades pel gen ureA i 16S rRNA van permetre detectar 50 UPF/mL i 2-20UFC/mL, respectivament.

Es va determinar la presència de H.pylori en mostres fecals humanes aplicant dos mètodes: mètode antigènic HpSA i l’amplificació del gen ureA. Amb el mètode molecular es va detectar la presència de ADN de H. pylori en 12 mostres i va mostrar un 75% de coincidència amb els resultats obtinguts amb el mètode antigènic HpSA.

També es va determinar la presència de H. pylori a aigües amb diferent de nivell de contaminació fecal. Es va amplificar ADN d’aquesta espècie en un 30% de les mostres d’aigua residual, un 8,34% de les mostres d’aigua de riu de Catalunya i no es va detectar en aigua de font.

L’estudi de supervivència de H. pylori a l’aigua en la foscor i a 7ºC es va demostrar que el recompte de bacteris i el número de genomes es manté constant durant tot el període d’estudi, 21 dies. La detecció per PCR també va ser positiva i constant durant aquest període. No obstant això, les cèl•lules només es van mantenir cultivables fins al sisè dia d’emmagatzematge.

També es va observar una conversió morfològica de les cèl•lules bacterianes passant de la forma espiral a cocal amb el pas del temps. L’estudi de la morfologia cel•lular en un tall vertical d’una colònia d’H. pylori de 4 dies va mostrar la coexistència de cèl•lules amb morfologia bacil•lar i coccal.

L’anàlisi de la saliva de 31 persones sanes va evidenciar la presència d’aquest bacteri en la boca de 6% de la població analitzada. La anàlisi feta amb la PCR semiimbricada per al gen 16S rRNA va identificar la presència d’aquest gen en 19 persones però la seqüenciació dels amplicons del gen ureA només va confirmar la presència de H. pylori en tres mostres.

L’anàlisi de 31 mostres d’aigua procedents de les corresponents cadires no va mostra la presència del patogen.

This thesis has as main objectives the study of Helicobacter pylori in water samples from Catalonia, saliva and human feces using the PCR method. Also studied survival, morpholgy, viability and culturability of Helicobacter pylori in water.

We first chose skim milk at 40% v / v as cryoprotectant and Columbia agar supplemented with 5% horse blood desfibrinada as a medium.

We used a seminested PCR for ureA gene with HPU1 and HPU2 primers for the first PCR and HPUI1 and HPU2 for the second PCR. By gene 16S rRNA, we used the 1F and 1R primers for the first PCR and 1F and 2R for the second PCR.

Using a silica and guanidine extraction method and optimization of the seminested PCR reaction mixtures for urea and 16S rRNA genes were detected 50 UPF / mL and 2-20UFC/mL respectively.

H.pylori was detected in 12 human fecal samples. DNA of H.pylori was amplified in 30% of samples of wastewater, a 8.34% of the samples of river water in Catalonia and was not detected in spring water.

The bacterial count and the number of H.pylori genomes remains constant throughout the study period, 21 days water in the dark at 7 ° C. The detection by PCR was also positive and constant during this period. The cells remained culturable only until the sixth day of storage.

We observed morphological conversion of bacterial cells through the spiral to cocal over time. The study of cell morphology in a vertical section of a colony of H.pylori showed the coexistence of cells with bacillary and coccal morphology.

The analysis of saliva from 31 healthy individuals showed the presence of this bacterium in the mouth of 6% of the analyzed population but we urea only confirmed the presence of H.pylori in three samples by sequencing.