Búsqueda del gen supresor de tumores implicado en meduloblastoma.

Abstract

NTRODUCCIÓN E HIPÓTESIS DE TRABAJO: El Meduloblastoma es un tumor embrionario de localización cerebelosa y el tumor maligno del sistema nervioso central más frecuente en la infancia. Histológicamente es un tumor de células pequeñas, redondas y azules y se subdivide en tipo clásico, desmoplásico, con extensa nodularidad y de células grandes (anaplásico). La alteración más frecuentemente observada en el análisis citogenético y molecular del Meduloblastoma es la pérdida de material genético en el brazo corto del cromosoma 17 (17p) constatándose pérdidas alélicas en 17p13.3 en aproximadamente el 40% de los tumores. Ello sugiere la existencia de un gen supresor de tumores localizado en 17p implicado en la etiopatogenia del tumor.<br/><br/>Se dispone de una serie de 16 muestras tumorales de Meduloblastoma congeladas a -80º C. En ella se había estudiado previamente la pérdida de heterocigosis (LOH) en 17p con marcadores microsatélite y delimitado una región mínima común de pérdida en 17p13.3. El propósito del presente trabajo es la identificación de un posible gen supresor de tumores implicado en Meduloblastoma mediante el estudio de expresión en mRNA por RT-PCR de cinco genes seleccionados de la región crítica (RUTBC1, PITPN, MNT, DPH1 y RILP). También se ha realizado análisis histopatológico (tipo histológico, presencia de hiperplasia vascular y necrosis tumoral), inmunohistoquímico (proteína gliofibrilar ácida (PGFA), neurofilamentos (NF), P53 y Ki 67) y revisión de datos clínicos (edad, sexo, localización, estadio, grupo de riesgo) de los casos.<br/><br/>RESULTADOS: Dieciséis casos de Meduloblastoma pediátrico con edades entre 0 y 12 años. Once varones y cinco mujeres. Catorce casos de localización en vermis y dos en hemisferio cerebeloso. Según el estadiaje de Chang 7 casos en T2 al diagnóstico, 9 en T3, 6 en M0, 6 en M1, y 4 en M2. Grupos de riesgo; 12 riesgo estándar y 4 casos de alto riesgo. <br/>Histopatología: Catorce casos de tipo clásico y dos de tipo desmoplásico. No se han encontrado otros tipos histológicos. Se observó hiperplasia vascular en dos casos y necrosis tumoral en ocho. <br/>Estudio inmunohistoquímico: Expresión de PGFA en 68% de casos, NF en 25% y P53 sobrexpresada en 37,5%. Ki67 fue en 75% de los tumores positivo en más del 35% de núcleos tumorales. <br/><br/>Estudio molecular: En el estudio de expresión (mRNA) por RT-PCR de los genes seleccionados se ha constatado presencia de la misma en la mayor parte de las muestras tumorales para los genes DPH1, PITPN y MNT. La expresión de RILP se encontró alterada en 80% de casos y en 50% para el gen RUTBC1, por tanto, ambos genes son considerados genes supresores candidatos. El análisis en DNA genómico por PCR semi-cuanitativa ha mostrado mayor pérdida de RILP que de RUTBC1. No se han encontrado mutaciones tras secuenciación del gen RILP en las muestras tumorales con LOH.<br/><br/><br/>CONCLUSIONES. Tras el análisis de los resultados se ha constatado que: Existe una relación estadísticamente significativa entre la expresión inmunohistoquímica de P53 y la necrosis tumoral. La positividad intensa para Ki67 se asocia a positividad para P53 y marcadores de agresividad histológica (necrosis tumoral, hiperplasia). Los estudios de expresión en las muestras tumorales permiten descartar a los genes DPH1, PITPN y MNT como posibles genes supresores implicados en Meduloblastoma. Los genes RILP y RUTBC1 son considerados como genes candidatos, ya que su expresión está notablemente disminuida en las muestras tumorales. No se han encontrado mutaciones en la secuenciación del gen RILP en las muestras tumorales con LOH en 17p13.3, con lo cual, muy probablemente no esté implicado en la patogenia del Meduloblastoma.

OBJECT: Medulloblastoma is an invasive embryonal cerebellar tumor and the most frequent malignant tumor of the brain in the pediatric population. Molecular genetic studies showed allelic loss of 17p13.3 in approximately 40% medulloblastomas, suggesting the existence of a tumor suppressor gene in this region involved in the pathogenesis of the tumor. The aim of this study was to identify a tumor suppressor gene by expression analysis of candidate genes in this region.<br/><br/>METHODS: In a series of 16 fresh frozen tumor samples from pediatric medulloblastomas previously studied for loss of heterozygosity (LOH) defined a common region of loss at 17p13.3. mRNA expression was analysed by RT-PCR of the five genes selected from the critical region (RUTBC1, PITPN, MNT, DPH1, RILP). Clinicopathological and inmunohistochemical studies were also performed.<br/><br/>RESULTS: The series included fourteen classical and two desmoplastic medulloblastoma, from patients in an age range of 0-12 years. Vascular hyperplasia occurred in two cases and tumoral necrosis in eigh. Immunohistochemical studies were positive for GFAP in 68% cases, NF in 25 % , for P53 in 37,5% and high Ki67 in 75%. Ki67 intense positivity and P53 expression, were related with tumor necrosis and vascular hyperplasia.<br/>RT-PCR analysis showed mRNA expression for DPH1, PITPN and MNT genes in most of the tumoral samples. RILP gene expression was altered in 80% cases and RUTBC1 in 50%. DNA genomic studies by semi-quantitative PCR showed more genomic loss of RILP than RUTBC1 gene. No mutation was identified by sequencing the cDNA from RILP gene in five tumoral samples with LOH.<br/><br/>CONCLUSIONS: Expression studies allowed to discard DPH1, PITPN and MNT genes as possible tumor supressor genes implicated in medulloblastoma. RILP and RUTBC1 genes are considered as potential tumor supressor genes since their expression is remarkably decreased. However, the lack of mutations in RILP gene, suggests that it is not a suppressor gene implicated in medulloblastoma pathogenesis.