CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA Elias Abel Obreque Slier ISBN: 978-84-693-6430-7 Dipòsit Legal: T-1632-2010 ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tesisenxarxa.net) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tesisenred.net) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. 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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Elías Obreque Slier CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRINGENCIA TESIS DOCTORAL dirigida por Dr. Fernando Zamora Marín, Dr. Álvaro Peña Neira y Dr. Remigio López Solís Departament de Bioquímica i Biotecnologia Facultat d’Enologia UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI Tarragona 2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI Departament de Bioquímica i Biotecnologia Facultat d’Enologia El Dr. Fernando Zamora Marín, professor del Departament de Bioquímica i Biotecnologia de la Facultat d’Enologia de Tarragona de la Universitat Rovira i Virgili, el Dr. Álvaro Peña Neira, professor del Departamento de Agroindustria y Enología de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile i el Dr. Remigio López Solís, membre del Programa de Biología Celular y Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile CERTIFIQUEN Que el treball aquí presentat y que duu per títol “CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRINGENCIA” ha estat realitzat per ELÍAS OBREQUE SLIER, sota la direcció dels sota-signants, en el Departament de Bioquímica i Biotecnologia a la Facultat d‘Enologia de Tarragona de la Universitat Rovira i Virgili, al Departamento de Agroindustria y Enología de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile i en el Programa de Biología Celular y Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile i que tots els resultats presentats són fruit de les experiències realitzades. Tarragona, 15 de Març del 2010 Dr. Álvaro Peña Neira Dr. Remigio López Solís Dr. Fernando Zamora Marín UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 AGRADECIMIENTOS En estas últimas frases, que afortunadamente escribo en este trabajo, pienso no sólo en aquellos que me acompañaron en estos 4 años, sino en todos los que de alguna u otra forma han contribuido a mi desarrollo personal, emocional y espiritual a lo largo de mi vida. Sin lugar a dudas que nada de todo esto hubiera sido posible sin la ayuda de Dios. Gracias por darme todo lo que tengo, sin merecerlo. Por tu compañía diaria, amistad sin condiciones, enseñanzas, motivaciones y por tener el control de todo. Gracias porque algunas veces estuviste en silencio y me abrazaste. Finalmente te agradezco por darme la oportunidad de conocer o haber conocido a personas tan maravillosas como las que nombro a continuación. A mis padres Marcelino Obreque y Fiorentina Slier, por ser ejemplos inspiradores de vida y enseñarme principios íntegros que me acompañarán siempre. A mis hermanas Silvana, Marcela y Tamara; sobrinas Victoria y Matilda; y cuñados Claudio y Mauricio por ser una motivación constante en mi vida. A mis profesores Dr. Álvaro Peña Neira, Dr. Fernando Zamora Marín y Dr. Remigio López Solís por ser referentes en mi vida académica e investigativa. A Álvaro por su absoluta disposición, incondicionalidad y gentileza. A Fernando por su amabilidad y acogimiento. Gracias por hacer que la distancia no fuera un límite en el desarrollo de éste trabajo. Asimismo, quiero agradecer enormemente a Remigio López, por su amistad, largas conversaciones de la vida y por ser el amigo que necesitaba. Ha sido invaluable tu apoyo científico, intelectual y emocional en mi vida y de seguro nada hubiera logrado sin tu desinteresada ayuda. A los miembros del Departamento de Agroindustria y Enología, de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile, especialmente a los profesores Hugo Nuñez, Laura Cabello, Marcela Medel y Eduardo Loyola. Al Dr. Joan Miquel Canals, Dra. Mireia Esteruelas, Dra. Roser Canals y Dra. María Carmen Llaudy, miembros del Departament de Bioquímica i Biotecnología de la Universidad Rovira i Virgili por traspasarme muy cordialmente sus conocimientos. Al Dr. Jorge Ricardo da Silva y Dra. Olga Laureano de la Universidad Técnica de Lisboa, Portugal, por su generosa hospitalidad y amabilidad en mi pasantía en su laboratorio. A todos los que me han acompañado en este paulatino proceso: Orlando Silva, Juan Pablo Tobar, Pablo Armijo, César Riquelme, Nelson Barra, Yerthy Montes, Iván Contreras, Carla Müller, Álvaro Meza, Daniel Ortega, Álvaro Cabeza, Domingo Ortega, Daniel Lomberg, Eliana Seguel, Sammy León, Robin Berendsen, Patricia Crespo, Emmanuel Gaujal, Patrick Deveaux, Julien Demanchaux, Nelly Belloc, Lorena Troncoso, Eugenia Galat, Martín Fanzone, Rodrigo Aguayo, Erich Villaseñor Maldonado, Roxana Lazzarini, Giselle Espina y Javiera Martínez. Finalmente quiero agradecer a los proyecto de investigación que financiaron esta tesis: Corfo-Innova Tecnovid05CTE02-04, DI- Universidad de Chile Mult-05/35-2 and Fondecyt-Chile 1080559 y de igual forma a Roberto Latorre, Director de arte de la agencia publicitaria Promoplan, por su gran trabajo en el diseño de este escrito. A todos ustedes... ¡Muchas gracias¡ UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 ÍNDICE Página Justificación y Objetivos Generales Introducción Capítulo I: Caracterización de la composición fenólica de hollejos y semillas de bayas del cultivar Carménère durante la maduración I.1. Justificación y Objetivos Específicos I.2. Caracterización fenólica de semillas de bayas del cultivar Carménère durante la maduración I.3. Caracterización fenólica de hollejos de bayas del cultivar Carménère durante la maduración I.4. Estudio comparativo de la composición fenólica de semillas y hollejos de bayas de los cultivares Carménère y Cabernet Sauvignon durante la maduración 85 63 43 39 41 1 5 Capítulo II: Evaluación de la interacción tanino-proteína II.1. Justificación y Objetivos Específicos II.2. Caracterización fenólica de taninos enológicos comerciales II.3. Determinación cuantitativa de las interacciones entre un tanino y una proteína modelo mediante ensayos de difusion y precipitacion en membranas de celulosa II.4. La interacción tanino-proteína esta más asociada a la astringencia que la precipitación del complejo tanino-proteína II.5. Amplificación de la interacción tanino-proteína y percepción de astringencia por etanol II.6. Efecto del pH sobre la interacción tanino-proteína y la percepción de astringencia 97 99 101 111 129 145 155 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III: Efecto de los taninos de semillas de bayas del cultivar Carménère sobre las proteínas salivales III.1. Justificación y Objetivos Específicos III.2. Precipitación de compuestos fenólicos de bajo peso molecular de semillas de bayas del cv. Carménère (Vitis vinifera l.) por saliva entera III.3. Interacción diferencial entre proteínas salivales y taninos de semillas de bayas del cv. Carménènere de diferentes estados de madurez 197 179 175 177 Conclusiones 213 Referencias 221 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS GENERALES Los compuestos fenólicos provienen del metabolismo secundario de los vegetales y son responsables de importantes propiedades sensoriales en los alimentos, tales como color, aroma, amargor y astringencia. Una multiplicidad de factores afectan su biosíntesis, entre ellos, el factor varietal. Hoy en día, existe un gran patrimonio varietal de vides para la producción de uva vinífera. Una de las familias más importantes corresponde a la de los Carmenets, constituida por los cultivares Merlot, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Carménère, Petit Verdot y Fer Servadou. En Chile, el cultivar Carménère, que hasta mediados de los años noventa había sido confundido con Merlot y Cabernet Franc dadas sus características ampelográficas similares, hoy existe como viñedos puros y, como tal, es motivo de estudios de selección clonal. Considerando que en Chile existen más de 7000 hectáreas plantadas con el cultivar Carménère y que en ese país se la promueve como variedad emblemática, su caracterización fenólica durante la maduración ha pasado a ser muy relevante. Por otro lado, durante el proceso de degustación, la interacción de ciertos compuestos fenólicos (proantocianidinas) con proteínas salivales ha sido asociada a la astringencia, una percepción de dureza y rugosidad en la cavidad bucal. Diversos autores han señalado como factores relevantes en la interacción entre taninos y proteínas a la estructura y concentración de las proantocianidinas. Estas podrían variar durante la maduración. Otros factores, como pH y alcohol, también podrían afectar la interacción entre taninos y proteínas. Considerando estos antecedentes, se ha propuesto la siguiente Hipótesis y Objetivos Generales: Hipótesis: La composición fenólica de semillas y hollejos de bayas del cultivar Carménère varía durante la maduración, lo que se relaciona con una disminución progresiva de la interacción entre los taninos de este cultivar y proteínas salivales. Este fenómeno se asociaría a su vez a una progresiva disminución de la percepción de astringencia. Objetivos Generales: 1.- Caracterizar la composición fenólica de semillas y hollejos de bayas del cultivar Carménère durante la maduración. 2.- Evaluar la capacidad de interacción que presentan taninos de distinta naturaleza con proteínas comerciales y salivales. 3.- Evaluar la capacidad de interacción que presentan taninos de semillas de bayas de distinto grado de madurez del cultivar Carménère con la fracción proteica de la saliva. -3- UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 1. Especies y cultivares de vid La vid pertenece a la familia Vitaceae, género Vitis, el cual se distribuye en climas templados y actualmente es extensamente cultivado en el Hemisferio norte, América del sur, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda. Otras especies, como las pertenecientes al género Muscadinia, son cultivadas estrictamente en Estados Unidos y el sur de México (Soleas y col., 1997) (Figura 1). Figura 1. Clasificación general del reino Plantae de acuerdo a Keller (2003). La información del origen de los cultivares es más bien escasa y en algunos casos inexistentes (Keller, 2003). Ocasionalmente, dentro de la especie Vitis vinifera la derivación del nombre de los cultivares se debe a su origen local, como por ejemplo Semillon que proviene de “semis” (Francia), que significa “semilla” y Sauvignon de “sauvage” (Francia) que significa “salvaje”. La diferenciación de los cultivares se ha realizado frecuentemente a través de la ampelografía, aunque recientemente han sido utilizados marcadores genéticos para investigar acerca del origen y clasificación varietal (Mauro y col., 1992). A pesar que actualmente se conocen aproximadamente 15.000 cultivares de vid, ningún sistema de clasificación ha podido agruparlos. Algunas tentativas han sido realizadas en Francia para racionalizar cultivares locales en grupos relacionados en su ampelografía y propiedades -7- UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - físicas, así como parámetros relacionadas con perfiles aromáticos y fenólicos (Soleas y col., 1997; Monagas y col., 2003; Fuleki y Ricardo da Silva, 1997; Santos-Buelga y col., 1995). 2. Anatomía y composición química de bayas de vid. 2.1. Origen del fruto de la vid. La vid esta conformada por un conjunto de frutos agrupados en forma de racimos, agrupados por un órgano herbáceo o leñosos conocido como raspón o escobajo, que soporta un número variable de bayas o frutos carnosos de pequeño tamaño. Cada baya del fruto de la vid proviene del desarrollo del pistilo u ovario que tiene la flor, mediante el depósito de los granos de polen sobre el estigma, que emiten los correspondientes tubos polínicos y que fecundan los óvulos situados en su interior, provocando una formación de hormonas vegetales (auxinas y giberelinas) que estimulan el crecimiento de los tejidos vegetales de la flor, transformándose a lo largo del período de maduración en un fruto. El pistilo evolucionará creciendo de tamaño hasta formar un grano de uva, conteniendo en su interior, semillas originadas de los óvulos de la flor. Los granos de uva están insertados en el racimo por medio de un pequeño fragmento de raspón conocido como cabillo o pedicelo, que se ensancha ligeramente en la zona de contacto con la baya con el nombre de rodete o receptáculo y que continúa hacia el interior del fruto con un haz de vasos conductores, cuya primera fracción que penetra se llama pincel, quedando adherido al pedicelo cuando se separa del grano de uva (Keller, 2003). 2.2 Anatomía de las bayas de Vitis vinifera. Las bayas del fruto de la vid están constituidas por tres tejidos de alta importancia composicional: hollejo o piel, semilla y pulpa (Hidalgo, 2003) (Figura 2). El hollejo esta constituido por la cutícula, la cual esta recubierta por una capa cerosa, la pruina. Esta sustancia de carácter hidrófobo, recubre homogéneamente las bayas con un espesor de unos 100 g/cm2 y sus funciones son proteger a la baya de las condiciones climáticas, frenar las evaporaciones de agua desde la pulpa y retener microorganismos autóctonos. La pruina esta constituida principalmente por ácido oleánico, además de ésteres, alcoholes, ácidos grasos y parafinas, entre otros. Después de la cutícula y hacia el interior de la baya, el hollejo presenta una segunda zona conocida como epidermis, compuesta por dos capas de células alargadas y colocadas en posición tangencial, terminando en una tercera zona o hipodermis, de 6 a 8 capas de células gradualmente más rectangulares o poligonales (Hidalgo, 2003). -8- UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Figura 2. Estructura de una baya del racimo de Vitis vinifera, extraído de Conde y col. (2007). Las semillas constituyen los elementos de la vid encargados de perpetuar la especie por vía sexual. Están constituidas desde el exterior al interior por una cutícula, una epidermis de poco espesor, una envoltura o tegumento externo de células lignificadas, una envoltura media y un tegumento interno de naturaleza celulósica. Este conjunto de tejidos rodean el albúmen, dentro del cual se encuentra el embrión compuesto por dos cotiledones, gémula y radícula (Cadot y col., 2006). Finalmente, la pulpa es la parte más voluminosa de la baya y representa entre un 75 y 85% del peso de ésta. Esta formado por tejido parenquimatoso cuyo origen son las paredes del ovario, con células cuyo volumen es ocupado casi en su totalidad por vacuolas. En sus paredes celulares, las pectinas representan entre un 25 y 50 % de su peso seco. Sus proteínas estructurales contienen principalmente hidroxiprolina, presentando además entre un 15 a 25 % de hemicelulosa y un 20 a 30 % de celulosa en sus paredes. La parte exterior de la pulpa se conoce con el nombre de mesocarpio y sus células se confunden en la periferia con las del hollejo. Hacia el interior la pulpa se denomina endocarpio. En total, el número de capas de células que componen la pulpa es de 25 a 30. La pulpa está alimentada por numerosos vasos conductores, de los cuales 10 a 12 haces penetran y se distribuyen dentro de ella, mientras que otros 8 a 10 haces se reparten por la sección exterior de la misma, inmediatamente debajo del hollejo (Hidalgo, 2003). 2.3. Composición química de las bayas de Vitis vinifera. En general, las bayas del racimo de uva están constituidas principalmente por agua, azúcares, elementos minerales, ácidos orgánicos, sustancias odorantes y compuestos fenólicos (Keller, 2003). 2.3.1. Agua. El agua es el constituyente más abundante del peso freso de la baya (75-85%), actuando como solvente de los compuestos químicos volátiles y fijos de la baya. Cerca del 99% del agua es absorbida por las raíces desde el suelo. El desarrollo de la baya y crecimiento de la planta están -9- UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - estrechamente relacionados con la disponibilidad de agua en el suelo, ya que un déficit hídrico provoca disminución del tamaño de las bayas inhibiendo tanto la división como la expansión celular (Conde y col., 2007). 2.3.2. Azúcares. Los azúcares son los segundos compuestos más abundantes del mosto, con concentraciones variables entre 150 y 300 g/L. En la uva los azúcares mayoritarios son la glucosa y fructosa y durante el envero existen concentraciones de glucosa que doblan la de fructosa. No obstante, durante la maduración de la baya se asemejan sus concentraciones, finalizando con concentraciones levemente mayores de fructosa. En las bayas de racimos verdes existen pequeñas cantidades de almidón. El contenido de sacarosa es aproximadamente de 1 a 3 g/L, sintetizándose en las hojas, emigrando bajo ésta forma hacia las bayas e hidrolizándose en una molécula de fructosa y otra de glucosa. Además de estos azúcares de 6 átomos existen otros de cinco átomos de carbono, infermentescibles por las levaduras, destacando entre ellos: arabinosa, xilosa, ramnosa, maltosa, rafinosa, entre otros, encontrándose en concentraciones inferiores a 0,5 g/L (Hidalgo, 2003). 2.3.3. Elementos minerales. El potasio es un macronutriente esencial para la vid y el crecimiento y desarrollo de sus bayas. La baya es rica en potasio y es el principal catión en el mosto y vino alcanzando concentraciones cercanas a 900 mg/L (Blouin y Cruège, 2003). El potasio participa, al igual que en otros vegetales, en la activación enzimática, control del potencial de la membrana plasmática (lo que determina el paso de diferentes cationes, aniones y azúcares) y regula el potencial osmótico, controlando las relaciones hídricas de la planta, mantención de la turgencia y crecimiento (Conde y col., 2007). Previo al envero, la mayor cantidad de potasio está acumulado en las hojas, para luego del envero acumularse fuertemente en las bayas (Blouin y Cruège, 2003). A pesar de su importancia, niveles excesivos de potasio en las bayas en cosecha pueden reducir significativamente la calidad de la fruta, debido a su efecto en el aumento del pH, provocado por la formación de bitartrato de potasio insoluble a partir de los protones del ácido tartárico y de cationes de potasio, perjudicando las características sensoriales y microbiológicas del vino (Davies y col., 2006). Otro elemento mineral esencial para la vid es el nitrógeno. Una falta de nitrógeno en la planta puede detener el crecimiento y desarrollo de la vid, mientras que un exceso puede aumentar el vigor, prolongar el crecimiento, retrasar la maduración, favorecer al desarrollo de enfermedades fungosas y disminuir el contenido de antocianinas y taninos en la baya (Delgado y col., 2004). En la baya, el nitrógeno puede ser encontrado bajo forma mineral (NH4+, NO3- y NO2-) u orgánica (aminoácidos libres, proteínas y otros compuestos nitrogenados como urea, etilcarbamato y ácidos nucleicos). La cantidad total de nitrógeno en el mosto varía entre 100 y 1200 mg/L, y usualmente el vino tinto contiene cantidades mayores que el vino blanco (Conde y col., 2007). El nitrógeno mineral en forma de NH4+ puede representar sobre el 80% del nitrógeno total antes del envero, pero luego disminuye al 510% después de la maduración y aun más al final de la fermentación alcohólica. El contenido de NO3- y NO2- son despreciables y alcanzan concentraciones cercanas al 0,5-2 mg/L y 5-40 g/L, - 10 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - respectivamente (Blouin y Cruège, 2003). El mosto tiene cerca de 30 aminoácidos que representan cerca del 20-50% del nitrógeno total en el mosto, pero solo siete están en cantidades por sobre los 100 mg/L (prolina, arginina, glutamina, alanina, glutamato, serina y treonina) (Conde y col., 2007). Además del rol en el crecimiento y desarrollo de levaduras y bacterias, los aminoácidos pueden interferir en la sensación de acidez debido a su capacidad tampón, pues se ha observado, que el consumo de amonio por parte de la levadura produce una mayor acidificación del medio que con el consumo de aminoácidos (Torija y col., 2003). Finalmente, las proteínas se encuentran en concentraciones entre 15 y 230 mg/L y su presencia depende de la fertilización nitrogenada sobre la planta, altas temperaturas de fermentación y contacto prolongado con bacterias y levaduras. Las proteínas pueden contribuir al desarrollo de problemas sensoriales durante la producción de vinos blancos debido a variaciones de temperatura (Ferreira y col., 2000). Otros elementos esenciales para la vid y el crecimiento y desarrollo de sus bayas son el calcio, magnesio, fósforo y azufre. 2.3.4. Ácidos orgánicos. Los ácidos tartárico y málico representan entre el 69 y 92% del total de los ácidos orgánicos en las bayas y hojas. Otros ácidos como el cítrico, succínico, láctico y acético, están también presentes en uvas cosechadas, pero en cantidades menores (Kliewer, 1966). La cantidad de ácido orgánico, la relación ácido málico/ácido tartárico y la cantidad de potasio presente, determinan los valores de pH de la baya. El pH es fundamental en la estabilidad microbiológica del vino, crecimiento de la levadura fermentativa, estabilidad del color, potencial sensorial y funcionamiento de fermentación maloláctica, entre otros. 2.3.5. Sustancias odorantes. En cuanto a las sustancias odorantes, se han descrito varios cientos de compuestos odorantes volátiles con concentraciones de algunos mg/L a unos pocos ng/L. Se originan a partir del metabolismo de la baya, fenómenos bioquímicos de oxidación e hidrólisis, metabolismo fermentativo y reacciones químicas o enzimáticas durante la crianza en barricas o botella (Conde y col., 2007). Los compuestos responsables del aroma varietal de la uva incluyen a la familia de los monoterpenos, C13-norisoprenoides, metoxipirazinas, y compuestos sulfurados. Numerosos estudios han demostrado que los terpenoides forman la base de la expresión aromática varietal que permite diferenciar los diversos cultivares. Son producidos a partir del metabolismo secundario de las plantas, originándose a partir de la acetil coenzima (CoA) y están localizados en los hollejos de las bayas (Oliveira y col., 2004). En el caso de los norisoprenides, se originan de la degradación oxidativa de los carotenoides y terpenos con 40 carbonos que producen derivados con 9, 10, 11 y 13 átomos de carbono (Enzell, 1985). Entre los norisoprenoides con 13 átomos de carbono, destaca la β-damascenona (aroma flores y frutos tropicales). Por otra parte, las metoxipirazinas son responsable del aroma herbáceo de ciertos cultivares como Carménère y Cabernet sauvignon. Existen en forma libre y no se ha identificado ningún precursor de su síntesis (Conde y col., 2007). Recientemente, algunos compuestos odoríferos sulfurados (4-mercapto-4-metil-penta-2-ona) han mostrado participar en el aroma de ciertos - 11 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - cultivares, especialmente Sauvignon blanc, los cuales se forman a partir de formas conjugadas de Scisteína en la baya pero también durante la fermentación (Darriet y col., 1993). 2.3.6. Compuestos fenólicos. Un grupo de alta relevancia en la composición química de la uva y vino corresponde a los compuestos fenólicos, derivados del metabolismo secundario de los vegetales y responsables de propiedades de alta relevancia como el color, aroma, amargor y astringencia. La caracterización y clasificación de éstos se detalla a continuación. 3. Compuestos fenólicos presentes en bayas de Vitis vinifera. En la denominación general de los compuestos fenólicos se incluye a un gran número de sustancias sumamente heterogéneas, que se caracterizan por poseer un anillo aromático con al menos una sustitución hidroxilo (Figura 3) y una cadena lateral funcional. Figura 3. Estructura de fenoles de bajo peso molecular. A partir de esta estructura básica, se han sido identificados una gran cantidad de compuestos fenólicos en uvas y vinos con una gran diversidad de estructuras. Los compuestos fenólicos procedentes del metabolismo secundario de los vegetales, se encuentran en todos los tejidos y están ampliamente distribuidos en todo el reino vegetal. En las plantas superiores es tal su abundancia, que sólo son superados por los carbohidratos (Pridham, 1965). Los compuestos fenólicos se dividen principalmente a dos familias: no flavonides y flavonoides. 3.1. Compuestos fenólicos no flavonoides. Los compuestos fenólicos no flavonoides se encuentran en las bayas y vinos, pero con excepción de los ácidos hidroxicinámicos (C6-C3) y ácidos benzoicos (C6-C1), están presentes en baja concentración (Figura 4). Algunos de los grupos importantes se detallan continuación. - 12 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Figura 4. Ejemplos de compuestos fenólicos no flavonoides en el vino 3.1.1. Ácidos hidroxicinámicos. Corresponden a la tercera clase de fenoles solubles más abundantes y están compuestos por un núcleo bencénico con una cadena lateral insaturada y sustituciones en los carbonos C6-C3. Están presentes en las células hipodermales (junto a taninos y antocianinas) y en las células del mesocarpo y placenta de la pulpa (Figura 5). Se encuentran mayoritariamente como trans isómeros aunque pequeñas cantidades de cis isómeros han sido encontrados (Adams, 2006). Tanto el vino tinto y blanco tienen cantidades similares de ácidos hidróxicinámicos y en este último participa fuertemente en su color (Kennedy y col., 2006). Los ácidos hidroxicinámicos fueron caracterizados en uvas y vinos a mediados del siglo veinte (Ribéreau-Gayon, 1963) y aunque estos compuestos fueron caracterizados previamente como ácidos libres, más tarde fue demostrado que estaban presentes en la uva principalmente esterificados con ácido tartárico (ácido feruloiltartárico o fertárico, ácido cafeoiltartárico o caftárico y p-cumaroiltartárico o cutárico) (Ribéreau-Gayon, 1965; Flanzy, 2003; Hidalgo, 2003) (Figura 6) y también formado parte de la estructura de algunos antocianinas aciladas. Luego de ser caracterizados, se demostró que se sintetizan en la baya antes del envero (Romeyer y col., 1983). - 13 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Figura 5. Estructura de ácidos hidroxicinámicos. 3.1.2. Ácidos y aldehídos benzoicos. Están compuestos por un núcleo bencénico con sustituciones en C6-C1. En el vino están presentes mayoritariamente en forma de ácido p-hidroxibenzoico, ácido siríngico y ácido gálico. Entre los ácidos benzoicos, el ácido gálico es el más soluble en agua y por lo tanto, en el mosto (Figura 4). En la uva procede fundamentalmente de los hollejos (Souquet y col., 1996) y semillas (Escribano-Bailón y col., 1992), sin embargo, su concentración depende más de factores tecnológicos que varietales, tales como maceraciones y crianza en barricas. Los vinos criados en contacto con madera, presentan estructuras poliméricas llamadas taninos hidrolizables, que son poliésteres de ácido gálico (galotaninos) o ácido elágico (elagitaninos). En el tiempo y tras su hidrólisis pueden ser fuentes de ácido gálico y elágico. Entre los aldehídos benzoicos destaca la p-vainillina, compuesto presente en vinos criados en barricas. 3.1.3. Taninos hidrolizables. Otro grupo importante de compuestos fenólicos no flavonoides lo constituyen los taninos hidrolizables. Estos compuestos son complejos polifenólicos que pueden transformarse, bajo distintas condiciones de hidrólisis, en fragmentos más simples comúnmente azúcares y algunos ácidos fenólicos (Luz Sanz y col., 2008). Los más abundantes son los poliésteres del ácido gálico y de sus derivados, pudiendo estar esterificados con D-glucosa, ácido quínico, glicósidos y otros fenoles. Dependiendo de los productos de hidrólisis se distingue entre galotaninos y elagitaninos, según se forme ácido gálico o su dímero, el ácido elágico (Figura 4). - 14 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Figura 6. Estructura de hidroxicinamatos encontrados en bayas de uva Vitis vinifera. 3.1.4. Estilbenos. Dentro de los compuestos no flavoides se encuentran los estilbenos glicosilados, conocidos por estar restringidos en su distribución, predominantemente entre Espermatofitas. El estilbeno más extensamente estudiado es el trans-resveratrol (3,5,4´-trihidroxiestilbeno). Junto a las viniferinas, se encuentra en la fruta y en los tejidos vegetativos como respuesta a un ataque fúngico o exposición a altos niveles de luz UV (Jeandet y Gautheron, 1991). 3.2. Compuestos fenólicos flavonoides. Los compuestos fenólicos flavonoides constituyen una porción significativa del material fenólico presente en bayas y existen varias clases con un esqueleto estructural similar (Figura 7). Los compuestos fenólicos flavonoides de importancia enológica están agrupados en antocianinas, flavonoles y flavanoles. Figura 7. Numeración y estructura de los compuestos flavonoides. 3.2.1. Antocianinas. Son los compuestos fenólicos responsables del color rojo del vino y están localizados en las células hipodermales del hollejo. Según su sustitución del núcleo lateral, se distinguen en la uva y el vino cinco moléculas definidas con dos o tres sustituyentes (OH y OCH3). - 15 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Estas agliconas corresponden a la cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina. En Vitis vinifera sólo se encuentran monoglucósidos en la posición C3. Las antocianinas suelen estar presentes en forma glucosilada o presentarse aciladas, es decir, esterificadas en el C6 con otros ácidos tales como acético, p-cumárico y cafeico. Aunque algunos cultivares como Pinot noir carecen de pigmentos acilados, otros cultivares podrían tener hasta 20 tipos de antocianinas (Adams, 2006) (Figura 8). Figura 8. Estructura de antocianinas en bayas de uva Vitis vinifera. Aunque la determinación general de la estructura de las antocianinas ocurrió tempranamente al inicio del siglo veinte (Willstäter y Everest, 1913; Levy y col., 1931), la investigación científica del color del vino tinto precede a la identificación de la estructura de las antocianinas (Pasteur, 1866; Laborde, 1908). Luego con el desarrollo del papel cromatográfico (Bate-Smith, 1983), la investigación de la composición fenólica en uvas se intensificó. En 1959, la malvidina-3-O-glucósido fue encontrada la antocianina más abundante junto a su forma acilada (Ribéreau-Gayon, 1959). Un estudio realizado por este último autor, demostró que las antocianininas monoglucosiladas encontradas en Vitis vinifera eran diferentes en su estructura que las encontradas en no-vinífera, que además poseían antocianinas diglucosiladas. Diversos estudios han demostrado que las antocianinas se sintetizan durante el período de maduración de la baya (Ribéreau-Gayon, 1971; Ribéreau-Gayon, 1972a) y que su concentración es claramente afectada por las condiciones de crecimiento (Kliewer y Torres, 1972; Kliewer, 1977), siendo - 16 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - sus máximos de extracción durante la maceración y antes del final de la fermentación para luego declinar sustancialmente (Ribéreau-Gayon, 1971; Ribéreau-Gayon, 1972a). 3.2.2. Flavonoles. Son pigmentos que contribuyen a la coloración amarilla, que se encuentran en los hollejos de las uvas, donde están presentes principalmente bajo la forma de heterósidos (glucósidos, galactósidos, ramnósidos, rutinósidos o glucorunósidos) de quercetina, miricetina, kaemferol e isoramnetina (Adams, 2006) (Figura 9). Figura 9. Flavonoles presentes bayas Vitis vinifera en forma de glucósidos, galactósidos o glucorónido donde R3 representa a glucosa, galactosa y ácido glucorónido, respectivamente. Los heterósidos flavonólicos de la uva están parcialmente hidrolizados y en los vinos tintos pueden también aparecer las agluconas en estado libre. Se ha observado que estos compuestos son altamente dependientes de la exposición a la luz de los tejidos, reportándose que racimos expuestos al sol presentan mayores niveles de flavonoles que aquellos que permanece sombreados (Spayd y col., 2002; Downey y col., 2003). Sin embargo, el contenido de flavonoles en los vinos dependerá también del tipo de proceso de vinificación, pues por ejemplo, los vinos blancos (cuya fermentación se realiza en ausencia de los hollejos) contienen cantidades menores que los vinos tintos. Aunque los flavonoles no contribuyen en proporción elevada al contenido total de compuestos fenólicos del vino, pueden llegar a tener gran influencia sobre el color de los vinos tintos, al ser capaces de actuar como copigmentos de las antocianinas (Hermosin y col., 2005). 3.2.3. Flavanoles. Los flavan-3-oles son responsables de propiedades sensoriales de alta relevancia en el vino como son la astringencia y amargor. Se ubican en las capas hipodermales de los hollejos y en el parénquima de las semillas (Adams, 2006). Estos compuestos fueron inicialmente caracterizados en 1924 (Freudenberg, 1924), y más tarde investigados en bayas y vino (Durmishidze, 1955; Singlenton y col., 1966). Los flavan-3-oles más importantes presentes en la uva y vino son la (+)-catequina, (-)epicatequina, epigalocatequina y (-)-epicatequina-3-O-galato (Figura 10). Diversos estudios demuestran que estos compuestos están altamente presentes en semillas, que son sintetizados antes de envero y que cambian su composición y concentración durante la maduración (Singlenton y col., 1966; - 17 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Czochanska y col., 1979). En cuanto a su extracción se ha observado que mayores tiempos de extracción, altas temperaturas y mayores concentraciones de alcohol conducen a un aumento en la concentración de flavan-3-oles en el vino (Kennedy y col., 2006). Finalmente, una de las propiedades conocidas de los flavanoles es de participar en el proceso de copigmentación (García-Puente Rivas y col., 2006; Oliveira y col., 2006; González-Manzano y col., 2008). Figura 10. Estructura de flavan-3-oles encontrados en bayas de Vitis vinifera. 3.2.4. Taninos condensados. Los taninos condensados o proantocianidinas son los compuestos fenólicos más abundante en la uva, siendo extraídos de los hollejos, semillas y escobajos de los racimos. Están constituidos por subunidades de flavan-3-oles y a partir de ellos es posible encontrar una amplia variedad de compuestos con diversos pesos moleculares (Kennedy y col., 2006). A pesar de los progresos para entender absolutamente sus estructuras, la dificultad esta dada por la variación ilimitada de subunidades de flavan-3-oles. - 18 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Figura 11. Proantocinidina hipotética formada por cuatro subunidades: (+)-catequina, (-)epicatequina, epigalocatequina y (-)-epicatequina-3-O-galato. La primera subunidad ((+)-catequina) esta unida a la segunda ((-)-epicatequina) mediante un enlace interflavánico entre el carbono 4 de la (+)-catequina y el carbono 8 de la (-)-epicatequina. Las primeras tres unidades se denominan “extensión”, mientras que la (-)-epicatequina-3-O-galato con la posición libre del carbono 4 se denomina “terminal”. Un tetrámero hipotético formado por subunidades que comprenden la mayoría de los taninos, se muestra en la Figura 11. En esta Figura, la (+)-catequina, (-)-epicatequina y epigalocatequina son las subunidades de “extensión”, debido a que ellos muestran puentes interflavánicos entre sus carbonos 4 y 8 de su subunidad adyacente. Por su parte, la (-)-epicatequina-3-O-galato es la unidad terminal y tiene su posición del carbono 4 libre, pero con el ácido gálico esterificado al grupo hidroxil en el carbono 3. Generalmente, los monómeros de (+)-catequina y (-)-epicatequina constituyen la mayoría de las unidades de extensión en los taninos de las bayas, donde (-)-epicatequina es usualmente mayoritaria entre las dos. Los taninos varían en tamaño desde dímeros hasta polímeros de más de 30 subunidades. Los taninos de los hollejos difieren de los taninos de las semillas en que los primeros poseen un mayor tamaño promedio de polimerización que los taninos de las semillas y que además los taninos de los hollejos poseen epigalocatequina mientras la semilla carece de ella (Adams, 2006). Por el contrario, los taninos de las semillas poseen subunidades de (-)-epicatequina-3-O-galato, mientras que este monómero esta débilmente presente en los taninos del hollejo (Cheynier, 2005). - 19 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Además de los puentes inteflavánicos entre los carbonos 4 y 8, existe la unión mediante los carbonos 4 y 6. La ruta en el cual los puentes interflavánicos 4-6 y 4-8 son formados es aún desconocida y existen al menos dos problemas estrechamente relacionados de la biosíntesis de los flavan-3-oles. El primero es saber como los puentes interflavánicos son formados y el segundo es el lugar en la célula donde ocurre esta reacción. Si ocurre en la vacuola, donde los taninos están finalmente localizados, entonces la preguntada surgida estaría relacionada con el ingreso de éstos a través del tonoplasto. Sin embargo, si los puentes son formados en el citoplasma u otros organelos (como los plastidios), entonces la pregunta sería como son transportados a través de las membranas (Adams, 2006). Actualmente, las investigaciones sobre proantocianidinas han sido generalmente focalizadas en estas preguntas y en otras, tales como su comportamiento durante el desarrollo en la fruta (Ribéreau-Gayon, 1971 y 1972b; Downey y col., 2003; Czochanska y col., 1979), diferencias varietales (Singlenton y col., 1966) y extracción durante la maceración (Bertg y Akiyoshi, 1956; Canals y col., 2005). 4. Biosíntesis de los compuestos fenólicos La ruta de biosíntesis fenilpropanoide comienza con el aminoácido proveniente del metabolismo primario fenilalanina, generado a partir de fenil piruvato (ruta metabólica del ácido shiquímico) mediada por L-fenilalanina-2-ketoglutarato amino transferasa (PKA) en presencia de L-glutamato. Este último actúa como un donante amino, convirtiéndose en 2-ketoglutarato. La fenilalanina es así transformada mediante la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) a ácido trans-cinámico, acompañado por la liberación de iones amonio (Hasegawa y Maier, 1970) (Figura 12). Figura 12. Biosíntesis de ácido trans-cinámico según Hasegawa y Maier (1970). Se ha observado que la actividad de la PAL depende del suministro del aminoácido precursor fenilalanina, la temperatura y la luz. El ácido cinámico es a su vez hidrolizado por la enzima cinamato- - 20 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 4-hidroxilasa (C-4-H) a ácido p-cumárico. En este paso final, se genera p-cumaril coenzima A (CoA) a partir de coenzimas libres mediante una CoA ligasa específica (Hrazdina y col., 1984) (Figura 13). Igualmente, la ruta del ácido cinámico a ácido cafeico, ferúlico y sinápico incluye la correspondiente CoA esterasa. La segunda etapa fundamental en la formación de flavonoides, es una modificación en la ruta guiada por poliquétidos mediante una biosíntesis de tipo ácido graso no reductivo. A medida que se forma el trímero, hay una tendencia de este último a ciclar para formar un anillo aromático. Esto da como resultado naringina calcona como un producto primario a partir de p-cumaril CoA. La clave en la formación de compuestos fenólicos esta en la habilidad de que esta calcona pueda sufrir una segunda ciclación originando una flavonona, la narigenina. La narigenina es el precursor de flavonoles, antocianinas, flavan-3-oles y flavan-3,4-dioles, originando estos dos últimos las proantocianidinas (Soleas y col., 1997) (Figura 13). Figura 13. Biosíntesis de compuestos flavonides según Hrazdina y col. (1984). Trabajos recientes sobre la síntesis de proantocianidinas en semillas de Arabidopsis, han demostrado una estrecha relación entre antocianinas y proantocianidinas (Xie y col., 2003). Como se describió anteriormente, dos proantocianidinas de alta importancia son la (+)-catequina (2,3-trans-flavan-3-ol) y la (-)-epicatequina (2,3-cis-flavan-3-ol). Esta estequiometría diferencial está establecida por la reacción de la calcona sintetasa. Esto significa que el flavan-3,4-diol producido a partir de flavanonol - 21 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - mediante la dihidroxireductasa ya tiene la configuración 2,3-trans y puede ser convertido directamente en (+)-catequina por una leucoantocianidina reductasa (LAR). Mientras se ha encontrado una enzima capaz de producir (+)-catequina a partir de 3,4-diol (Stafford y Lester, 1984), ninguna enzima ha sido encontrada capaz de producir (-)-epicatequina (2,3-cis) a partir de 2,3-trans-flavan-3,4-ol. Xie y col. (2003), demostraron que la (-)-epicatequina es producida a partir de la cianidina por la acción de una enzima (antocianidina reductasa: ANR) la cual convierte la cianidina y delfinidina en (-)epicatequina y epigalocatequina, respectivamente. Como se ha señalado anteriormente, la (-)epicatequina es la unidad de extensión de taninos en células hipodermales de semillas más predominante, sugiriendo que la cianidina juega un rol importante como un intermediario en la biosíntesis de taninos en bayas de uva. En el caso de los hollejos, cuando la epigalocatequina es encontrada como una subunidad del tanino, la cianidina y delfinidina podrían ser importantes intermediarios en la biosíntesis de ella (Adams, 2006). Bogs y col. (2005) encontraron que en bayas de vid, la enzima ANR fue codificada por un único gen mientras que la enzima LAR es codificada por dos genes relacionados estrechamente. El gen de ANR se expresa en hollejos y semillas de bayas hasta el inicio de la maduración, mientras que los genes de LAR muestran diferentes patrones de expresión en semillas y hollejos. El tiempo y expresión de los genes de ANR y LAR, de acuerdo a los autores mencionados, fueron consistentes con la acumulación de proantocianidinas en bayas, sugiriendo que son responsables de la composición de taninos de la fruta durante la maduración. En relación a los antocianos, diversos estudios han mostrado la importancia de la enzima UDP glucosa flavonoide 3-O-glucosil transferasa (UFGT) en la acumulación de antocianinas y el reconocimiento de las agliconas como importantes intermediarios en la biosíntesis de taninos y antocianinas de los tejidos de bayas (Downey y col., 2003). Finalmente, se ha observado que la producción de estilbenos como el trans-resveratrol, esta acompañada por la condensación de p-cumaril CoA con tres moléculas de malonil CoA a través de la actividad de la resveratrol sintetasa (Soleas y col., 1997). 5. Factores reguladores de la biosíntesis de flavonoides Diversos factores afectan la biosíntesis de flavonoides en plantas, tales como nutrición, vigor, suelo, agua, reguladores de crecimiento, ataque de microorganismos, presencia de heridas, altitud, luz, temperatura, humedad y cultivar. A pesar que muchos de estos factores han sido estudiados en Vitis vinifera (con un gran enfoque en las antocianinas), la mayoría de la investigación publicada se ha realizado en especies modelos como Arabidopsis thaliana (Downey y col., 2006). 5.1. Nutrición. La disponibilidad nutricional tiene una influencia fundamental en el crecimiento de la planta y se ha demostrado afectar la composición fenólica en los tejidos de la planta. De los tres nutrientes comúnmente aplicados como fertilizantes (nitrógeno, potasio y fósforo) sólo el nitrógeno y - 22 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - potasio han sido fuertemente investigados (Keller, 2003; Kliewer, 1977; Russel, 1961; Marschner, 1995). Tanto bajos y excesivos niveles de nitrógeno, así como altos niveles de potasio han mostrado disminuir la concentración de flavonoides en el hollejos de bayas (Delgado y col., 2004; Kliewer, 1977; Marschner, 1995; Jackson y Lombard, 1993). El mecanismo probable de la disminución del contenido de compuestos fenólicos con altos contenido de niveles de nitrógeno y potasio podría estar relacionado con el excesivo vigor (Downey y col., 2006). 5.2. Vigor. Se ha observado que el vigor de la vid afecta fuertemente el contenido y la composición fenólica de bayas de Pinot noir. En los hollejos, se ha observado mayores contenidos de proantocianidinas, mayor proporción de subunidades de epigalocatequinas en los proantocianidinas poliméricas y mayor tamaño promedio de polimerización en bayas provenientes de uvas producidas en viñas de bajo vigor. Es una incertidumbre conocer si esta diferencia es debida al efecto del vigor o a cambios en la arquitectura resultante de la exposición diferencial a la luz y temperatura de los racimos (Cortell y col., 2005). 5.3. Características edáficas y déficit hídrico. Las características físicas del suelo (composición nutricional, estructura y textura) pueden también afectar la acumulación de los flavonoides, pues tienen un significativo efecto sobre el crecimiento de la planta. Sin embargo, la mayor consecuencia del tipo de suelo está referida a la capacidad de retención de agua del mismo (Russel, 1961; Marschner, 1995). La irrigación puede aliviar las reducciones relacionados con el estrés hídrico en el desarrollo y crecimiento de la planta, aunque diversas investigaciones sugieren que el déficit hídrico aumenta la síntesis de antocianinas y taninos en bayas (Cortell y col., 2005). En el caso de las células de las bayas, la biosíntesis de antocianinas es extremadamente sensible al estrés osmótico (Nadal y Arola, 1995). Contrariamente, mientras algunas investigaciones sugieren que la excesiva aplicación de agua disminuye el contenido de taninos, otros mencionan que el déficit hídrico tiene un nulo o bajo efecto sobre la acumulación de antocianinas y taninos en las bayas de vid (Kennedy y col., 2000a). Más bien el efecto del déficit hídrico estaría relacionado con la disminución del tamaño de la baya y la relación del peso hollejo/peso baya lo cual afectaría la concentración de taninos y antocianinas en la baya (Downey y col., 2006). A pesar de lo anterior, investigaciones recientes indican que los cambios en la estructura y desarrollo de los hollejos son responsables de este efecto, más que algún efecto directo en la biosíntesis de los flavonoides (Roby y col., 2004). La dificultad de interpretar el impacto de la disponibilidad de agua, es que ésta tiene un efecto sobre un amplio rango de procesos de la planta aparte de la biosíntesis de los flavonoides, tales como el cierre/apertura estomática, fotosíntesis, acumulación de fotoasimilados, crecimiento vegetativo y radicular y en casos extremos podría afectar relación fuente-receptáculo produciendo senescencia de algunos tejidos (Jones, 1992). 5.4. Hormonas. En el caso de los reguladores de crecimiento, tales como ácido abscísico, etileno, citoquininas, giberelinas y auxinas, su influencia ha sido específicamente examinada en la biosíntesis - 23 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - de flavonoides. En Vitis vinifera, el ácido abscísico ha mostrado aumentar la acumulación de antocianinas en bayas de cultivares Olympia, Kyoho y Cabernet Sauvignon (Matsushima y col., 1989; Dan y Lee, 2004; Jeong y col., 2004). Por otro lado, se ha observado que la aplicación de giberelinas (GA3) disminuye los niveles de antocianinas, mientras que ácido giberélico que es usualmente aplicado en uva de mesa para aumentar el tamaño de las bayas, produce una disminución de las antocianinas producto de un efecto de dilución. Similar efecto se ha observado con el regulador de crecimiento forclorfenuron (N-(2- cloro-4-pirridil)-N`-fenilurea; CPPU) (Dan y Lee, 2004). De la misma manera, auxinas y citoquininas han mostrado aumentar la biosíntesis de antocianinas (Deikman y Hammer, 1995), mientras que la aplicación de la auxina ácido naftalenacético inhibe la acumulación de antocianinas en Cabernet Sauvignon (Jeong y col., 2004). Además, se ha visto que la aplicación de auxina sintética benzotiazol-2-oxiacético retrasa el inicio de la maduración incluyendo la acumulación de antocianinas en los hollejos, producto de un retraso en la expresión de genes que codifican en pasos críticos de la biosíntesis de antocianinas tales como la calcona sintetasa y la UFGT (Davies y col., 1997). Similares resultados fueron observados en el cultivar Kyoho con la aplicación de ácido 2,4diclorofenoxiacético inhibiendo la acumulación y expresión de los genes de la ruta fenilproponaoide fenilalanina amonioliasa, calcona sintetasa, calcona isomerasa, dihidroxiflavonol reductasa y UFGT, mientras que los mismos genes fueron sobreexpresados y el contenido de antocianinas aumentado con la aplicación de ácido abscísico (Ban y col., 2003). Finalmente, en el caso de la aplicación del etileno, se ha observado que no afecta la acumulación de antocianinas en Arabidopsis thaliana (Deikman y Hammer, 1995), mientras que en bayas de uva parece ser un requisito las bajas concentraciones endógenos de etileno para la biosíntesis de antocianinas (Chervin y col., 2004). No obstante lo anterior, otras investigaciones muestran que aplicaciones exógenas de etileno o de compuestos liberadores de éste, realzan la intensidad colorante en hollejos (Roubelakis-Angelakis y Kliewer, 1986). 5.5. Heridas y enfermedades. Se ha demostrado que estos factores impactan la biosíntesis de la ruta fenilpropanoide. Sin embargo, a pesar que se ha investigado ampliamente el aumento de producción de fitoalexinas [resveratrol y viniferina (dímero de resveratrol)] en presencia de heridas y enfermedades fungosas en bayas, no se ha extendido al estudio del efecto de estos parámetros en la biosíntesis de flavonoides (Langcake y Pryce, 1977; Jeandet y col., 1995). 5.6 Altitud. El efecto de la altitud sobre la composición fenólica también ha sido investigado. En cultivares Vitis vinifera Touriga Nacional y Francesa se ha observado un aumento en la concentración de antocianinas con el aumento de la altitud de 150, a más de 250 metros sobre el nivel del mar (Mateus y col., 2002). Por el contrario, mientras que contenidos de monómeros, dímeros de flavan-3oles y contenido de proantocianidinas totales en hollejos disminuyen con el aumento de la altitud, el contenido de monómeros y proantocinidinas en semillas disminuye en Touriga Nacional pero aumenta en Touriga Francesa (Mateus y col., 2001). De todas formas es poco probable que estos resultados se deban estrictamente a efectos de la altitud, sino más bien a condiciones climáticas diferenciales. - 24 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 5.7. Luz. Los primeros experimentos para observar el efecto independiente de la luz y temperatura en la síntesis de antocianinas, se realizaron hace más de 30 años en plantas de los cultivares Cabernet Sauvignon y Pinot Noir cultivadas bajo invernadero (Kliewer y Torres, 1972; Dokoozlian y Kliewer, 1996). Los autores mencionados observaron un aumento de la síntesis de antocianinas de las frutas expuestas a la luz comparadas con aquellas sombreadas. Más adelante, diversos autores han evaluado en forma independiente estos parámetros. Bergqvist y col. (2001), observaron que aumentos de sobre 100 mmol/m2/s sobre el lado sombreado de la hilera de la canopia, producían un aumento en la acumulación de las antocianinas de hollejos de Cabernet Sauvignon y Grenache. Por el contrario, cuando la exposición excedió los 100 mmol/m2/s en el lado sur de la hilera de la canopia el contenido de antocianinas comenzó a disminuir. Otros autores (Spayd y col., 2002) observaron que los hollejos del lado este de las hileras (con exposición de la luz de la mañana y menor temperatura) presentaron mayores concentraciones de antocianinas que las bayas de la cara oeste de las hileras (con exposición de la luz de la tarde y mayor temperatura) consistente con lo observado por Bergqvist y col. (2001). Ambos autores, y respectivos colaboradores, observaron que la diferencia de temperatura entre los racimos expuestos al sol y sombreados fue mayor a 10ºC y que la fruta expuesta alcanzó una temperatura mayor a la temperatura ambiental. En otros estudios, se observó que cuando las bayas de racimos de uva fueron expuestas a la luz, la acumulación de flavonoles glucosilados fue mayor comparada con el contenido de estos compuestos en bayas de frutos sombreados. Contrariamente, se ha observado recientemente, que el cambio de los niveles de flavonoles en hojas y frutos en fruta sin exposición a la luz es insignificante, comparada con los tejidos expuestos a la luz que presentaron un aumento en la acumulación y expresión de genes codificantes para la enzima flavonol sintetasa (Downey y col., 2004). Tanto en semillas como hollejos de bayas de Syrah no se han observado diferencias claras en la acumulación de proantocinidinas cuando los racimos son expuestos a la luz (Downey y col., 2004; Downey y col., 2006). Sin embargo, en el primer estudio, se pudo observar que las bayas sombreadas alcanzaron un máximo en el contenido de proantocianidinas menor que en las bayas expuestas a la luz. 5.8. Temperatura. En general, la literatura sugiere que la temperatura tiene un efecto mayor en la biosíntesis de antocianinas que la luz, mencionando que la incidencia de la irradiación solar por sobre los 100 mmol/m2/s provoca un aumento en la temperatura de la baya que impacta negativamente la biosíntesis de antocianinas (Downey y col., 2006). A pesar de lo anterior, la información del efecto de la temperatura sobre la biosíntesis de antocianinas es poco precisa. Temperaturas constantes diarias de 20ºC producen mayores concentraciones de antocianinas que temperaturas de de 30ºC (Buttrose y col., 1971). Asimismo, en condiciones de temperaturas nocturnas de 15ºC se produce una mayor acumulación de antocianinas que con temperaturas nocturnas de 30ºC (Mori y col., 2005). En cuanto a la temperatura crítica para la producción de metabolitos primarios, Ferrini y col. (1995) indican que se encontraría entre los 27,5 y 35,0ºC mientras que Coombe (1987) sugiere temperaturas que bordean los 30ºC. Es interesante notar que en leguminosas forrajeras se ha observado que el estrés provocado por - 25 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - altas temperaturas produce una menor acumulación de taninos en las hojas, pero una mayor producción de biomasa (Carter y col., 1999). Esta observación implicaría que la biosíntesis de metabolitos secundarios sería inhibida bajo condiciones óptimas de acumulación de biomasa sugiriendo que ciertas condiciones de estrés estimularían la producción de metabolitos secundarios. 5.9. Humedad. La aplicación de tratamientos de sombreamiento altera sustancialmente la temperatura y humedad de la canopia (Haselgrove y col., 2000). Disminuciones de la humedad provocarían disminuciones en el déficit de presión de vapor, con una consecuente baja en la transpiración, fotosíntesis y síntesis de flavonoides. Por el contrario, aumentos en la humedad relativa podrían generar síntesis indirectas de flavonoides en heridas causadas por patogénesis fúngicas y/o bacteriales (Vogt y col., 1994). 5.10. Cultivar. Tal como se mencionó anteriormente, las actuales variedades de uva para producción de vino son de la especie Vitis vinifera y Vitis labrusca, que en un proceso de selección, forman un inmenso patrimonio varietal (Hidalgo, 2003). Es evidente que los frutos de diversas cepas no se comportan de la misma manera durante la maduración y es posible observar que los mostos acusan importantes diferencias en su composición. Diversos autores han estudiado el efecto varietal en la composición fenólica de hollejos y semillas, demostrando una estrecha relación entre ambos componentes. Santos-Buelga y col. (1995) y Fuleki y Ricardo da Silva (1997), encontraron claras diferencias en la composición y concentración flavánica entre semillas de cultivares Vitis vinifera. Por otra parte, Monagas y col. (2003) y Rodríguez-Montealegre y col. (2006) observaron diferentes comportamientos cuantitativos en la composición fenólica en hollejos entre cultivares Vitis vinifera. Tal como se indicó anteriormente, los compuestos fenólicos corresponden a uno de los constituyentes de mayor relevancia en la uva para producción de vino. Estos compuestos provienen del metabolismo secundario de los vegetales y en los frutos de Vitis vinifera se encuentran principalmente en hollejos y semillas. Sumado a lo anterior, existe una enorme diversidad de variables que impactan la composición fenólica en semillas y hollejos de bayas de Vitis vinifera y muchas de estas variables están estrechamente relacionadas y difíciles de aislar. La importancia de los compuestos fenólicos radica en su participación en propiedades sensoriales de gran interés como son el color, aroma, amargor y astringencia. La variación de estos parámetros se correlaciona con estados fenológicos específicos de la vid, principalmente en la maduración del fruto, donde los compuestos fenólicos son utilizados como índices de cosecha. De los parámetros anteriormente mencionados, la astringencia constituye uno de los parámetros sensoriales más estudiados por su efecto altamente significativo en la calidad del producto final y la discusión acerca de su correlación con la composición fenólica es aún contradictoria por lo que es de suma importancia analizar los antecedentes descritos en la literatura actual. - 26 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 6. Fluido salival: aspectos generales. El término “saliva entera”, “saliva mixta” o “fluido oral” es usado indistintamente para describir la combinación de fluidos en la cavidad oral (Mandel, 1980; González y col., 1994; Schipper y col., 2007; Van Nieuw Amerongen y col., 2004). La saliva entera es un secreción exocrina de alta complejidad, líquida, incolora, sin olor ni sabor, de viscosidad variable, constituida principalmente por agua (99,5%), proteínas (0,3%) y substancias inorgánicas (0,2%). La fracción de proteínas de la saliva (1-2 mg/L) está constituida principalmente por glicoproteínas, enzimas (tales como, α-amilasa y anhidrasa carbónica), inmunoglobulinas y un amplio rango de péptidos (cistatinas, estaterina, histatinas y proteínas ricas en prolina, entre otros) (Troxler y col., 1990; Humphrey y Williamson, 2001; Van Nieuw Amerongen y col., 2004; De Smet y Contreras, 2005). La fracción inorgánica contiene los electrolitos usuales de un fluido corporal típico (sodio, potasio, cloro y bicarbonato) pero con concentraciones diferenciales que caracteriza a la saliva como un fluido hipotónico (Schipper y col., 2007). Los constituyentes de la saliva cumplen importantes funciones en la digestión y nutrición. En el caso del agua permite que los alimentos se disuelvan y se perciba su sabor en el sentido del gusto. Los iones cloruro, activan la amilasa salival o ptialina, mientras que el bicarbonato y fosfato neutralizan el pH de los alimentos y protegen de la corrosión bacteriana. El mucus lubrica el bolo alimenticio para facilitar la deglución y avance a lo largo del tubo digestivo sin dañarlo. Por otra parte, la lisozima, es una enzima con efectos antimicrobianos mientras que otras enzimas, como α-amilasa, hidroliza parcialmente el almidón en la boca, comenzando la digestión de los hidratos de carbono (Schipper y col., 2007). La saliva mixta o total es producida durante todo el día a distintas velocidades por un grupo de glándulas exocrinas (glándulas salivales mayores y menores) situadas en la cavidad bucal (Figura 14). Figura 14. Ubicación de glándulas parótida, sublingual y submandibular. - 27 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Las glándulas salivales mayores más importantes son: las glándulas parótidas, situadas a nivel de las mejillas, que vierten su secreción a la boca a través del conducto de Stenon; las glándulas submandibulares, ubicadas a ambos lados del piso de la boca, que vierten la saliva a través del conducto de Wharton y, las glándulas sublinguales, que se sitúan en la parte anterior y central del piso de boca, vertiendo el fluido salival por los conductos de Rivinus y Bartholin (Silvers y Som, 1998). Otras glándulas que también secretan fluidos salivales son las glándulas salivales menores palatinas, situadas en el paladar blando, así como otras glándulas más pequeñas situadas en la lengua, mejillas y labios (Silvers y Som, 1998;). Las glándulas salivales difieren del tipo de secreción que producen, específicamente por la proporción diferencial de células serosas y mucosas que las constituyen. Las células serosas que se encuentran principalmente en las glándulas parótidas y parcialmente en las glándulas submandibulares, secretan un fluido acuoso, esencialmente debido a su carencia de mucinas. Esta secreción es producida en respuesta a estímulos. Las células mucosas, presentes pincipalmente en las glándulas sublinguales y parcialmente en las glándulas submandibulares, producen una secreción mucho más rica en mucus, la cual es viscosa y más o menos elástica (Schipper y col., 2007). La producción de saliva se encuentra entre 0,3-7 mL/min (Edgar, 1990), con cerca de 0,5-1,5 L secretada por día (Humphrey y Williamson, 2001). El pH de la saliva se encuentra entre los 6,2 y 7,4 con los valores mayores a medida que la secreción salival aumenta (Schipper y col., 2007). El flujo salival se ve aumentado con la presencia de alimentos, substancias irritantes en la boca y por estimulación del sentido de la vista y olfato (Christensen y Navazesh, 1984). Lee y Linden (1992) observaron que en respuesta a un estímulo olfatorio el fluido salival secretado proviene principalmente de la glándula submandibular pero no de la parótida. Los fluidos salivales glandulares convergen en la cavidad oral, se mezclan con la ayuda de los movimientos de la lengua, interactúan fisicoquímicamente entre sí y organizan el film o película salival. El contenido total de saliva en la cavidad bucal se ve afectado por diversos factores, entre los cuales destacan edad, género, características genéticas, condición de salud bucal, estado físico, velocidades de flujos salivales glandulares, ritmo cardiaco, actividad diferencial de las glándulas salivales, duración y tipo de estímulo, dieta alimenticia, consumo de fármacos y estatus psicológico (Mandel, 1980; Schipper y col., 2007; Soderling y col., 1993; Drouin y col., 1988; Baum, 1994; Navazesh y col., 1992; Ben-Aryeh y col., 1984). - 28 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 7. Proteínas de la saliva. 7.1. Familias de proteínas. La Figura 15 muestra las mayores familias de los componentes proteicos salivales y sus pesos moleculares estimados, desde las pequeñas histatinas hasta las mucinas (Levine, 1993). Histatina Estaterina Cistatina Lisozima Proteinas ricas en prolina Anhidrasa carbónica Amilasas Peroxidasas Lactoferrina Mucina 2 Sig A Mucina 1 1 2-4 kDa 4-5 kDa 14 kDa 14 kDa 10-30 kDa 42-45 kDa 55-60 kDa 75-78 kDa 75-78 kDa 130 kDa 380 kDa > 1000 kDa 10 100 Tamaño (kDa) 1000 10000 Figura 15. Familias de los componentes salivales y sus pesos moleculares estimados según Levine (1993). 7.2. Funcionalidad de las proteínas salivales. La mayoría de las proteínas salivales son multifuncionales, es decir, cumplen más de una función fisiológica (Figura 16). Esta propiedad permite que grandes variaciones individuales en la concentración de diferentes componentes salivales no afecten la calidad del recubrimiento protector de la saliva (Levine, 1993). Por ejemplo, las moléculas más grandes, como las mucinas, juegan un rol en la lubricación, revestimiento del tejido e interacciones de la saliva con bacterias y hongos. Las moléculas más pequeñas, como las estaterinas, cumplen funciones en la mineralización, lubricación e interacciones bacterianas. Es importante notar que las diferentes funciones mostradas por una molécula pueden ser atribuidas a un sitio bioactivo en particular o a la molécula entera. Así, distintos miembros de una misma familia de proteínas salivales, que difieren entre sí en una fracción menor de aminoácidos o en modificaciones químicas que se les incorporan después de su síntesis, pueden presentar funciones distintas. Este es el caso de las proteínas salivales ricas en prolina (PRPs), una familia de proteínas sintetizada principalmente por las glándulas parótidas (Bennick y col., 1981). Entre los miembros de esta familia se distinguen formas ácidas, - 29 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - glicosiladas y básicas, con un porcentaje de participación de 30, 23 y 17% en la saliva, respectivamente (Bennick, 1982; Kauffman y Keller, 1979). El papel específico de cada uno de los tipos de PRPs no está claro todavía. Sin embargo, a estas proteínas se les atribuyen múltiples funciones protectoras, tales como fijación de los virus (Beeley, 2001), mantención de la homeostasis del calcio (PRPs ácidas) (Gron y Hay, 1976), lubricación de la cavidad bucal (Hatton y col., 1985) y aglutinación bacteriana (Bergey y col., 1986). No obstante lo anterior, la única función biológica de las PRPs básicas hasta ahora conocida es su capacidad de fijación de polifenoles (Lu y Bennick, 1998). Figura 16. Multifuncionalidad de las proteínas según Levine (1993). 7.3. Composición aminoacídica de las PRPs. Todas las PRPs poseen un alto grado de homología, porque son codificadas por un número pequeño de genes (Kauffman y col., 1993). Su composición (Cuadro 1) es característica en cuanto sólo tres aminoácidos -prolina, glicina y glutamina- dan cuenta del 70-80% del contenido total de aminoácidos (Stubbs y col., 1998). En estas proteínas, los aminoácidos más abundantes se organizan en secuencias conservadas de 19 residuos, las que en una molécula de proteína se repiten un número variable de veces (5-15 veces), lo que genera una estructura proteica que en solución está normalmente extendida y abierta, propiedad que puede ser favorable para su interacción con los taninos (Benninck, 1987; Murray y Williamson, 1994). Estos mismos estudios de composición muestran que las fracciones de PRPs acídicas I y II tienen composiciones similares y que las fracciones de PRPs básicas y glicosiladas tienen contenidos substancialmente mayores de prolina. - 30 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - Cuadro 1. Composición de aminoácidos de fracciones de PRP de saliva parótida humana (Bacon y Rhodes, 2000). Aminoácido Ácido aspártico/asparagina Treonina Serina Ácido glutámico/glutamina Prolina Glicina Alanina Cisteína Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Histidina Lisina Arginina Acídicas I mol/100mol 8,5 0,4 4,3 24 25,9 18,5 2 0 1,8 0 1,2 2,8 0 0,9 3,3 2,8 3,7 Acídicas II mol/100mol 6,5 1,7 4,9 25,9 22,1 16,3 1,4 0 2,9 0 1,7 4,1 0 3,2 1,9 2,3 4,9 Glicosiladas mol/100mol 5,1 0,5 6,4 18,8 33,3 19,8 1 0 0,7 0 0,5 1 0 0,5 2,9 4,8 4,7 Básicas mol/100mol 8,6 0 6,5 19,2 32,4 18 2,5 0 1,1 0 1,1 2,2 0 0 0 6,2 2,3 8. Interacción tanino-proteína y su relación con la percepción de astringencia 8.1. Astringencia. Corresponde a una percepción asociada al consumo de comidas y bebidas ricas en taninos, que se caracteriza por una sensación de sequedad y rugosidad en la cavidad bucal. Esta sensación, considerada inicialmente por Aristóteles (384-322 A.C.) como un gusto, hace sólo décadas fue descrita en términos fisicoquímicos por Joslyn y Golstein (1964) como el resultado de una fuerte interacción entre los taninos y las proteínas salivales. Esta sensación no está vinculada con una región particular de la boca, siendo un fenómeno difuso que demora entre 15-20 segundos en manifestarse y su pérdida gradual se relacionaría muy probablemente con el lavado de los complejos taninosproteínas por parte de saliva fresca (Valentova, 2002). 8.2. Interacción de las proteínas con polifenoles con el fin de neutralizar compuestos dañinos. Tal como se mencionó anteriormente, la saliva parotídea de los animales herbívoros y omnívoros, incluyendo humanos, contiene proteínas ricas en prolina (PRPs). Estas proteínas presentan una alta afinidad por los taninos (Haslam, 1998). Se ha postulado que los complejos PRPs-taninos son estables en todo el tracto digestivo, modulando así cualquier efecto fisiológico de los taninos. Se cree ampliamente que las proteínas salivales pueden actuar como una defensa primaria contra taninos perjudiciales (principalmente taninos de alto peso molecular) mediante la formación de complejos insolubles que impiden su absorción en el canal intestinal y su interacción con otros componentes - 31 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - biológicos (Bennick, 2002). Se ha visto que los polifenoles pueden tener una variedad de efectos dañinos en animales, incluyendo la interferencia del uso del hierro de la dieta alimenticia y la inhibición de las enzimas digestivas. La capacidad de las PRPs de unirse a los polifenoles y precipitarlos, podría prevenir efectivamente que aquellos lleguen a ser eficaces y provoquen algún efecto nocivo en el tracto gastrointestinal (Lu y Bennick, 1998). Esta función de las PRPs ha sido respaldada por un amplio número de estudios, en particular aquellos que muestran que las PRPs básicas son producidas sólo por animales que consumen dietas con cantidades significativas de polifenoles (Mole y col., 1990). 8.3. Otras proteínas salivales que interactúan con compuestos fenólicos. Las PRPs no son ciertamente las únicas que se unen a los polifenoles. Por ejemplo, se ha observado que los polifenoles se unen con las histatinas, proteínas salivales que contienen una alta proporción de residuos de histidina (Nautaro y col., 1999). Sin embargo, numerosas otras proteínas salivales con distintas composiciones aminoacídicas pueden también interactuar con polifenoles. Así, Charlton y col., (2002a), señalan que los residuos de fenilalanina también son importantes sitios de interacción, aunque en la mayoría de las proteínas estas cadenas laterales están ocultas y, en general, escasamente disponibles. Los residuos de arginina, aunque menos importantes por interactuar débilmente con los polipéptidos, contribuyen claramente a la unión polifenol-proteína ya que se ha encontrado algunos polifenoles unidos simultáneamente en distintos sitios de un polipéptido que contiene arginina, lo que puede fortalecer la interacción entre polifenol y polipéptido. 8.4. Compuestos fenólicos que interactúan con proteínas salivales. En general, se ha descrito que los compuestos fenólicos responsables de la astringencia del vino son polímeros de flavan3-ol designados comúnmente como proantocianidinas o taninos condensados (Gawel, 1998). Estos se extraen de pieles y semillas de la uva en la maceración durante la vinificación alcanzando una concentración de hasta 4 g/L en un vino tinto (Ribéreau-Gayon, 1972a). En cuanto a la interacción diferencial de compuestos fenólicos, Bacon y Rhodes (2000) analizaron 14 tipos de compuestos fenólicos y su relativa afinidad con las proteínas salivales. Por ejemplo, estos autores encontraron una alta afinidad del ácido tánico con las proteínas salivales, lo que los llevó a concluir que los taninos con un bajo grado de galoilación tienden a unirse menos con las proteínas salivales. Mediante la medición de constantes de disociación, Baxter y col. (1997) determinaron que los polifenoles con mayor tamaño y más complejos interactúan más fuertemente con fragmentos de PRPs. Haslam (1998) ha postulado que los taninos más grandes tienen la capacidad de formar múltiples uniones o puentes con residuos vecinos de prolina y también para asociarse y apilarse con otras moléculas de taninos después de unirse a las proteínas. En contraste, los fenoles simples podrían tener sólo la oportunidad de unirse a residuos de prolina simples. En cuanto a la afinidad de compuestos fenólicos con distintas clases de proteínas ricas en prolina, Bacon y Rhodes (1998) demostraron que la epigalocatequina presenta una alta afinidad con proteínas salivales, menor con otras proteínas ricas en prolina, como la gelatina, pero - 32 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - una baja o nula afinidad con otras proteínas analizadas, incluyendo la α-amilasa de la saliva. Sin embargo, es claro que la unión entre epigalocatequina y fracciones de proteínas ricas en prolina es mayor en comparación con la mayoría de las demás proteínas. 8.5. Unión entre proteínas salivales y compuestos fenólicos. Las interacciones hidrofóbicas han sido mencionadas recurrentemente como las principales fuerzas impulsoras hacia la asociación polifenol-proteína (Hatano, 1999), probablemente a través de la vinculación del hidrógeno de los grupos fenólicos con los grupos carbonílicos de los residuos de prolina (Hagerman y Butler, 1980). No obstante, algunos autores postulan que este modo específico de unión entre polifenoles y PRPs es altamente improbable ya que la naturaleza de la interacción dependería, entre otros factores, de la naturaleza y tamaño del polifenol, de su conformación espacial (estereoquímica), de la naturaleza de la proteína y del medio en el cual la interacción ocurre (Simon y col., 2003). De acuerdo a Hagerman y Butler (1981), las interacciones entre proteína y proantocianidina, depende principalmente de la vinculación del hidrógeno. Asimismo, Haslam (1996) describió la formación de complejos entre polifenoles y proteínas, como un ejemplo específico del reconocimiento molecular en el que los polifenoles actúan como un ligando multidentado, con participación de sus núcleos aromáticos y grupos fenólicos, donde la fuerza impulsora o facilitadora principal parece ser el efecto hidrofóbico. Igualmente, otros autores explican la interacción entre el fenol con una superficie rígida, plana y abierta del anillo de pirrolidina de un residuo de prolina a través de fuerzas hidrofóbicas (Charlton y col., 2002a; Hatano y col., 1999). Según Jöbstl y col. (2004), los polifenoles son ligandos multidentados capaces de unirse a través de grupos fenólicos diferentes, en forma simultánea y en más de un punto con una proteína. Estos autores postulan que la precipitación proteína-polifenol ocurre en tres etapas (Figura 17). Figura 17. Precipitación proteína-polifenol en tres etapas según Jöbstl y col. (2004). En la primera etapa, las proteínas están libres con una conformación aletoriamente enrollada (random coiled protein). La unión simultánea de los polifenoles multidentados en varios sitios de la proteína - 33 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - lleva al enrollamiento de la proteína alrededor de los polifenoles, provocando una disminución en el tamaño físico de la proteína y haciendo a ésta más compacta y esférica. Uniones individuales de polifenoles en diversos sitios de una proteína aumenta la afinidad y la unión global, por lo que Hagerman y Butler (1981) han propuesto que la abertura y estructura flexible de la proteína es un requisito previo para la unión al tanino. En la segunda etapa, a medida que la concentración de polifenoles aumenta, los polifenoles complejados en la superficie de la proteína se unen a otras proteínas con las consiguiente dimerización u oligomerización, causando la insolubilización. En la última etapa, a mayor unión del polifenol, los dímeros u oligómeros se agrupan y las partículas resultantes precipitan. Diversos autores han estudiado la naturaleza de la unión entre proteínas y compuestos fenólicos. Jöbstl y col. (2004), han estudiado la interacción entre el polifenol (-)-epigalocatequina 3-O-galato (EGCG) y B-caseína, una proteína que presenta una conformación extendida y prolinas expuestas en forma similar a las PRPs de la saliva. De acuerdo a estos autores, la agregación se hace notoria cuando la proporción de sitios de unión al fenol por parte de la proteína es de 0,6:1. Por otra parte, Simon y col. (2003) analizaron las interacciones entre la proantocianidina B3 [(+)-catequina-4α→8-(+)-catequina)] presente en el vino tinto y un fragmento de 14 aminoácidos de la proteína salival humana IB714. Según éstos autores, hay evidencia clara que IB714 y B3 forman un complejo más estable cuando se encuentran en proporción 1:3, respectivamente, dado que para disociar este complejo se requirió un voltaje mayor que el necesario para disociar los complejos 1:1 o 1:2, hecho que indicaría una fuerte estabilidad de la unión de 1:3. De la misma manera, los mismos autores observaron que el péptido IB714 exhibe una conformación extendida debido a una distribución casi uniforme de la hélice tipo II y del enrollamiento al azar (random coil). Las dos porciones de la hélice tipo II son separadas por la glicina 8 que parece desempeñar el papel de una rotula. Por otra parte, la proantocianidina B3 adopta una forma más compacta, como "pinzas", que muestra el máximo de grupos del OH hacia fuera, favoreciendo los enlaces de hidrógeno (Simon y col., 2003). La estructura del complejo IB714-B3 muestra que las moléculas B3 están fijadas siempre en un sitio que se ha identificado como hidrofílico. Esto está de acuerdo con modelos moleculares que muestran la presencia de numerosos enlaces de hidrógeno entre las funciones carbonilo de algunos residuos de prolina y los grupos OH de los cuatro anillos de las proantocianidinas. Estos mismos autores no observaron ninguna unión entre el anillo de pirrolidina de los residuos del prolina y los anillos fenólicos de proantocianidinas, que serían favorecidos por un efecto hidrofóbico (Simon y col., 2003). Las diversas sensaciones de astringencia percibidas frente a diferentes vinos podría deberse no sólo al tipo específico de interacción entre taninos y proteínas, o la estabilidad de los respectivos complejos, sino también a la naturaleza de la proteína (De Freitas y Mateus, 2001). Charlton y col., (2002a) trabajaron con dos tipos de proteínas de similar secuencia y composición pero de tamaño distinto (740 y 2000 Da). Los autores encontraron que la proteína más pequeña tenía una afinidad 50 veces más débil que la segunda. La diferencia más significativa entre estos polipéptidos es su longitud y por consiguiente el número de sitios potenciales de unión, ya que la proteína más pequeña poseía 1 o 2 - 34 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - sitios potenciales de unión y la mayor 7 u 8. Por otra parte, la formación de puentes de polifenoles intra e interproteínas es importante para la fuerza de interacción polifenol-proteína, dado que los polifenoles pueden interactuar simultáneamente en distintos lugares a lo largo del polipéptido. De la misma manera, la naturaleza química del compuesto fenólico (hidrolizable, condensado, galoizado, etc.), como su peso molecular, estructura tridimensional, susceptibilidad a autoasociarse y solubilidad en agua, así como las condiciones del medio, tales como pH y contenido de alcohol, pueden producir diferencias sensibles en la formación de complejos taninos-proteínas. Esto podría explicar diferencias gustativas importantes notadas por los enólogos sobre el comportamiento de los taninos en el vino tinto, tales como las características de sequedad, arrugamiento, amargor, astringencia o aspereza (Lee y Lawless, 1991). Finalmente, el hecho que los sitios de unión del tanino tengan diversas características fisicoquímicas sería de gran relevancia, ya que mientras las proteínas están ligadas, no están disponibles para lubricar la boca (Simon y col., 2003). 8.6. Factores moduladores de la astringencia. Tanto los compuestos fenólicos con pesos moleculares entre 500 y 3000 Da (Bakker, 1998; Lesschaeve y Noble, 2005), como fenoles más pequeños (monómeros, dímeros y trímeros de flavanol) (Naish y col., 1993; Peleg y col., 1999), han sido definidos como astringentes. Se ha observado que mientras los fenoles simples se unen débilmente con proteínas (Haslam y Lilley, 1998), los fenoles con mayor porcentaje de galoilación, grado de polimerización y peso molecular, son mayores agentes precipitantes de proteínas (Bate-Smith, 1973; Sarni-Machado y col., 1999) con su consiguiente aumento en la intensidad de percibir astringencia (Arnold y col., 1980; Peleg y col., 1999). Por otro lado, se ha observado que la astringencia disminuye durante la crianza de vinos en barricas y maduración de las uvas (Llaudy, 2006; Ozawa y col., 1987). Sumado a la concentración y composición fenólica (Vidal y col., 2004), otros componentes como el etanol (Fischer y Noble, 1994; DeMiglio y col., 2002) y pH (Kallithraka y col., 1997; Sowalsky y Noble, 1998; Fischer y Noble, 1994; Lawless y col., 1996) han también mostrado contribuir a la percepción de astringencia. Estos dos factores serán extensamente abordados en el Capítulo II. Los polisacáridos pueden modular la interacción entre proteínas salivales y taninos. Los polisacáridos son coloides protectores, que limitan la agregación, floculación, turbidez y formación de precipitados en el vino. Provienen de las paredes celulares y de la liberación por parte de las levaduras, hongos y bacterias (Llaudy, 2006). Según Luck y col. (1994), los polisacáridos actuarían “encapsulando” a los polifenoles impidiendo su unión con las proteínas, por la asociación con las proteínas y/o por la unión terciaria entre el polisacárido-tanino-proteína, lo que aumentaría la solubilidad del complejo en medio acuoso. Uno de los polisacáridos ampliamente utilizado en la industria enológica es la goma arábiga. Su adición en el vino ha demostrado disminuir la astringencia (Maury y col., 2001; Comuzzo y col., 2002). Otros compuestos moduladores de la astringencia son las manoproteínas, polímeros de manosa, secretadas durante la fase exponencial de crecimiento de las levaduras (Llaubères, 1987) o durante la autólisis celular de las levaduras (Ledoux y col., 1992). Se ha postulado que estos componentes se unen a los taninos, formando estructuras estables imposibilitadas de asociarse a las proteínas (Fuster y col., - 35 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - 2002). Finalmente se ha descrito que factores tales como el flujo salival (Ficher y Noble., 1994; Ishikawa y Noble, 1995; Peleg y col., 1999), composición salival (Guinard y col., 1997; Condelli y col., 2006), contenido de ácidos orgánicos e inorgánicos (Hartwig y McDaniel, 1995), dulzor (Smith y col., 1996), viscosidad (Peleg y Noble, 1999; Nurgel y Pickering, 2005) y algunos minerales (Lawless y col., 2004) intervienen fuertemente en la percepción de astringencia. 9. Métodos para estimación de la astringencia Actualmente existe una gran cantidad de propuestas metodológicas, ensayos y modelos que proponen evaluar objetivamente las interacciones entre taninos y proteínas mediante evaluación de alteraciones fisicoquímicas que experimentan suspensiones proteicas en presencia de taninos. Una gran cantidad de componentes fenólicos han sido utilizados en estos estudios, tales como ácido tánico, diversas proantoacianidinas puras y fracciones fenólicas extraídas de semillas y hollejos. Por otra parte, proteínas como caseína, gelatina, albúmina, poli-L-prolina y fracciones salivales, entre otras, han sido utilizadas en ensayos modelos para evaluar su interacción con compuestos fenólicos. A continuación se señala los principales procedimientos utilizados para evaluar la interacción tanino/proteína: • Interacción y precipitabilidad del complejo tanino/proteína a través de la identificación de proteínas en geles (Hagerman y Butler, 1978) con uso de radioisótopos marcados para disminuir las interferencias de pigmentos (Hagerman y Robbins, 1987). • • Tinción de proteínas unidas a polifenoles (Bradford, 1976) Cuantificación de proteína y polifenoles precipitados (Swain y Hillis, 1959; Mole y Waterman, 1987; Price y col., 1978; Porter y col., 1986; Lowry y col., 1951; Makkar y col., 1987) • • • • • • • • • • • • • Uso de la técnica de diálisis (McManus y col., 1985) Técnicas calorimétricas (McManus y col., 1981) Titulación microcalorimétricas (Frazier y col., 2003) Técnicas basadas en la turbidimetría (De Freitas y Mateus, 2001) Uso de nefelómetros (Monteleone y col., 2006) Cálculo del coeficiente de fricción mediante técnicas mecánicas (Prinz y Lucas, 2000) Utilización de superficie de agarosa-prolina (Edelman y Lendl, 2002) Utilización de microbalanza de cuarzo (Kaneda y col., 2003) Utilización de técnica Cromatográfica en papel (Dawra y col., 1988) Utilización de técnica Cromatográfica Líquida de Alta Resolución (Kallithraka y col., 2000) Uso de ensayo enzimáticos (ELISA) (Ratnavathi y col., 1998) Ensayos de competición de placas con marcaje de taninos (Bacon y Rhodes, 1998) Uso de microplacas (Fickel y col., 1999) - 36 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Introducción - • • • • • • • • • Técnicas electroforéticas (Hagerman y Robbins, 1993) Mediante SDS-PAGE (Wu y Lu, 2004) Técnica “Time Average Nuclear Overhouser Effects” (NOE) (Charlton y col., 2002b) Uso de resonancia magnética nuclear (Simon y col., 2003) Técnicas de dispersion de luz (Lin y col., 2004) Modelos matemáticos (Cliff y col., 2002) Modelos moleculares (Jöbstl y col., 2004) Indice de ovoalbúmina (Llaudy y col., 2004) Indice de gelatina (Glories, 1984) En la mayoría de los métodos señalados no es posible distinguir entre sí los componentes que participan en la interacción taninos-proteínas. A pesar de ello, la evaluación de la interacción tanino/proteína y su asociación con la percepción de astringencia, es una materia cuyo estudio está en pleno desarrollo. Por ello, cada vez se tiende más a utilizar herramientas cuantitativas que permitan la evaluación expedita, objetiva, independiente y confiable de la interacción entre taninos y proteínas. - 37 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO I: Caracterización fenólica de bayas del cultivar Carménère - SUBCAPÍTULO I.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS Tal como se describió anteriormente, los compuestos fenólicos corresponden a uno de los constituyentes de mayor relevancia en la uva para producción de vino debido a su típico aporte en características sensoriales, como la astringencia. Estos compuestos provienen del metabolismo secundario de los vegetales y su síntesis depende de diversos factores. Uno de esos factores corresponde al componente varietal, referido al efecto del cultivar sobre la composición fenólica tanto de hollejos como semillas de bayas de Vitis vinifera. Una de las familias más importantes de la especie Vitis vinifera corresponde a la de los Carmenets, que incluye a los cultivares Merlot, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Carménère, Petit Verdot y Fer Servadou. A pesar de la importancia del cultivar Carménère, cepa emblemática chilena, la información referente a su composición fenólica es limitada. Es por esto, que en este capítulo se han propuesto los siguientes Objetivos Específicos: • Caracterizar la composición fenólica de semillas y hollejos de bayas del cultivar Carménère provenientes del Valle del Maipo, Región Metropolitana, Chile, durante la maduración y compararlas con cultivares de la misma familia. • Estudiar la composición fenólica de semillas y hollejos de bayas del cultivar Carménère provenientes del Valle del Maule, Región del Maule, Chile, durante la maduración y compararlas con bayas del cultivar Cabernet Sauvignon. Los estudios orientados al cumplimiento de los Objetivos Específicos señalados se presentan a continuación en los Subcapítulos I.2.-I.3. y I.4., respectivamente. - 41 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO I: Caracterización fenólica de bayas del cultivar Carménère - SUBCAPÍTULO I.2. CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE SEMILLAS DE BAYAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE DURANTE LA MADURACIÓN - 43 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère INTRODUCCIÓN Las proantocianidinas o flavan-3-oles, junto a otros compuestos fenólicos, contribuyen a importantes propiedades sensoriales tales como color, amargor y astringencia, en diferentes alimentos y bebidas. En el caso del vino, ellos tienen un rol crucial durante la maduración de la uva, crianza del vino y en procesos oxidativos de las bayas, mostos y vinos. De las partes constituyentes de las uvas de Vitis vinifera L., la semilla es la fuente más abundante de flavan-3-oles (Roby y col., 2004; Kennedy y col., 2000a). La síntesis de compuestos fenólicos en la semilla de uvas durante la maduración, depende de varios factores tales como los ambientales, culturales y varietales. Diversos estudios han mostrado el efecto de factores ambientales, como luz y temperatura en la calidad de las bayas de uva vinífera (Kennedy y col., 2000a; Bergqvist y col., 2001; Downey y col., 2003). Asimismo, diferentes autores han demostrado la incidencia de manejos culturales, tales como momento de cosecha, estado de madurez y defoliación en la concentración de los compuestos fenólicos (Bergqvist y col., 2001; Pastor del Rio y Kennedy, 2006; Peña-Neira y col., 2004). En el caso del efecto varietal, una gran cantidad de estudios han mostrado las diferencias existentes en la concentración de compuestos fenólicos en la semilla durante la maduración entre diferentes cultivares (Santos-Buelga y col., 1995; Fuleki y Ricardo da Silva, 1997; Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guerrero y col., 2009; Guendez y col., 2005, Monagas y col., 2003; Sun y col., 1998a). Por otro lado, la mayoría de las variedades de uva para producción de vino son de la especie Vitis vinifera, originadas a partir de Vitis silvestris y que en un proceso de selección, forman un inmenso patrimonio varietal compuesto de más de cinco mil variedades distintas (Hidalgo, 2003). A partir de esto, se han agrupado en grupos o familias definidas como una o varias variedades de una misma especie de vid que tienen uno o varios caracteres comunes (Reynier, 2002). La familia de los Carmenets, comprende a los cultivares Merlot, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Carménère, Petit Verdot y Fer Servador (Reynier, 2002). De todas las variedades mencionadas anteriormente, Cabernet Sauvignon originaria de la región de Burdeos, ha sido la más estudiada por su gran difusión en la mayor parte de los países vitivinícolas (Roby y col., 2004; Peña-Neira y col., 2004; Santos-Buelga y col., 1995; Fuleki y Ricardo da Silva, 1997; Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guerrero y col., 2009; Guendez y col., 2005, Monagas y col., 2003; Kennedy y col., 2000b). En el caso del cultivar Carménère, en Chile existen 7.182,7 hectáreas cultivadas y hasta mediados de los años noventa, fue confundida con Merlot y/o Cabernet Franc, por tener similares características ampelográficas. En la actualidad Carménère existe como viñedos puros y como tal, es motivo de estudios de selección clonal para promover a Carménère como la variedad emblemática de Chile (Fernández y col., 2007). A pesar de la importancia de éste y los otros cultivares de la familia de los Carmenets, la información es limitada y no existen estudios comparativos que abarquen más de 2 cultivares de ésta familia. Debido a lo descrito anteriormente, se ha propuesto evaluar la composición fenólica de semillas bayas de las variedades Carménère, Merlot, Cabernet Franc y Cabernet Sauvignon durante la maduración, cultivadas bajo similares condiciones ambientales y manejos culturales, permitiendo la expresión netamente varietal. - 45 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Estándares de ácido gálico (G-7384), (+)-catequina (C-1251), (-)-epicatequina (E-1753) y (-)-epicatequina-3-O-galato (E-3893), así como floroglucinol (P-3502) y membranas filtrantes de 0.45m fueron adquiridas en Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. Vainillina 99% (V8510), ácido trifluoroacético, acetato de etilo, acetonitrilo y solventes grado HPLC y pro-análisis fueron comprados en Merck, Darmstadt, Germany. Cartuchos Sep-Pak Plus tC18 WAT 036810 y WAT 036800 fueron obtenidos en Waters (Milford, MA, USA). Instrumentación. Para las determinaciones analíticas, se empleó un espectrofotómetro Jasco V-530 UV-vis, un pHmeter Hanna Instruments pH 211 y un Cromatógrafo Líquido de Alta Eficacia (HPLCDAD) marca Agilent technologies 1200 Series. El equipo de HPLC-DAD estaba constituido por un inyector automático modelo L-7200, un detector de arreglo de fotodiodos alineados modelo L-7455, y una columna Nova-Pak C18 (4 m * 3.9 mm DI * 300 mm, Waters, Ireland) para los análisis de compuestos fenólicos de bajo peso molecular. En los estudios de floroglucinol por HPLC-DAD se empleó una columna LiChro Cart 100 RP-18 (5 m, 4 mm ID x 250 mm) adquirida en Agilent Technologies, Santa Clara, CA., USA. Muestras de semillas. Se seleccionaron veinte plantas de siete años de edad de Vitis vinifera L. de cada uno de los cultivares en estudio (Carménère, Merlot, Cabernet Franc y Cabernet Sauvignon). Las plantas se encontraban ubicadas en la comuna de Buin, Región Metropolitana, Chile, y estaban conducidas en espaldera simple, con un marco de plantación de 2,0 metro entre hilera y 1,5 metro sobre hilera y orientación este-oeste. Las plantas fueron sometidas a regimenes hídricos y culturales igualitarios. Los muestreos se efectuaron mensualmente en cuatro fechas, correspondientes a distintos estados fenológicos de la planta entre los meses de febrero y mayo del año 2008. De cada planta se seleccionaron cuatro racimos de los cuales se obtuvieron dos bayas completamente al azar, haciendo un total de ciento sesenta bayas por variedad, de las cuales cien bayas fueron escogidas para su posterior análisis. Todos los tratamientos fueron analizados por triplicado. Parámetros analíticos generales. Cada grupo de bayas fue sometido a análisis de sólidos solubles, pH y acidez total de acuerdo a metodologías internacionales (Organisation Internationale de la Vigne et Vin, 2005). Para ello las bayas fueron estrujadas y el mosto obtenido fue conservado a 4 ºC para posterior análisis. En el caso de la acidez titulable, se colocaron 50 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer y 1 mL de fenoftaleína al 1%. Posteriormente se adicionaron dos gotas de NaOH 0,1 N hasta que se desarrolló un color rosado pálido. Sobre esta agua neutra se colocaron 5 mL de muestra a analizar. Se tituló con NaOH 0,1 N hasta la aparición de una coloración levemente rosada. El gasto de NaOH 0,1 N en mL se multiplicó por 200*0.0049, resultando el valor de acidez de titulación en g/L expresada en acidez sulfúrica (200 es el factor para llevar a litros y 0.0049 proviene de la - 46 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère multiplicación entre la normalidad del NaOH con el peso equivalente del ácido sulfúrico, dividido por 1000). Preparación de extracto de semillas. Las semillas fueron separadas manualmente de cada baya, pesadas y trituradas en un mortero. Una alícuota de 40 mL de una solución hidroalcohólica (10:90 v/v etanol/agua) que contenía 5 g/L de ácido tartárico fue agregada a las semillas molidas, y ajustada a 200 g con agua destilada. Luego de una maceración con agitación constante durante 2 horas a 20 ºC, el extracto fue filtrado a través de una membrana de 0.45 m de tamaño de poro (Venicie y col., 1997). Caracterización espectrofotométrica. En el caso del contenido de fenoles totales, las muestras filtradas fueron diluidas en razón de 1/50 con agua destilada para luego ser colocadas en cubetas de cuarzo de 10 mm de espesor y posteriormente leídas a una longitud de onda de 280 nm (RibéreauGayon, 1970). El valor obtenido fue multiplicado por el factor de dilución y una constante resultante de la curva de calibración realizada con ácido gálico en concentraciones de 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mg/L. Los taninos totales fueron medidos mediante el método propuesto por Ribéreau-Gayon y Stonestreet (1966). Los extractos de semillas fueron diluidos 1/20 con agua destilada. En dos tubos de ensayo se colocaron 4 mL de muestra, 2 mL de agua destilada y 6 mL de HCl 12 N. Ambos tubos fueron protegidos de la luz y cerrados herméticamente. Uno de los tubos fue colocado a baño María y el segundo a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de ebullición del primer tubo, ambos se enfriaron a 4ºC y se les agregó 1 mL de etanol. Luego de una breve agitación, ambos tubos fueron leídos a 550 nm en cubetas de 10 mm de paso óptico. La diferencia de ambas lecturas se multiplicó por 7,73, correspondiente al coeficiente de extinción molar de la cianidina, obtenida por hidrólisis ácida de los taninos condensados y la dilución utilizada (1/20). Finalmente los parámetros de CIElab fueron obtenidos de la medición a longitudes de onda de 450, 520, 570 y 630 nm en cubetas de cuarzo de 1 mm de paso óptico de acuerdo a la metodología propuesta por Ayala y col. (1997). Las coordenadas de claridad (L*), croma (C*), tono (H*), a* y b* fueron calculadas utilizando el programa MSCV (Universidad de la Rioja) (Ayala y col., 2001). Tamaño medio de polimerización de taninos. Esta metodología se realizó de acuerdo a la propuesta de Kennedy y Jones (2001). Una alícuota de 3 mL del extracto de semilla fue concentrada, secada bajo presión y redisuelta en 0,5 mL metanol. A esta, se le agregó 0,5 mL de una solución de floroglucinol (0,25 g de ácido ascórbico, 1,25 g de floroglucinol, 215 µL de ácido clorhídrico concentrado y completada a 25 mL con metanol), dejándola reaccionar a 50 ºC por 20 minutos. Luego de este tiempo, fue añadido 0,5 ml de una solución acuosa de acetato de sodio 200 mM con el fin de detener la reacción. La muestra obtenida fue analizada por HPLC-DAD. Se utilizó una gradiente binaria cuya fase móvil contenía ácido acético en agua (1% v/v) (fase móvil A) y metanol (fase móvil B). Los picos obtenidos de las muestras fueron monitoreados a 280 nm. Las condiciones de elusión fueron: flujo de 1,0 mL/minuto; 100% A por 15 min, gradiente lineal desde 95 a 80% A en 20 minutos, - 47 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère gradiente lineal desde 80 a 60% A en 26 minutos y 10% A por 10 min. La columna fue finalmente equilibrada con 10% A por otros 6 minutos antes de la inyección de la muestra siguiente. El grado medio de polimerización (mDP) fue obtenido por la división entre la totalidad de las subunidades identificadas (proantocinidinas terminales y extensión) y las proantocianidinas terminales. En el caso del porcentaje de galoilación (% G) se obtuvo por división entre la totalidad de proantocianidinas galoiladas y la totalidad de las proantocianidinas identificadas, multiplicado por 100. Finalmente, el peso molecular promedio (aMW) se obtuvo del resultado de la ecuación mDP * [288 + (152 * %G / 100)] + 2. Fraccionamiento de flavan-3-oles por cartuchos C18 Sep-Pak. Los extractos de semillas y fueron fraccionados siguiendo el método descrito por Sun y col. (1998b). Cinco mililitros (mL) de extracto de semillas fueron concentrados y secados utilizando evaporación rotatoria a una temperatura de 30 ºC. El residuo fue disuelto en 20 mL de tampón fosfato pH 7,0 (67 mM). Cuando fue necesario el pH fue ajustado a 7,0 con una solución de NaOH o HCl. Dos cartuchos C18 conectados en serie fueron acondicionados con metanol (10 mL), agua destilada (20 mL) y tampón fosfato pH 7,0 (10 mL). Las muestras fueron conducidas por los cartuchos a un flujo no mayor de 2 mL/min. Los ácidos fenólicos fueron primeramente arrastrados con 10 mL de tampón fosfato pH 7,0. Luego los cartuchos fueron secados durante 2 horas con nitrógeno gaseoso. La separación de monómeros y oligómeros de flavan-3oles (fracciones FI+FII) fue obtenida mediante la adición de 25 mL de acetato de etilo, seguido por el arrastre de polímeros proantocianidinicos (fracción FIII) con 15 mL de metanol. La fracción con acetato de etilo fue evaporada bajo presión, redisuelta en 3 mL de tampón fosfato pH 7,0, y finalmente redepositada en la serie de catuchos preacondicionados como se describió anteriormente. Los cartuchos fueron secados con nitrógeno durante 1 hora y los monómeros (FI) fueron separados de los oligómeros (FII) por un arrastre secuencial con 25 mL éter dietílico y 15 mL de metanol. Las tres fracciones fueron secadas bajo presión y redisueltos en 5 mL de metanol. El contenido total de flavan3-oles de cada fracción fue determinado mediante el ensayo con vainillina. Contenido de flavan-3-oles mediante el ensayo con vainillina. Esta metodología se realizó de acuerdo a la utilizada por Sun y col. (1998c). Una alícuota de 2,5 mL de una solución ácido sulfúrico/metanol (25/75) junto con 1 mL de la muestra fueron colocados en dos tubos de ensayo. A uno de ellos se le agregó 2,5 mL de vainillina 1 % en metanol (p/v) y al otro 2,5 mL de metanol (control). Ambos tubos fueron incubados por 15 minutos a 30 ºC (fracción F1) y por un periodo mayor, suficiente para alcanzar el máximo de reacción (fracciones FII y FIII). Las absorbancias fueron leídas a 500 nm. Los g/L de las diferentes fracciones se obtuvieron por la diferencia de las densidades ópticas del tubo con vainillina y metanol multiplicado por la dilución (5), dividido por mililitros utilizados inicialmente (5) y por un factor proveniente de la curva patrón. Los factores de la curva patrón utilizados fueron 0,0081, 0,0046 y 0,0037 para las fracciones F1, F2 y F3, respectivamente. - 48 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Análisis de fenoles de bajo peso molecular mediante HPLC-DAD. Para la caracterización y cuantificación de los compuestos fenólicos de los extractos de semillas por HPLC-DAD se realizó una purificación y concentración a través de una extracción líquido-líquido según trabajos realizados previamente por diversos autores (Peña-Neira y col., 2004; Peña-Neira y col., 2007; Obreque-Slier y col., 2009; Matus y col., 2008). A 50 mL de la muestra del extracto de semilla se le realizaron 3 extracciones líquido-líquido con 20 mL de éter dietílico y 3 extracciones con 20 mL acetato de etilo. El residuo acuoso se descartó y se mezclaron los 6 extractos orgánicos con 10 g de sulfato de sodio anhidro y después de 30 minutos la muestra se filtró y se llevó a sequedad en un rotavapor a 30 ºC. Una vez seca, la muestra fue redisuelta en 2 mL de una solución de metanol/agua (50/50, v/v) y filtrada (0,45 m). La solución resultante fue sometida finalmente a un análisis por cromatografía líquida inyectándose para cada muestra 20 µL. Dos fases móviles fueron utilizadas: A, agua/ácido acético (98/2, v/v) y B, agua/acetonitrilo/ácido acético (78:20:2, v/v/v) de acuerdo a la siguiente gradiente: 055 minutos, 100-20 %A y 55-70 minutos, 20-10 %A. El tiempo de equilibrio antes de la siguiente inyección fue de 15 minutos en las condiciones iniciales. La identificación de los compuestos se realizó de acuerdo al tiempo de retención de los picos del cromatograma y espectro de absorción, en comparación con las sustancias patrón inyectadas en las mismas condiciones cromatográficas. En el caso de los galatos de proantocianidina y proantocianidinas para los cuales no se disponían de patrones, la identificación se hizo por comparación de sus espectros de absorción y tiempo de retención reportado por diversos autores (Peña-Neira y col., 2004; Peña-Neira y col., 2007; Obreque-Slier y col., 2009; Matus y col., 2008), cuantificando los primeros con la recta de calibrado del ácido gálico y en el caso de las proantocianidinas con la recta de la (+)-catequina. La evaluación cuantitativa de las muestras se efectuó inyectando distintas cantidades de una solución patrón, en las mismas condiciones cromatográficas en las que se inyectan las muestras, midiéndose el área bajo los picos correspondientes. Las rectas de regresión obtenidas corresponden a una ecuación y = ax + b, donde y es la concentración de la sustancia patrón y x el área de su pico cromatográfico. - 49 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis básicos. Las bayas de Carménère (CA), Merlot (M), Cabernet Franc (CF) y Cabernet Sauvignon (CS) fueron caracterizadas durante la maduración mediante análisis físicos y químicos, los cuales son presentados en la Tabla 1. El contenido de sólidos totales (ºBrix), muestra un aumento drástico entre el primer y segundo muestreo, para estabilizarse entre el tercer y cuarto muestreo en todos los cultivares. Esta tendencia de acumulación ha sido observada por otros autores (Roby y col., 2004; Kennedy y col., 2000a). Nótese que en el segundo muestreo (45 días después de envero), los cuatro cultivares alcanzan la madurez tecnológica, presentando un contenido de sólidos totales cercano a 24 ºBrix (Kennedy y col., 2000a). A pesar que las bayas de M presentaron los mayores valores de sólidos totales en los dos primeros muestreo y CF en los dos últimos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en ningún muestreo ni entre cultivares. En cuanto al pH, se observó un aumento gradual entre las dos fechas extremas del estudio para los cuatro cultivares. Contrariamente, la disminución de la acidez titulable en bayas de CA y M no fue significativa durante la maduración, mientras que en bayas de CF y CS la disminución paulatina fue estadísticamente significativa. Las bayas del cultivar CA presentaron los mayores valores de pH en los tres primeros muestreos y los menores valores de acidez titulable durante todo el ensayo. Esta condición obligaría a una adición de algún ácido orgánico para mantener niveles de pH y acidez total aptos para una vinificación normal (Zoecklein y col., 2001), más aún en el cultivar CA, conocido por su tardía maduración (Reynier, 2002; Fernández y col., 2007; Granett, 2004). Finalmente, en el caso de los cultivares CA, CF y CS se observó que el peso de semillas/100 bayas permaneció constante durante el estudio. Comparativamente, el cultivar CA presentó los valores más bajos de peso de semillas/100 bayas mientras que CF los valores más altos, observación que fue respaldada estadísticamente durante todo el ensayo. Análisis fenólicos globales. La Tabla 2 muestra la composición fenólica global de semillas de CA, M, CF y CS. Es posible observar que el contenido de fenoles totales disminuyó gradualmente en todos los cultivares entre el primer y cuarto muestreo con concentraciones variantes entre 10,2 y 28,5 mg/g EAG, siendo las semillas de CA las que presentaron los mayores valores en tres de los cuatro muestreos mientras que CS los menores valores durante todo el estudio. Este comportamiento de declinación después del envero, como es sugerido por Kennedy y col. (2000b), podría ser explicado por proceso oxidativos. Por otro lado, mientras las semillas de las bayas de CA y M presentaron concentraciones estables de taninos totales durante el ensayo, en el caso de las semillas de bayas de CF y CS se observaron aumentos progresivos. Los valores variaron entre 4,9 y 16,4 mg/g EC, siendo nuevamente el cultivar CA el presentó las mayores concentraciones y CF las menores durante todo el ensayo, diferencias que fueron estadísticamente significativas. Finalmente, los valores de fenoles y taninos observados en este estudio coinciden con lo reportado por otros autores (Roby y col., 2004; Kennedy y col., 2000a; Downey y col., 2003; Kennedy y col., 2000b). - 50 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Identificación de parámetros CIElab. El sistema CIELab permite determinar las características cromáticas a través de coordenadas colorimétricas o de cromaticidad (Pérez-Magariño y González-San José, 2003). En la Tabla 3 se presentan los parámetros CIElab de luminosidad (L*), cromacidad (C*), tonalidad (H*), a* y b* que fueron cuantificados en los extractos de semilla de los cuatro cultivares durante la maduración. La coordenada L*, varía del blanco perfecto con un valor de 100, al negro con un valor de 0 (Gil-Muñoz y col., 1997). En este caso, se pudo observar que todos los cultivares presentaron su valor más alto a partir del segundo muestreo, disminuyendo sutilmente hacia el último muestreo en el caso de las semillas de bayas de CF. Las semillas de CA presentaron los valores más altos a partir del segundo muestreo, diferencias que fueron estadísticamente significativas sólo en el último muestreo con las semillas de CF y CS. Por su parte, la cromacidad (C*), indica el aporte de a* (color rojo) y b* (color amarillo) al total del color (Gil-Muñoz y col., 1997). En este estudio, la cromacidad presentó los valores más altos en el primer muestreo en todos los cultivares, disminuyendo abruptamente a partir del segundo muestreo. Las semillas de CF presentaron los mayores valores de croma en el segundo y tercer muestreo, diferencias que fueron avaladas estadísticamente. El parámetro H varía entre el violeta (H=315º) y el rosado (H=0º) (Pérez-Magariño y González-San José, 2003). En el caso de las semillas de CA y CS se observaron valores constantes de H durante la maduración, mientras que las semillas de las bayas de CF y CS presentaron un aumento del tono durante el segundo y tercer muestreo. En todas las fechas de muestreo, las semillas de CS, presentaron los menores valores de tonalidad. Para el caso de a*, que varía entre el color rojo (+) y verde (-) (Pérez-Magariño y González-San José, 2003), las semillas de bayas de CA y CS presentaron valores estables durante el estudio, mientras que las semillas de bayas de M y CF presentaron mayores valores hacia el último muestreo. En los últimos tres muestreos las semillas de CS presentaron los valores mayores de a*. En el caso del tonalidad y a* las diferencias observadas fueron avaladas estadísticamente sólo en el último muestreo entre CS con CA y M (en el caso del tonalidad) y con CA (para el caso de a*). Por último, el parámetro b*, que fluctúa entre el color amarillo (+) al azul (-) (Pérez-Magariño y González-San José, 2003), presentó una disminución paulatina entre el primer y cuarto muestreo para todos los cultivares. Mientras, CF presentó los mayores valores en el segundo y tercer muestreo, CS presentó los menores en los últimos tres muestreos. Estas observaciones tomadas en conjunto, muestran que en la fecha cercana a envero, todos los cultivares presentaron igualados sus valores de L*, C*, H*, a* y b*, no observándose diferencia significativa en ninguno de ellos (salvo en b* entre CF y CS). No obstante, a medida que avanzaba la madurez, las semillas de CA presentaron los mayores valores de L*, mientras que los hollejos de CS los mayores de a* y menores valores de H* y b*. Los valores observados en este estudio concuerdan con lo descrito por diversos autores (Pérez-Magariño y González-San José, 2003; Gil-Muñoz y col., 1997). Cuantificación de compuestos fenólicos de bajo peso molecular en semillas durante la maduración mediante análisis de HPLC-DAD. La Tabla 4 muestra un grupo de 15 compuestos flavonoides y no flavonoides identificados y cuantificados por HPLC-DAD en semillas de bayas de los - 51 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère cuatro cultivares durante la maduración. Entre ellos, fueron identificados tres monómeros [(+)catequina (C), (-)-epicatequina (EC) y (-)-epicatequina-3-O-galato (ECG)], cinco proantocianidinas diméricas [catequina-(4α→8)-epicatequina (B4), epicatequina-(4β→8)-epicatequina (B2), catequina(4α→8)-catequina (B3), epicatequina-(4β→8)-catequina (B1) y epicatequina-(4β→6)-epicatequina (B5)], tres dímeros esterificados con acido gálico [catequina-(4α→8)-epicatequina-3-O-galato (B4G), epicatequina-3-O-galato-(4β→8)-catequina (BlG) y epicatequina-(4β→8)-epicatequina-3-O-galato (B2G)], una proantocianidina trímera [epicatequina-(4β→8)-epicatequina-(4β→8)-catequina (C1)], diversas proantocianidinas (Ps) y galato de proantocianidinas (GPs), y sólo un compuesto no flavonoide (ácido gálico). La totalidad de los compuestos fenólicos encontrados en este estudio han sido identificados por diversos autores en diferentes cultivares y zonas de cultivo (Peña-Neira y col., 2004; Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guerrero y col., 2009; Kennedy y Jones, 2001). En general y de acuerdo al análisis estadístico realizado en los diferentes cultivares durante al maduración, la concentración de cada uno de los compuestos identificados en semillas experimentaron tendencias en continua disminución, comportamiento observado previamente por otros autores (Kennedy y col., 2000a; Rodríguez-Montealgre y col., 2006; Kennedy y Jones, 2001). Esta tendencia podría haber sido provocada por la oxidación que sufren estos compuestos bajo condiciones acuosas y por la fuerte relación entre el cultivar y la evolución química de estos compuestos durante la maduración (Kennedy y Jones, 2001). De acuerdo al análisis de HPLC-DAD y en concordancia con diversos autores (Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guendez y col., 2005), el monómero de C fue el más abundante, seguido del monómero de EC. En ambos casos, el cultivar M presentó las mayores concentraciones, mientras que CS los menores en comparación a los otros cultivares y en todas las fechas de muestreo. Estas diferencias fueron respaldadas estadísticamente. En los otros compuestos identificados, se pudo observar que las semillas de CA presentaron los mayores valores de proantocianidina B1 y B5 durante todo el ensayo, los mayores valores de B4G en tres fechas de muestreo y de B2, B1G y B2G en dos muestreos. Por su parte, las semillas de M presentaron, aparte de mayores concentraciones de monómeros de C y EC, mayores concentraciones de B3, T, B4 en todos los muestreos y de ECG en los últimas tres fechas. Asimismo el cultivar CF presentó los mayores valores de AG en todos los muestreos y de GPs en los últimas tres fechas. Para el caso de las otras proantocianidinas identificadas (Ps) los mayores valores fueron alcanzados alternadamente por CA y CF. Es interesante notar que las semillas del cultivar CS obtuvo en la mayoría de los compuestos identificados las menores concentraciones durante todo el estudio, observación descrita por Rodríguez-Montealegre y col. (2006) y Guendez y col. (2005), al comparar la composición polifenólica de semillas de los cultivares CS y M. Proantocianidinas en semillas separadas de acuerdo a su grado de polimerización. La Figura 1 muestra las fracciones mono, oligo y poliméricas de flavan-3-oles aisladas en cartuchos C18 Sep-Pak y cuantificadas mediante la reacción con vainillina. Esta metodología fue aplicada sólo en tres fechas de muestreos (20 de febrero, marzo y abril). Tal como muestra la Figura 1, la fracción - 52 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère monomérica fue la menos abundante en semillas de bayas de CA, M, CF y CS en comparación con las fracciones oligo y poliméricas, coincidente con lo observado por otros autores (Monagas y col., 2003; Jordão y col., 2001). Esta última fracción fue la más abundante en la mayoría de las fechas de muestreo salvo en la primera, donde la fracción oligomérica obtuvo el mayor valor para las semillas del cultivar M. En cuanto a la fracción monomérica, las semillas de CS, M y CF presentaron una tendencia decreciente en sus valores entre el primer y tercer muestreo. Por su parte, CA presentó valores prácticamente constantes durante el ensayo. Las semillas de CF presentaron las concentraciones mayores de monómeros en la primera fecha de muestreo. En el caso de la fracción oligomérica, en todos los cultivares se observaron concentraciones menores de oligómeros entre el primer y tercer muestreo, diferencias que fueron estadísticamente significativa sólo en el caso de M y CF. Asimismo, a pesar que las semillas de CS presentaron los mayores valores de fracción oligomérica en los últimos dos muestreos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en ningún muestreo. Finalmente, la fracción polimérica mostró sus mayores valores en el segundo muestreo para todos los cultivares. No obstante, los valores alcanzados en el último muestreo fueron mayores que los observados en el primer muestreo en tres cultivares (salvo en semillas de CA). De la misma manera, las semillas de CF presentaron los mayores valores de polímeros en el primer muestreo, mientras que las semillas de CS en el último muestreo. Las observaciones anteriores descritas fueron avaladas estadísticamente. Es interesante notar, que las concentraciones observadas en este estudio están por bajo de lo encontrado por otros autores (Sun y col., 1998a), debido probablemente a que el método de extracción de proantocianidinas, utilizado ampliamente en la identificación de fenoles de bajo peso molecular por HPLC-DAD en este y diversos estudios (Peña-Neira y col., 2004; Venicie y col., 1997; Peña-Neira y col., 2007; Obreque-Slier y col., 2009), considera un medio de extracción con una solución hidroalcohólica con 2% de etanol, lo que produce una extracción menor de estos compuestos que poseen una alta afinidad con este solvente. A pesar de lo anterior, Monagas y col. (2003), reportó concentraciones similares a las encontradas en este estudio. Floroglucinólisis. Tal como muestra la Figura 2 fueron determinados el grado medio de polimerización (mDP), porcentaje de galoilación (% G) y el peso medio molecular (aMW) de las fracciones flavánicas de las semillas en estudio, mediante una catálisis ácida en presencia del nucleófilo floroglucinol. Concerniente a valores de mDP, la literatura muestra valores entre 2,3 y 15,1, dependiendo de la técnica de fraccionamiento empleada y del cultivar en estudio (Downey y col., 2003; Monagas y col., 2003; Kennedy y col., 2000b; Moreno y col., 2008; Prieur y col., 1994). En este estudio, se pudo observar que las semillas de todos los cultivares presentaron una tendencia en los valores de mDP creciente entre los meses de febrero y abril con valores entre 1,5 y 3,8. Asimismo, fue posible observar que las semillas de CS presentaron los mayores valores del mDP en todos los muestreos en comparación con los otros cultivares, diferencias que fueron estadísticamente - 53 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère significativas. Por otra parte, el % G mostró una disminución paulatina durante el estudio en las semillas de M, mientras que las semillas de CA, CF y CS presentaron valores constantes durante la maduración. A pesar que las semillas de M presentaron los valores más altos del % G durante las dos primeras fechas de muestreo y las semillas de CS los valores más bajos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en ningún muestreo. En el caso del aMW, los cuatro cultivares presentaron valores mayores en último muestreo comparado con la primera fecha, siendo el cultivar CS el que presentó el mayores valores en todos los muestreos comparado con los otros cultivares, diferencias respaldadas estadísticamente sólo en el último muestreo. Los valores de % G y aMW descritos anteriormente coinciden con lo observado por otros autores en trabajos previos (Monagas y col., 2003; Sun y col., 1998b). De acuerdo a las observaciones anteriormente descritas, diferencias composicionales fueron observadas en algunos muestreos en el contenido de fenoles totales y luminosidad (entre CA y CS), cromacidad (entre CA y CF), tonalidad (entre M y CS) y contenido de fracción monomérica (entre CF y CS). Sin embargo, diferencias significativas durante todo el ensayo fueron observadas entre CA y CF en parámetros como peso de semillas, taninos totales y contenido de fracción polimérica. En el caso de identificación de fenoles de bajo peso molecular en semillas por HPLC-DAD, se pudo observar que la concentración de la mayoría de los compuestos identificados disminuyó progresivamente en el tiempo. Asimismo, mientras las semillas del cultivar M se caracterizaron por sus altas concentraciones de monómeros ((+)-catequina, (-)-epicatequina y epicatequina-3-O-galato) y algunas proantocianidinas (Trímero 1 y proantocianidinas B3 y B4), y las semillas de las bayas de CA por sus mayores concentraciones en el resto de las proantocianidinas diméricas, las semillas del cultivar CF se caracterizaron por sus altas concentraciones de ácido gálico y galatos de proantocianidinas. - 54 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Tabla 1. Parámetros generales analizados en semillas de bayas de Carménère (CA), Merlot (M), Cabernet Franc (CF) y Cabernet Sauvignon (CS). Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letra minúscula diferente en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letra mayúscula diferente en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo de cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 55 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Tabla 2. Compuestos fenólicos analizados mediante espectrofotometría. Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letra minúscula diferente en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letra mayúscula diferente en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo de cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). EAG, equivalentes de ácido gálico; EC, equivalentes de (+)-catequina. - 56 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Tabla 3. Valores del espacio CIElab. Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letra minúscula diferente en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letra mayúscula diferente en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo de cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 57 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Tabla 4. Compuestos fenólicos de bajo peso molecular (mg/K de semilla). - 58 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letra minúscula diferente en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letra mayúscula diferente en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo de cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 59 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Figura 1. Concentración de fracciones de flava-3-oles monoméricos, oligoméricos y poliméricos presentes en semillas de bayas de los cultivares en estudio. Letras minúsculas representan diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en las distintas fechas de muestreo (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferente representan diferencias estadísticamente significativas entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 60 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.2.: Caracterización fenólica de semillas de Carménère Figura 2. Valores de mDP, % galoilación y aMW en semillas de bayas de los cultivares en estudio. Letras minúsculas representan diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en las distintas fechas de muestreo (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferente representan diferencias estadísticamente significativas entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 61 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO I: Caracterización fenólica de bayas del cultivar Carménère - SUBCAPÍTULO I.3. CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE HOLLEJOS DE BAYAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE DURANTE LA MADURACIÓN - 63 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère INTRODUCCIÓN Los compuestos fenólicos están ampliamente distribuidos en el reino vegetal incluyendo los frutos de Vitis vinifera L. Suelen clasificarse generalmente en dos grandes subgrupos: los no flavonoides y flavonoides. Los compuestos no flavonoides abarcan los ácidos fenólicos, ácidos cinámicos y estilbenos, mientras que el grupo de los flavonoides está principalmente representado en la uva por los flavonoles, antocianos y flavan-3-oles o proantocianidinas (Peña-Neira y col., 2007; Peña-Neira y col., 2004; Matus y col., 2008). Estos compuestos están presentes en los hollejos, semillas y raspón de las bayas y son extraídos durante la vinificación contribuyendo a atributos sensoriales de alta importancia como son el color, aromas, astringencia y amargor (Méndez y col., 2004; Mangine y col., 2005; PérezMagariño y González-San José, 2003; Gil-Muñoz y col., 1997; Boss y col., 1996; Burns y col., 2002; Guerrero y col., 2009; Timberlake y Bridle, 1976; Lea y Arnold, 1978; Haslam, 1980). Los hollejos de las uvas, a diferencia de las semillas y raspón, contienen una gran variedad de componentes fenólicos que incluye a todos los mencionados anteriormente (Souquet y col., 1996; Prieur y col., 1994; Souquet y col., 2000; Ricardo da Silva y col., 1991). La composición y concentración de estos compuestos depende, entre otros factores, del clima (Berqvist y col., 2001), estado de madurez (Downey y col., 2003; Pastor del Rio y Kennedy, 2006), manejos culturales (Intrieri y col., 2008) y variedad (Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guerrero y col., 2009; Guendez y col., 2005; Monagas y col., 2003; Sun y col., 1998a). La mayoría de las variedades de uva para producción de vino utilizadas en la actualidad corresponden a la especie Vitis vinifera, compuesta por más de cinco mil variedades (Hidalgo, 2003), las que se han agrupado en grupos o familias. Una de las familias más importantes es la familia de los Carmenets, constituida por las variedades Merlot, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Carménère, Petit Verdot y Fer Servadou (Reynier, 2002). El cultivar Carménère (Vitis vinifera L.), es una variedad ampliamente cultivada en Chile, desde su introducción desde Burdeos, Francia, en la mitad del siglo diez y nueve, antes de las devastación de los viñedos europeos provocado por filoxera. Esta variedad de maduración tardía, está hoy en día, muy bien adaptada al ecosistema Chileno (diversidad de suelos y clima seco durante maduración), donde existen más de 7000 hectáreas plantadas. A pesar que diversos autores han estudiado el efecto varietal en la composición fenólica de los hollejos, demostrando una influencia directa de dicho factor (Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Guerrero y col., 2009; Guendez y col., 2005; Monagas y col., 2003; Sun y col., 1998a), los estudios realizados en el cultivar Carménère son mas bien escasos y más aún existe poca información comparativa de entre las variedades de la familia de los Carmenets, que incluya a más de dos integrantes del grupo. Es por esto que se propuesto estudiar la composición polifenólica de los hollejos de cuatro cultivares de la familia de los Carmenets, como son Carménère, Merlot, Cabernet Franc y Cabernet Sauvignon mediante técnicas analíticas que permitan tanto cuantificar como cualificar la fracción polifenólica, para así lograr compararlas durante la madurez. - 65 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Estándares de ácido gálico (G-7384), (+)-catequina (C-1251), (-)-epicatequina (E-1753), ()-epicatequina-3-O-galato (E-3893), ácido vanillínico (V-2250), ácido siríngico (S-6881), quercetina (Q-0125) y miricetina (M-6760), así como floroglucinol (P-3502) y membranas filtrantes de 0.45- m fueron adquiridas en Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. Vainillina 99% (V-8510), ácido trifluoroacético, acetato de etilo, acetonitrilo y solventes grado HPLC y pro-análisis fueron comprados en Merck, Darmstadt, Germany. Cartuchos Sep-Pak Plus tC18 WAT 036810 y WAT 036800 fueron obtenidos en Waters (Milford, MA, USA). Toyopearl TSK HW 40-F size exclusion resin (Nº 807448) fue adquirida en Toso Haas, Stuttgart, Alemania. Instrumentación. Para las determinaciones analíticas, se empleó un espectrofotómetro Jasco V-530 UV-vis, un pHmeter Hanna Instruments pH 211 y un Cromatógrafo Líquido de Alta Eficacia (HPLCDAD) marca Agilent technologies 1200 Series. El equipo de HPLC-DAD estaba constituido por un inyector automático modelo L-7200, un detector de arreglo de fotodiodos alineados modelo L-7455, y una columna Nova-Pak C18 (4 m * 3,9 mm DI * 300 mm, Waters, Irlanda) para los análisis de compuestos fenólicos de bajo peso molecular. En los estudios de floroglucinol e identificación de los antocianos por HPLC-DAD se empleó una columna LiChro Cart 100 RP-18 (5 m, 4 mm ID x 250 mm) adquirida en Agilent Technologies, Santa Clara, CA., USA. Muestras de hollejos. Se seleccionaron veinte plantas de siete años de edad de Vitis vinifera L. para cada uno de los cultivares en estudio (Carménère, Merlot, Cabernet Franc y Cabernet Sauvignon). Las plantas se encontraban ubicadas en la comuna de Buin, Región Metropolitana, Chile, y estaban conducidas en espaldera simple, con un marco de plantación de 2,0 m entre hilera y 1,5 m sobre hilera y orientación este-oeste. Las plantas fueron sometidas a regimenes hídricos y culturales similares. Los muestreos se efectuaron mensualmente en cuatro fechas, correspondientes a distintos estados fenológicos de la baya entre los meses de febrero y mayo del año 2008. De cada planta se seleccionaron cuatro racimos de los cuales se obtuvieron dos bayas completamente al azar, haciendo un total de ciento sesenta bayas por variedad, de las cuales cien bayas fueron escogidas para su posterior análisis. Todos los tratamientos fueron analizados por triplicado. Preparación de extracto de hollejos. Se uso la metodología utilizada por diversos autores (PeñaNeira y col., 2007; Peña-Neira y col., 2004; Matus y col., 2008). Los hollejos fueron separados manualmente de cada baya y pesados. Una alícuota de 40 mL de una solución hidroalcohólica (10/90, v/v, etanol/agua) que contenía 5 g/L de ácido tartárico fue agregada a los hollejos molidos, y ajustada a 200 g con agua destilada. Luego de una maceración con agitación constante durante 2 horas a 20 ºC, el extracto fue filtrado a través de una membrana de 0,45 m de tamaño de poro. - 66 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Caracterización espectrofotométrica. En el caso del contenido de fenoles totales, las muestras filtradas fueron diluidas en razón de 1/100 con agua destilada para luego ser colocadas en cubetas de cuarzo de 10 mm de espesor, y posteriormente medida la absorbancia a 280 nm (Ribéreau-Gayon, 1970). El valor obtenido fue multiplicado por el factor de dilución y una constante resultante de la curva de calibración realizada con ácido gálico en concentraciones de 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mg/L. Los taninos totales fueron medidos mediante el método propuesto por Ribéreau-Gayon y Stonestreet (1966). Los extractos de hollejos fueron diluidos 1/50 con agua destilada. En dos tubos de ensayo se colocaron 4 mL de muestra, 2 mL de agua destilada y 6 mL de HCl 12 N. Ambos tubos fueron protegidos de la luz y cerrados herméticamente. Uno de los tubos fue colocado a baño María y el segundo a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de ebullición del primer tubo, ambos tubos se enfriaron a 4 ºC y se les agregó 1 mL de etanol. Luego de una breve agitación, se midió la absorbancia en ambos tubos a 550 nm. en cubetas de 10 mm de paso óptico. La diferencia de ambas lecturas se multiplicó por 19,33, correspondiente al coeficiente de extinción molar de la cianidina, obtenida por hidrólisis ácida de los taninos condensados. En el caso de los antocianos totales se utilizó la metodología descrita por Ribéreau-Gayon y Stonestreet (1965), para ello fueron mezclados 1 mL de etanol, 20 mL de HCl 2 % y 1 mL de muestra de extracto de hollejo. En dos tubos de ensayo se agregaron 10 mL de la solución anterior. A un tubo se le agregó 4 mL de una solución de metabisulfito sódico 15 % y al otro tubo 4 mL de agua destilada. Ambos tubos fueron agitados y luego de 20 minutos se midió la absorbancia a longitud de onda de 520 nm usando una cubeta de camino óptico de 10 mm. La concentración en mg/L de los antocianos totales se calculó mediante la diferencia de la absorbancia de ambos tubos, multiplicado por 875, correspondiente al coeficiente de extinción molar de la malvidina-3-glucósido. Finalmente los parámetros de CIElab fueron obtenidos de la medición a longitudes de onda de 450, 520, 570 y 630 nm en cubetas de cuarzo de 1 mm de paso óptico, de acuerdo a la metodología propuesta por Ayala et al. (1997). Las coordenadas de claridad (L*), croma (C*), tono (H*), a* y b* fueron calculadas utilizando el programa MSCV (Universidad de la Rioja) (Ayala y col., 2001). Tamaño medio de polimerización de taninos. Las proantociandinas de los hollejos fueron purificadas usando una columna Toyopearl TSK HW 40-F (Kennedy y Jones, 2001). La columna (100 mm*10mm) fue equilibrada con 30 mL de etanol/agua (55/45, v/v) conteniendo 0,5 % v/v de ácido trifluoroacético (solución A). 15 mL de extracto de hollejos fueron aplicados a la columna. La columna fue lavada con 50 mL de solución A para remover carbohidratos y material monomérico de flavan-3oles de bajo peso molecular. Las proantocianidinas fueron eluídas con 30 mL de acetona/agua (60/40). La muestra fue concentrada y secada bajo presión a 30 ºC para remover la acetona, y redisuleto en 0,5 mL de metanol. A esta, se le agregó 0,5 mL de una solución de floroglucinol (0,25 g de ácido ascórbico, 1,25 g de floroglucinol, 215 µL de ácido clorhídrico concentrado y completada a 25 mL con metanol), dejándola reaccionar a 50 ºC por 20 minutos. Luego de este tiempo, fue añadido 0,5 ml de una solución acuosa de acetato de sodio 200 mM con el fin de detener la reacción. La muestra obtenida fue analizada - 67 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère por HPLC-DAD. Se utilizó una gradiente binaria cuya fase móvil contenía ácido acético en agua (1%, v/v) (fase móvil A) y metanol (fase móvil B). Los picos obtenidos de las muestras fueron monitoreados a 280 nm. Las condiciones de elusión fueron: flujo de 1,0 mL/minuto; 100% A por 15 min, gradiente lineal desde 95 a 80% A en 20 minutos, gradiente lineal desde 80 a 60% A en 26 minutos y 10% A por 10 min. La columna fue finalmente equilibrada con 100% A por otros 6 minutos antes de la inyección de la muestra siguiente. El grado medio de polimerización (mDP) fue obtenido por la división entre la totalidad de las subunidades identificadas (proantocinidinas terminales y extensión) y las proantocianidinas terminales. En el caso del porcentaje de galoilación (% G) se obtuvo por división entre la totalidad de procianidinas galoiladas y la totalidad de las procianidinas identificadas, multiplicado por 100. Finalmente, el peso molecular promedio (aMW) se obtuvo del resultado de la ecuación mDP * [288 + (152 * %G / 100)] + 2. Fraccionamiento de flavan-3-oles por cartuchos C18 Sep-Pak. Los extractos de hollejos fueron fraccionados siguiendo el método descrito por Sun y col. (1998b). Ocho mililitros (mL) de extracto de hollejos fueron concentrados y secados utilizando evaporación rotatoria a una temperatura de 30 ºC. El residuo fue disuelto en 20 mL de tampón fosfato pH 7,0 (67 mM). Cuando fue necesario el pH fue ajustado a 7,0 con una solución de NaOH o HCl. Dos cartuchos C18 conectados en series fueron acondicionados con metanol (10 mL), agua destilada (20 mL) y tampón fosfato pH 7,0 (10 mL). Las muestras fueron conducidas por los cartuchos a un flujo no mayor de 2 mL/min. Los ácidos fenólicos fueron primeramente arrastrados con 10 mL de tampón fosfato pH 7,0. Luego los cartuchos fueron secados durante 2 horas con nitrógeno gaseoso. La separación de monómeros y oligómeros de flavan-3oles (fracciones FI + FII) fue llevada a cabo con 25 mL de acetato de etilo, seguido por el arrastre de polímeros proantocianidinicos (fracción FIII) con 15 mL de metanol. La fracción con acetato de etilo fue evaporada bajo presión, redisuelta en 3 mL de tampón fosfato pH 7,0, y finalmente redepositada en la serie de cartuchos preacondicionados como se describió anteriormente. Los cartuchos fueron secados con nitrógeno durante 1 hora y los monómeros (FI) fueron separados de los oligómeros (FII) por un arrastre secuencial con 25 mL éter dietílico y 15 mL de metanol. Las tres fracciones fueron secadas bajo presión y redisueltos en 5 mL de metanol. El contenido total de flavan-3-oles de cada fracción fue determinado mediante el ensayo con vainillina. Contenido de flavan-3-oles mediante el ensayo con vainillina. Esta metodología se realizó de acuerdo a la utilizada por Sun y col. (1998c). Una alícuota de 2,5 mL de una solución ácido sulfúrico/metanol (25/75, v/v) junto con 1 mL de la muestra fueron colocados en dos tubos de ensayo. A uno de ellos se le agregó 2,5 mL de vainillina 1% en metanol (p/v) y al otro 2,5 mL de metanol (control). Ambos tubos fueron incubados por 15 minutos a 30 ºC (fracción F1) y por un período suficiente para alcanzar el máximo de reacción (fracciones FII y FIII). Las muestras fueron medidas a una absorbancia de 500 nm. Los g/L de las diferentes fracciones se obtuvieron por la diferencia de las densidades ópticas del tubo con vainillina y metanol multiplicado por la dilución (5), dividido por - 68 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère mililitros utilizados inicialmente (8) y por un factor proveniente de la curva patrón. Los factores de la curva patrón utilizados fueron 0.0081, 0.0046 y 0.0037 para las fracciones F1, F2 y F3, respectivamente. Análisis de fenoles de bajo peso molecular mediante HPLC-DAD. Para la caracterización y cuantificación de los compuestos fenólicos de los extractos de hollejos por HPLC-DAD se realizó una purificación y concentración a través de una extracción líquido-líquido según trabajos realizados previamente por diversos autores (Peña-Neira y col., 2007; Peña-Neira y col., 2004; Matus y col., 2008; Obreque-Slier y col., 2009). A 50 mL de la muestra del extracto de hollejo se le realizaron 3 extracciones líquido-líquido con 20 mL de éter dietílico y 3 extracciones con 20 mL acetato de etilo. El residuo acuoso se descartó y se mezclaron los 6 extractos orgánicos con 10 g de sulfato de sodio anhidro y después de 30 minutos la muestra se filtró y se llevó a sequedad en un rotavapor a 30 ºC. Una vez seca, la muestra fue redisuelta en 2 mL de una solución de metanol/agua (50/50, v/v) y filtrada (0,45 m). La solución resultante fue sometida finalmente a un análisis por cromatografía líquida inyectándose para cada muestra 50 µL. Dos fases móviles fueron utilizadas: A, agua/ácido acético (98/2, v/v) y B, agua/acetonitrilo/ácido acético (78/20/2, v/v/v) de acuerdo a la siguiente gradiente: 0-55 minutos, 100-20 % A y 55-70 minutos, 20-10 % A. El tiempo de equilibrio antes de la siguiente inyección fue realizado por 15 minutos en las condiciones iniciales. La identificación de los compuestos se realizó de acuerdo al tiempo de retención de los picos del cromatograma y espectro de absorción, en comparación con las sustancias patrón inyectadas en las mismas condiciones cromatográficas a una longitud de onda de 280 nm. En el caso de los compuestos para los cuales no se disponían de patrones, la identificación se hizo por comparación de sus espectros de absorción y tiempo de retención reportado por diversos autores (Peña-Neira y col., 2007; Peña-Neira y col., 2004; Matus y col., 2008, Obreque-Slier y col., 2009). La evaluación cuantitativa de las muestras se efectuó inyectando distintas cantidades de una solución patrón, en las mismas condiciones cromatográficas en las que se inyectan las muestras, midiéndose el área bajo los picos correspondientes. Las rectas de regresión obtenidas corresponden a una ecuación y = ax + b, donde y es la concentración de la sustancia patrón y x el área de su pico cromatográfico. Análisis de antocianos mediante HPLC-DAD. Para la caracterización y cuantificación de los antocianos se realizó una inyección directa de 100 L de extracto de hollejo en el equipo de HPLCDAD, previamente filtrado con un filtro de membrana de 0,45 m (Peña-Neira y col., 2007). Dos fases móviles fueron utilizadas: A, agua/ácido fórmico (90/10, v/v) y B, acetonitrilo. La gradiente utilizada fue: 0-7,8 minutos, 96-85 % A (flujo 1,1 mL/min); 7,9-22,9 minutos, 85 % A (flujo 1,1 mL/min): 2326,9 minutos, 85-80 % A (flujo 1,1 mL/min); 27-40 minutos, 80-70 % A (flujo 1,5 mL/min); 40,1-43 minutos, 70 % A (flujo 1,5 mL/min) y 43,1-45 minutos, 96 % A (flujo 1,1 mL/min). La identificación de los compuestos se realizó de acuerdo al procedimiento realizado para la identificación de fenoles de bajo peso molecular a una longitud de detección de 520 nm. - 69 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère RESULTADOS Y DISCUSIÓN Parámetros analíticos generales. Las muestras de bayas de los cultivares en estudio fueron cosechadas mensualmente durante 4 meses: 15 días después de pinta (20 de febrero), 45 después de pinta (20 de marzo), en madurez de cosecha (20 de abril) y sobremaduración (20 de mayo). La Tabla 1 muestra los valores de peso de hollejos/100 bayas y composición fenólica global de hollejos de bayas de Carménère (CA), Merlot (M), Cabernet Franc (CF) y Cabernet Sauvignon (CS) durante la maduración. En el caso de la evolución del peso de hollejos/100 bayas, no fue posible observar una tendencia clara en ninguno de los cuatro cultivares y mientras los hollejos de CA y CS presentaron valores más altos en el último muestreo comparado con el primero, en el caso de los hollejos de M y CF se observó una tendencia opuesta. Este comportamiento irregular en el peso de los hollejos ha sido observado en otros trabajos (Peña-Neira y col., 2007). En el caso del contenido de fenoles y antocianos totales en hollejos, los cuatro cultivares presentaron una máxima concentración en el segundo muestreo disminuyendo paulatinamente hacia el final. Este comportamiento es coincidente con la tendencia observada en trabajos previos (Peña-Neira y col., 2004; Matus y col., 2008). Además, los mayores contenidos de estos compuestos fueron observados alternadamente en CA y M. Finalmente, el contenido de taninos totales de los hollejos de CS y M mostró sus mayores valores en el segundo y tercer muestreo, respectivamente. Mientras que en hollejos de CA y CF no se observaron variaciones significativas en el contenido de taninos totales durante la maduración. Además, mientras M presentó el mayor contenido de taninos totales en los últimos dos muestreos, los hollejos de CA presentaron los mayores valores iniciales, diferencias que fueron estadísticamente significativas al compararlas con CF y CS. Coordenadas CIElab. El sistema CIELab permite determinar las características cromáticas a través de coordenadas colorimétricas o de cromaticidad (Méndez y col., 2004; Mangine y col., 2005; PérezMagariño y González-San José, 2003). La coordenada L*, que representa la luminosidad, varía del blanco perfecto con un valor de 100, al negro con un valor de 0 (Gil-Muñoz, 1997). En nuestro estudio, se observó que los hollejos de los cuatro cultivares presentaron valores entre 56,9 y 79,1, más cercanos al máximo que al mínimo. Asimismo, mientras los hollejos de CA y M presentaron sus menores valores entre el primer y segundo muestreo, ambos presentaron valores mayores hacia el final del estudio. En el caso de los hollejos de CF y CS no se observaron variaciones significativas en los valores de L durante la maduración (Tabla 2). El parámetro a*, que varía entre el color rojo (+) y verde (-) (Pérez-Magariño y González-San José, 2003), presentó valores positivos en los hollejos de todos los cultivares y muestreos. Fue posible visualizar que los hollejos de CA y M presentaron valores menores de a* hacia el final del estudio, mientras que los hollejos de CF y CS no mostraron diferencia significativas durante la maduración. A pesar que M presentó los mayores valores de la componente a* en los últimos tres muestreos, no fueron observadas diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en ningún muestreo (Tabla 2). La tendencia del parámetro a* es similar a lo observado con el comportamiento ascendente de los antocianos y fenoles totales hasta el segundo muestreo para luego - 70 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère declinar paulatinamente hacia el final. El componente b* fluctúa entre el color amarillo (+) al azul (-) (Pérez-Magariño y González-San José, 2003). En este estudio se observaron valores negativos para todos los cultivares durante el ensayo, es decir los hollejos sólo presentaron la componente azul. Es interesante notar, que los hollejos de CA y CS presentaron sus mayores valores en el último muestreo, mientras que el cultivar M y CF no mostró diferencias en los valores de b* durante la maduración. Asimismo, los hollejos de M presentaron los valores más positivos en todos los muestreos y CS presentó los valores más negativos. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en el segundo y cuarto muestreo (Tabla 2). La cromacidad (C*), indica el aporte de a* (color rojo) y b* (color amarillo) al total del color (Gil-Muñoz y col., 1997). En este estudio se observó que los hollejos de CA y M presentaron menores valores de cromacidad hacia el final del estudio. Del mismo modo, mientras M presentó mayores valores comparado con los otros cultivares en los últimos dos muestreos, CA presentó el mayor valor inicial, diferencia que fue estadísticamente significativa con CF (Tabla 2). El parámetro H, que indica la tonalidad, varia entre el violeta (H=315º) y el rosado (H=0º) (6). En el caso de los hollejos de los cultivares CA y CS, presentaron sus valores más altos en el último muestreo y los más bajos en el primer muestreo. Los hollejos de M presentaron los valores más altos de tonalidad y CS los más bajos durante todo el estudio, diferencias que fueron estadísticamente significativas en los últimos 3 muestreos (Tabla 2). De las observaciones descritas anteriormente, se puede observar que a pesar que los parámetros L*, C* y a* no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos, los H* y b*, mostraron claras diferencias entre los hollejos de M y CS en la mayoría de los muestreos. Finalmente, es interesante notar que los hollejos del cultivar CF no presentaron ninguna variación estadísticamente significativas durante la maduración en ningún parámetro CIElab analizado. Cuantificación de antocianos en hollejos mediante análisis de HPLC-DAD. La Tabla 3 muestra los antocianos identificados y cuantificados en los hollejos de los cuatro cultivares mediante HPLC-DAD durante la maduración. Las antocianinas identificadas y cuantificadas fueron: delfinidina3-glucósido (DPgl), cianidina-3-glucósido (CYgl), petunidina-3-glucósido (PTgl), peonidina-3glucósido (POgl), malvidina-3-glucósido (MVgl), delfinidina-3-acetilglucósido (DPac), cianidina-3acetilglucósido (CYgl), petunidina-3-acetilglucósido (PTac), peonidina-3-acetilglucósido (POac), malvidina-3-acetilglucósido (MVac), delfinifina-3-p-cumarilglucósido (DOcu), cianidina-3-pcumarilglucósido (CYcu), petunidina-3-p-cumarilglucósido (PTcu), peonidina-3-p-cumarilglucósido (POcu) y malvidina-3-p-cumarilglucósido (MVcu). La antocianina más abundante identificada en los hollejos de los cuatro cultivares analizados fue la malvidina 3-glucósido, concordando con lo encontrado por otros autores (Boss y col., 1996; Burs y col., 2002). En el caso de esta antocianina, los hollejos del cultivar CA presentaron mayores concentraciones que los hollejos de CF, diferencias fueron estadísticamente significativas en los tres últimos muestreos. Por el contrario se pudo observar que a pesar que DOcu fue identificada en el primer muestreo en tres cultivares, en los últimos dos muestreos no fue detectada en ningún cultivar. En el caso de los hollejos de CA, M y CS, se observó que la mayoría - 71 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère de las antocianinas identificadas presentaron sus valores más altos en el segundo muestreo. Esta observación coincide con el comportamiento observado en la cuantificación de antocianos totales mediante espectrofotometría. En el caso del comportamiento de cada variedad durante la maduración, se pudo observar que ocho de las quince antocianinas identificadas en los hollejos de CA, presentaron una tendencia decreciente hacia el final del estudio, mientras que la concentración de las antocianinas restantes mostró un comportamiento estable, sin diferencias significativas. Por su parte en los hollejos de M, once de las antocianinas identificadas presentaron un máximo de concentración en el segundo muestreo. En el caso de los hollejos de bayas de CF, nueve de las antocianinas presentaron sus concentraciones más bajas en el segundo muestreo. Es interesante notar, que todas las antocianinas presentes en los hollejos de CS (a excepción de CYac) no mostraron variaciones significativas en sus concentraciones durante el estudio. Por último, al sumar la totalidad de las antocianinas glucosiladas, acetiladas y cumariladas, se pudo observar que en el primer caso, los hollejos de CA presentaron mayores concentraciones que CF y CS, en los muestreos dos y tres, respectivamente (Figura 1). En el caso de las antocianinas acetiladas, no se observaron diferencias significativas entre los cultivares. Por otro lado, la concentración de antocianinas cumariladas presentes en los hollejos de CA fue mayor que las encontradas en CS y CF en el muestreo uno y dos, respectivamente. Finalmente, la sumatoria de la totalidad de los antocianos identificados y cuantificados por HPLC-DAD, muestra que el cultivar CA presentó concentraciones mayores que CF, pero sólo en el segundo muestreo (Figura 1). Las concentraciones observadas en este estudio coinciden con lo observado en trabajos previos (Peña-Neira y col., 2007) y diferencias similares han sido observadas entre el CS y otros cultivares (Guerrero y col., 2009). Cuantificación de compuestos fenólicos de bajo peso molecular en hollejos durante la maduración mediante análisis de HPLC-DAD. En la Tabla 4 se muestran los compuestos identificados y cuantificados mediante HPLC-DAD en hollejos de los cuatro cultivares en estudio durante la evolución de su maduración. Los compuestos fenólicos de bajo peso molecular fueron identificados: tres compuestos no flavonoides [ácido gálico (GA), ácido vainillínico (VA) y ácido siríngico (SA)], dos flavan-3-oles [(+)-catequina y epicatequina-3-O-galato (ECG) ] y diversos flavonoles [miricetina-3-galactósido (Mga), miricetina-3-glucósido (Mgl), quercetina-3-galactósido (Qga), quercetina-3-glucorónido (Qgr), quercetina-3-glucósido (Qgl), kaempferol-3-galactósido (Kga), kaempferol-3-glucósido (Kgl), isorhamnetina-3-glucósido (Igl) e isorhamnetina-3-glucorónido (Igr)]. Estos compuestos han sido encontrados por diversos autores en diferentes cultivares (Peña-Neira y col., 2007; Matus y col., 2008; Rodríguez-Montealegre y col., 2006; Castillo-Muñoz y col., 2009). De la totalidad de los compuestos fenólicos identificados en los hollejos, el flavonol Qgl fue el más abundante en todos los cultivares, coincidiendo con lo observado por otros autores (Matus y col., 2008; CastilloMuñoz y col., 2009). - 72 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère A continuación se detallan los resultados de la evolución de los diferentes compuestos fenólicos de bajo peso molecular identificados en los cuatro cultivares que presentaron diferencias estadísticamente significativas durante la maduración. En cuanto a los compuestos no flavonoides, el GA presentó sus mayores concentraciones en el segundo y tercer muestreo, para los cultivares CF y M, respectivamente, finalizando en el último muestreo con valores similares a los iniciales. Por su parte el VA presentó concentraciones crecientes durante el estudio en hollejos de M, mientras que en CS presentó concentraciones decrecientes entre el primer y cuarto muestreo. Asimismo, el SA mostró sus menores magnitudes en el primer y cuarto muestreo en los hollejos de CA y CS, respectivamente. En el caso de los flavan-3-oles identificados, la ECG presentó las mayores concentraciones en el último muestreo, salvo en los hollejos de CF donde no se observaron variaciones significativas durante la maduración. Por su parte, el monómero de C presentó mayores valores hacia el último muestreo en todos los tratamientos. En el caso de los flavonoles identificados en los hollejos de los cuatro cultivares, la mayoría de éstos presentaron sus mayores concentraciones entre el primer y segundo muestreo con excepción de la Kga e Igr que presentaron sus valores mayores en los dos últimos muestreos. Al evaluar las diferencias cuantitativas de fenoles de bajo peso molecular de los hollejos presentes entre los cuatro cultivares en cada muestreo se pudo observar que los hollejos de M presentaron concentraciones mayores de GA sólo en el tercer muestreo, mientras que CS concentraciones mayores cantidades de SA en el primer muestreo comparado con los otros cultivares. Las variaciones en las concentraciones de VA no fueron diferenciadoras entre los cultivares durante el estudio. Por otro lado, de los flavan-3-oles identificados, los hollejos de CS presentaron las mayores concentraciones de C en 3 de los 4 muestreos. Para el caso de los flavonoles, los hollejos del cultivar CS presentaron mayores valores de Kga en 3 de los 4 muestreos. Por su parte, M presentó concentraciones mayores de Mga y Qgl mientras que los hollejos de CA presentaron las mayores concentraciones de Mgl, Qgr, Kgl e Igl en a lo menos tres muestreos. Asimismo, los hollejos de CS, CA y CF presentaron menores concentraciones de Mga, Qgl y Kgl en tres fechas de muestreo, respectivamente. Finalmente, al sumar la totalidad de los flavonoles, los hollejos del cultivar M presentaron los valores más altos en los últimos tres muestreos. Diferencias entre los compuestos fenólicos de bajo peso molecular en hollejos de bayas de M y CS han sido reportadas por otros autores (Rodríguez-Montealegre y col., 2006). Proantocianidinas en hollejos separadas de acuerdo a su grado de polimerización. En el caso de la cuantificación de las fracciones mono, oligo y poliméricas de hollejos, ésta fue realizada sólo en dos fechas de muestreos (20 de febrero y 20 de abril). Como se observa en la Figura 2, la fracción flavanólica polimérica fue la más abundante, seguida de la fracción oligomérica, mientras que la fracción monomérica obtuvo la menor participación. El orden de participación señalado coincide plenamente con lo observado por Monagas y col. (1993). La Figura 2 muestra que la mayoría de las fracciones presentaron concentraciones diferenciales entre el 20 de febrero y 20 de abril en todos los cultivares. Por otro lado, se pudo observar que la fracción monomérica de flavan-3-oles [(+)-catequina, (-)-epicatequina, (-)-epigalocatequina y (-)- - 73 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère galocatequina], presentó valores superiores en los hollejos de CS comparado con los demás cultivares, diferencia respaldada estadísticamente en ambos muestreos. De acuerdo Sun y col., (1998b) la fracción oligomérica está conformada por 2-4 unidades de monómeros mientras que los polímeros pueden comprender desde 5 a más unidades en su composición (Rodríguez-Montealegre y col., 2006). En este estudio se observó que a pesar que los hollejos de CS presentaron menores concentraciones de fracción oligo y polimérica en la fecha cercana a pinta, en la fecha de madurez de cosecha (20 abril) presentó los mayores valores, con respecto a los demás cultivares. Aunque las concentraciones de las diferentes fracciones está por debajo de lo observado por Sun y col. (1998b), los valores presentados en este estudio son mayores que los observados por Monagas y col. (2003) en bayas de los cultivares Graciano, Tempranillo y Cabernet Sauvignon. Floroglucinólisis. Al igual que lo mencionado en el análisis de fraccionamiento, esta metodología fue sólo aplicada en hollejos sólo en dos fechas de muestreo. Se pudo observar que la mayoría de los hollejos de los diversos cultivares presentaron diferencias sustanciales en los valores de mDP, % G, % EG y aMW entre ambas fechas de muestreos, con excepción del % G de los flavan-3-oles de hollejos de CS y del mDP y aMW de los flavan-3-oles de hollejos de CA y M, que no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las dos fechas de muestreo. En el caso del mDP y aMW se pudo observar que los cultivares CF y CS presentaron valores mayores en la segunda fecha de muestreo (20 de abril) comparado con la primera (20 de marzo), siendo CS la presentó el mayor valor en el segundo muestreo con respecto a los demás cultivares (Figura 3). Esta observación coincidiría con lo descrito anteriormente, donde los hollejos de CS presentaron una alta concentración de polímeros, que al estar en mayor proporción comparado con las demás fracciones, determinaría un mayor mDP y aMM para las proantocianidinas de los hollejos de éste cultivar. Por otro lado, se observó que mientras los hollejos de CA, M y CF presentaron valores menores de % G en el primer muestreo comparado con el segundo, el cultivar CS presentó un comportamiento contrario (Figura 3). Asimismo, a pesar que CA presentó el menor y CS el mayor valor de % G en el primer muestreo, los cuatro cultivares presentaron valores similares en el segundo (cercano al 13,5 %). Por otro lado, los hollejos de CA, M y CF presentaron los menores valores de % EG en el segundo muestreo, mientras que CS presentó un mayor valor en el segundo muestreo comparado con la primera fecha. Sólo fueron observadas diferencias significativas entre los cultivares en el segundo muestreo donde CS presentó el mayor valor de % EG (Figura 3). Los valores de mDP, aMW, % G y % EG descritos en este estudio concuerdan con lo observado por diversos autores (Kennedy y Jones, 2001; Kennedy y col., 2001). Las observaciones descritas anteriormente muestran diferencias en el contenido de peso de hollejos, fenoles totales, taninos totales, antocianos totales y cromacidad entre CA y CS, y entre CA y CF en la luminosidad de los extractos de hollejos en algunos muestreos del estudio. Además, se observaron diferencias durante el ensayo entre M y CS en cuanto a la tonalidad, mientras que los hollejos del cultivar CS se caracterizaron por sus mayores valores de fracción monomérica, oligomérica de flavan-3- - 74 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère oles, grado medio de polimerización y peso molecular promedio con el resto de los cultivares. El análisis de fenoles de bajo peso molecular presentes en hollejos mediante HPLC-DAD, mostró que los hollejos de los cultivares CA, M y CS se distribuyeron las mayores concentraciones de cada uno de los compuestos identificados. Finalmente, al sumar la totalidad de los flavonoles, los hollejos del cultivar M presentaron los valores más altos en los últimos tres muestreos. Finalmente, al sumar la totalidad de los antocianos identificados y cuantificados por HPLC-DAD, los hollejos del cultivar CA presentaron valores más altos que los hollejos de CF, pero solo en un muestreo. - 75 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Tabla 1. Peso de hollejos y concentración de compuestos fenólicos en hollejos de bayas de Carménère (CA), Merlot (M), Cabernet Franc (CF) y Cabernet Sauvignon (CS). Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letras minúsculas diferentes en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). EAG, equivalentes de ácido gálico; EC, equivalentes de (+)-catequina; EM, equivalentes de malvidina-3-glucósido. - 76 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Tabla 2. Valores del espacio CIElab. Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letras minúsculas diferentes en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 77 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Table 3. Antocianinas (mg/Kg) identificadas y cuantificadas mediante HPLC-DAD. - 78 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letras minúsculas diferentes en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). Delfinidina-3-glucósido (DPgl), cianidina-3-glucósido (CYgl), petunidina-3-glucósido (PTgl), peonidina-3-glucósido (POgl), malvidina-3-glucósido (MVgl), delfinidina-3-acetilglucósido (DPac), cianidina-3-acetilglucósido (CYgl), petunidina-3acetilglucósido (PTac), peonidina-3-acetilglucósido (POac), malvidina-3-acetilglucósido (MVac), delfinifina-3-cumarilglucósido (DOcu), cianidina-3-cumarilglucósido (CYcu), petunidina-3-cumarilglucósido (PTcu), peonidina-3-cumarilglucósido (POcu) y malvidina-3-cumarilglucósido (MVcu). - 79 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Table 4. Compuestos fenólicos de bajo peso molecular identificados mediante análisis de HPLC-DAD. - 80 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Figuras representan promedio ± desviación estándar (triplicado). Letras minúsculas diferentes en la columna representa diferencia estadísticamente significativa entre los cultivares (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes en la fila representa diferencia estadísticamente significativa entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). Acido gálico (GA), ácido vainillínico (VA), ácido siríngico (SA), (+)-catequina, epicatequina-3-O-galato (ECG), miricetina3-galactósido (Mga), miricetina-3-glucósido (Mgl), quercetina-3-galactósido (Qga), quercetina-3-glucorónido (Qgr), quercetina3-glucósido (Qgl), kaempferol-3-galactósido (Kga), kaempferol-3-glucósido (Kgl), isorhamnetina-3-glucósido (Igl) e isorhamnetina-3-glucorónido (Igr). - 81 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Figure 1. Sumatoria de antocianinas glucosiladas, acetilglucosiladas y cumarilglucosiladas de hollejos de bayas de los cultivares en estudio. Letras minúsculas diferentes representan diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en las distintas fechas de muestreo (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes representa diferencias estadísticamente significativas entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Tuckey test, p < 0.05). - 82 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Figure 2. Concentración de fracciones de flava-3-oles monoméricos, oligoméricos y poliméricos presentes en semillas de bayas de los cultivares en estudio. Letras minúsculas diferentes representan diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en las distintas fechas de muestreo (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferentes representan diferencias estadísticamente significativas entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Test t student, p < 0.05). - 83 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.3: Caracterización fenólica de hollejos de Carménère Figure 3. Valores de mDP, % galoilación, % de epigaloilación y aMW en hollejos de bayas de los cultivares en estudio. Letras minúsculas representan diferencias estadísticamente significativas entre los cultivares en las distintas fechas de muestreo (Tuckey test, p < 0.05). Letras mayúsculas diferente representan diferencias estadísticamente significativas entre las distintas fechas de muestreo para cada cultivar (Test t student, p < 0.05). - 84 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO I: Caracterización fenólica de bayas del cultivar Carménère - SUBCAPÍTULO I.4. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA COMPOSICIÓN FENÓLICA DE SEMILLAS Y HOLLEJOS DE BAYAS DE LOS CULTIVARES CARMÉNÈRE Y CABERNET SAUVIGNON DURANTE LA MADURACIÓN Artículo publicado en: Journal of Agricultural and Food Chemistry Manuscript DOI: 10.1021/jf904314u - 85 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 87 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 88 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 89 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 90 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 91 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 92 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 93 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 94 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo I Subcapítulo I.4.: Comparación fenólica entre Carménère y Cabernet Sauvignon - 95 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS Como se ha observado en el capítulo anterior, la composición y concentración de los compuestos fenólicos difiere no sólo entre los tejidos (semillas y hollejos) de un mismo órgano, sino que también entre cultivares de Vitis vinifera. Estas diferencias fenólicas podrían provocar variaciones en características sensoriales de alta relevancia como, por ejemplo, la astringencia. La astringencia es un atributo sensorial de interés fundamental en enología, que ha sido asociado a la interacción de taninos con proteínas salivales. Esta propiedad es evaluada sensorialmente mediante paneles entrenados para tal fin. Para la medición objetiva de las interacciones moleculares asociadas a la astringencia, se han propuesto distintos métodos de laboratorio que se basan en la medición de alteraciones fisicoquímicas que experimentan suspensiones proteicas provocadas por la presencia de taninos. En muchos de estos estudios cuantitativos, no se distingue entre taninos, proteínas y/o complejos tanino-proteína. La inmovilización de proteínas en matrices sólidas es una técnica básica en variados métodos analíticos modernos en bioquímica y biología molecular. Así, se han diseñado métodos de cuantificación de proteínas que utilizan matrices sólidas y que comprenden la fijación de la muestra sobre una superficie de celulosa, la tinción selectiva de la proteína con un colorante que se une estequiométricamente a éstas y su elusión mediante un solvente adecuado. Varias de estas propiedades de las proteínas no son exhibidas por los taninos, aspecto que podría ser aprovechado con ventajas en el estudio de la interacción tanino-proteína. En forma previa a la caracterización de la metodología propuesta para la evaluación de la interacción tanino/proteína con fracciones fenólicas provenientes de la uva, se usarán taninos comerciales de uso enológico. Para ello se caracterizarán diez taninos comerciales. La ventaja de utilizar taninos comerciales, es que son productos rotulados y disponibles en gran cantidad, lo que permitiría acceder a extractos puros de taninos proantocianidínicos e hidrolizables para ser usados en la evaluación de su interacción con diferentes tipos de proteínas y en diferentes medios. Considerando lo expuesto anteriormente, en este capítulo se han propuesto los siguientes Objetivos Específicos: • • Caracterizar la composición fenólica de taninos comerciales de uso enológico. Evaluar la interacción tanino-proteína usando membranas laminares de celulosa como soporte sólido. • Evaluar el efecto del contenido de etanol y pH sobre la interacción tanino/proteínas salivales y su relación con la astringencia. Los estudios orientados al cumplimiento de los Objetivos Específicos señalados se presentan a continuación como los Subcapítulos II.2., II.3.-II.4. y II.5.-II.6., respectivamente. - 99 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.2. CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE TANINOS ENOLÓGICOS COMERCIALES Artículo publicado en: European Food Research and Technology 2009, volumen 229, páginas 859-866 - 101 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 103 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 104 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 105 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 106 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 107 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 108 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 109 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.2.: Caracterización fenólica de taninos enológicos - 110 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.3. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LAS INTERACCIONES ENTRE UN TANINO Y UNA PROTEÍNA MODELO MEDIANTE ENSAYOS DE DIFUSION Y PRECIPITACION EN MEMBRANAS DE CELULOSA Artículo enviado para su publicación a: Journal of Agricultural and Food Chemistry Manuscript ID: jf-2010-00631k 15 de Febrero del 2010 - 111 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa INTRODUCTION Perceived astringency during food tasting is an important determinant of consumer behavior. Astringency is a drying, roughing and sometimes puckering sensation that is experienced on the various oral surfaces during or immediately after tasting foods (Bacon and Rhodes, 2000; De Freitas and Mateus, 2001). For some foods, such as red wine, both the absence and the excess of astringency may represent negative features of the product. Biochemical mechanisms underlying the physiological basis of astringency perception by humans have usually involved physicochemical interactions between phenolic compounds present in the foods and some particular families of salivary proteins, such as the salivary proline-rich proteins and histatins (Bacon and Rhodes, 2000; De Freitas and Mateus, 2001; Nautaro et al., 1999). Also frequently, those interactions have been associated to the formation of insoluble protein/polyphenol complexes (Haslam, 1996; Jöbstl et al., 2004; Charlton et al., 2002a; Hagerman and Butler, 1981). Thus, a number of widely used in vitro laboratory assays have been designed to estimate objectively the strength of the astringency sensation whereas direct assessment of astringency is performed in parallel by panels of trained tasters (Bacon and Rhodes, 1998; Valentova et al., 2002, De Freitas and Mateus, 2001; Kallithraka et al., 2000; Wu and Lu, 2004; Charlton et al., 2002a; Jöbstl et al., 2004; Llaudy et al., 2004). Currently, the Gelatin Index is the most common laboratory test in the winemaking industry to assess protein/polyphenol interactions and so to optimize production conditions (Glories, 1984). Such assay measures the fraction of procyanidins (measured as optical density at 550 nm following acid hydrolysis) of a sample that remains unprecipitated upon adding an excess of gelatin and incubating for 3 days (Glories, 1984). Besides its lengthy time, this procedure has been the focus of controversies associated with the lack of both reproducibility and correlation with sensory tests, mostly as a consequence of the use of gelatin, a highly diverse protein product that is extracted from collagens of different origins by means of a variety of chemical and biochemical procedures (Llaudy et al., 2004). In a recent study, Llaudy et al. (2004) have proposed to assess protein/polyphenol interactions, and so to estimate astringency, by means of the replacement of gelatin by a globular soluble pure and abundant protein, ovalbumin. The assay is based on measuring the degree of ovalbumin precipitation by spectrophotometry at 280 nm and has been reported to be more reproducible and better correlated with sensory analysis than the gelatin index. However, with respect to the specific purpose of estimating protein/polyphenol interactions this procedure fails to distinguish between the protein and polyphenol component of the complexes since both type of molecules do exhibit light absorption at 280 nm. In addition, that procedure takes into consideration only the formation of protein/tannin precipitates with no regard of the eventual formation of soluble protein/tannin complexes. Highly selective protein-binding dyes have been widely used in analytical biochemistry. The most conspicuous example is protein detection by Coomassie blue R-250 on matrices of polyacrylamide gels used for fractionating proteins by electrophoresis (Wu and Lu, 2004, Gambuti et al., 2006). Such a colorant has been successfully used to stain protein against a background of pure cellulose (Bramhall et - 113 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa al., 1969; Durham and López Solís, 1979; López Cisternas et al., 2007). Furthermore, proteins staining on cellulose membranes have been also productive in the description of differential modes of diffusion displayed on that surface by the protein fraction of a variety of biological fluids (López Cisternas et al., 2007; Morales-Bozo et al., 2007). The present study was aimed at quantitating interactions between a model globular pure protein, bovine serum albumin (BSA), with an extract of a model tannin, tannic acid (TA). The assay was based on observing the effect of the tannin on the diffusion of the protein on a cellulose membrane (diffusion assay) and on studying the tannin-induced disappearance of the protein from a supernatant (precipitation assay). Protein detection was performed by using a selective proteinbinding dye with unsignificant ability to bind the tannin reactant. - 114 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa MATERIALS AND METHODS Materials. Bovine serum albumin (66.000 Da), tannic acid and gallic acid were purchased from Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. Cellulose membranes (Whatman #1) were purchased from Whatman Ltd (Maidstone, England). Solvents used for cellulose membrane processing were purchased from Merck, Santiago, Chile. HPLC grade acetic acid and acetonitrile were purchased from Merck, Darmstadt, Germany. Other pro-analysis grade solvents and reagents were obtained from Oxiquim-Chile. The HPLC system consisted of a photodiode-array detector model G1315B, a quaternary pump model Quat G1311A and an autosampler model ALS G1329A (Agilent Technologies 1200) fitted with a reversed phase Nova Pack C18 (4um, 3.9 mm id x 300 mm) (Waters Corporation, Milford, M.A. USA). BSA and TA working solutions. BSA was dissolved in water at 40ºC using mechanical agitation during 20 minutes. The resulting solution was centrifuged at 3000 rpm x 5 minutes and the 280 nm absorbance of the supernatant was adjusted to 0.7. TA was dissolved in water with mechanical agitation at a final concentration of 10 mg/ml. HPLC–DAD characterization of TA. A 50-mL aliquot of tannic acid was extracted successively with ethyl ether (3 x 20mL) and ethyl acetate (3 x 20 mL). The total extract was evaporated to dryness at 30 ºC, dissolved in 2 mL of 1:1 v/v methanol/H2O and filtered through 0.45- m pore-size membranes. Aliquots of 20 µL were subjected to HPLC fractionation. Two solutions were used to produce mobile phases at a constant flow rate of 1 mL/min: A, water-acetic acid 98:2 v/v and B, wateracetonitrile-acetic acid 78:20:2 v/v/v. The gradient profile was 0-55 min, 100-20 % A; 55-57 min, 2010 % A; 57-90 min, 10-0 % A. Detection was performed by UV absorptiometry at various wavelengths in a range from 210 to 360 nm with an acquisition speed of 1/sec (Obreque-Slier, 2009). Characterization of compounds corresponding to individual HPLC peaks was performed by comparing their UV absorption spectra and retention times with those of pure standards (Cadahía et al., 1997a and 1997b; Santos Buelga et al., 2003). Both fractionation and composition analysis were performed in three independent experiments. Protein diffusion assay on cellulose membranes. Aliquots of BSA and aliquots of TA solutions, representing each experimental condition, were mixed in an Eppendorf tube, vortexed for 10 seconds and allowed to stand for 5 minutes. BSA alone and TA alone served as controls. Twenty microliter aliquots from the BSA plus TA mixtures were spotted on a cellulose membrane (Whatman 1), air-dried at room temperature for 10 minutes, fixed for 5 minutes in 5% trichloroacetic acid, rinsed for 5 minutes in 80% ethanol, and stained for 20 minutes in 0.25% Coomassie blue R-250 dissolved in 45% isopropanol/10% acetic acid. The cellulose membrane was washed thoroughly in 7% acetic acid until it displayed a clear background. After a final rinse with water, the membrane was dried under a heat - 115 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa lamp. Blue spots, representing the protein distribution area corresponding to particular experimental or control conditions, were visually compared (Bramhall et al., 1969; Durham and López Solís, 1979). A diagram of the procedure is shown in Figure 1. Protein precipitation assay using cellulose membranes. After mixing BSA with TA, as above, the Eppendorf tubes were centrifuged during 5 minutes at 5000 rpm. Twenty- L aliquots were taken from the supernatants and placed punctually on a cellulose membrane. The membrane was processed as described in the previous section (Figure 1). In this assay, the equivalence point represents the lowest amount of tannic acid needed to produce full disappearance of the protein from the supernatant. Assays were performed in triplicate. - 116 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa RESULTS HPLC-DAD characterization of TA. The HPLC phenolic profile of the TA extract used in this study is shown in Figure 2. Absorption spectra of the most prominent peaks in the profile showed that with no exception, they correspond to gallotannins, that is, the peak absorption occurs around 276-278 nm and absorption is almost completely attenuated at wavelengths longer than 320 nm. Also, a prominent peak of gallic acid displaying the shortest retention time and a maximum absorption at 270 nm was observed. Differential detection of BSA and TA on cellulose membranes. Figure 3 shows the homogeneous distribution of BSA when placed punctually as 10- to 30- L aliquots of a 1 mg/mL solution on a cellulose membrane and allowed to diffuse. By staining with the protein binding dye Coomassie blue, the protein is clearly revealed as a roughly blue circle whose area is a direct function of the aliquot volume. By contrast, when an aliquot of a similar concentration (1 mg/mL) of TA was placed on the cellulose membrane, Coomassie blue failed to stain the tannin. Poor reactivity of the protein dye with TA was observed even at concentrations as high as 10 mg/mL (Figure 3). Effect of TA upon BSA diffusion on cellulose membranes. As shown before, BSA in aqueous solution diffuses freely when placed punctually on a cellulose membrane. Since tannin and proteins may interact and eventually form insoluble tannin-protein complexes, protein diffusion on cellulose membranes may be affected. In a preliminary assay, we mixed 100 L of 1 mg/ml BSA with 10 L of either distilled water (control condition) (Figure 4A and 4B) or 10 mg/mL TA (Figure 4C and 4D) and then we placed 10- and 30- L aliquots on a cellulose membrane. Under these conditions, that is, when TA and BSA had been mixed in a 1:1 g/ g ratio, TA provoked a dramatic suppression of BSA diffusion (Figure 4C and 4D). In order to quantitative the effect of TA on BSA diffusion, aliquots of a 1 mg/mL BSA solution were mixed with a series of aliquots of a 10 mg/mL TA solution to produce TA plus BSA mixtures in a range of TA/BSA ratios from 0 to 1 g/ g. Aliquots of each mixture were then placed on a cellulose membrane and processed for protein detection. As shown in Figure 5, in this assay TA provoked a decrease in BSA diffusion in a concentration-dependent manner. In addition, in this study a non diffusible protein material became progressively more apparent. Effect of TA upon BSA precipitation. Precipitation of protein-tannin complexes has been frequently used as an objective parameter for tannin-protein interactions. To that end, in this study we observed on cellulose membranes the fraction of protein that remains unprecipitated after mixing a constant amount of BSA with various amounts of TA. Thus, 90 l of 1 mg/mL BSA were mixed with 10l aliquots of twofold serial dilutions containing from 400 to 12.5 g TA (Figure 6). After 5 minutes at room temperature, the tubes were centrifuged at 5000 rpm for 5 min and 20- l aliquots of the corresponding supernatants were placed punctually on a cellulose membrane and allowed to diffuse. - 117 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa After processing the membrane for staining with Coomassie blue we could appreciate that the spot corresponding to 25 g TA was only partially stained whereas the spot corresponding to 50 g TA was undistinguishable from the ones corresponding to zero protein. Accordingly, this assay indicated that 90 g of BSA are partially precipitated with 25 g of TA whereas the equivalence point, that is, full protein precipitation with the lowest amount of tannin, occurs at a ratio of TA to BSA 50:90 ( g/ g). - 118 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa DISCUSSION Tannin-protein interactions have been assayed by using cellulose membranes. Tannic acid (TA), a commercially available tannin extract from Quercus infectoria, and bovine serum albumin (BSA), a widely available protein for research purposes, were used in this study as representative members of both families of molecules. Interactions between TA and BSA were associated primarily to a tannindependent attenuation of protein diffusion on cellulose membranes. By a modification of the procedure, we also assayed tannin-dependent protein precipitation on the cellulose membranes. BSA was distinctively detected by Coomasssie blue R-250, a selective protein-binding dye that fails to bind both TA and cellulose. In the study such, a selectivity was used to detect BSA distribution on the cellulose membrane even in presence of TA. BSA diffuses freely on cellulose membranes, that is, when a microliter drop aliquot of an aqueous solution of BSA is placed punctually on that absorbing membrane, the protein moves radially beyond the area of the original drop together with the aqueous solvent (López Cisternas et al., 2007). From a chromatographic viewpoint, the affinity of BSA for water is much higher than its affinity for the solid cellulose matrix and that is why it becomes distributed all over the wetted area. That is probably a common behaviour of any other highly hydrophilic medium-sized protein. By the same token, interactions of BSA (or any other protein sharing its characteristics) with smaller compounds displaying high affinity to it, as polyfunctional phenolics, would induce the organization of larger and less diffusible supramolecular structures. It would be expected that at low tannin/protein ratios soluble complexes would consist of tannin molecules bound to single protein molecules whereas at high tannin/protein ratios tannin molecules would link two or more protein molecules thus generating a true network of diverse tannin-protein structures (Jöbstl et al., 2004; Simon et al., 2003). Accordingly, diffusion of these various structures on cellulose membranes may well be dependent upon the relative concentrations of tannins and proteins in a mix. In the present study we observed that TA provoked a marked attenuation of BSA diffusion on cellulose membranes and that such anti diffusive effect was dependent upon the TA/BSA ratio. Accordingly, the organization of a variety of supramolecular TABSA structures (complexes) is quite probably underlying the observed changes in protein diffusion. Thus, growing concentrations of TA provoked a progressively higher inhibitory effect on BSA diffusion on cellulose membranes in such a way that when the mass (mg) of TA / mass (mg) of BSA was around 1, protein diffusion became fully restricted (null diffusion). Under this condition, the surface of the originally wetted area on the membrane remained mostly unaffected whereas the area between the bulk of stained protein and the edge of the wetted area was undistinguishable from the membrane background. Considering that Coomassie blue is a selective stain for proteins (Wu and Lu, 2004, Gambuti et al., 2006) and that tannins are powerful protein precipitants (Glories, 1984, De Freitas and Mateus, 2001, Llaudy et al., 2004), in this study we also assayed on cellulose membranes the presence of protein that remains in suspension when a constant amount of BSA is mixed with a growing series of TA-containing - 119 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa aliquots, that is, we assayed the nonprecipitated BSA. Thus, to perform this precipitation assay we just centrifuged the series of TA plus BSA mixtures before placing the corresponding aliquots on the cellulose membrane. In these experiments we observed that as the TA concentration in the TA plus BSA mixtures increased, the presence of BSA in the corresponding supernatants decreased progressively to a point in which no protein reactivity was detected. In this assay, the “equivalence point” represents the minimal amount of TA that is necessary to fully precipitate a given amount of BSA. This parameter is very important because it represents a stoichiometric relationship between the reactants. Accordingly, in our study 90 g of BSA were precipitated by 50 g of TA, which is equivalent to declare either that full precipitation of BSA occurs when about 36 TA molecules (average molecular weight, 1000 Da) interact with every molecule of BSA (66000 Da) or that the insoluble TA-BSA complexes have a supramolecular global formula of TA36BSA (Figure 7). As shown in this study, lower relative concentrations of TA do affect BSA diffusion on cellulose membranes without producing TA-BSA precipitation. Thus, for this pair of reactants there is a range of low relative TA concentrations producing soluble TA-BSA complexes. In other words, at lower concentrations TA interacts with BSA to generate TA-BSA soluble complexes whereas at higher concentrations TA forms insoluble TA-BSA complexes. In our view, both objective phenomena, that is, formation of either soluble or insoluble tannin-protein complexes, should be considered separately when looking for eventual associations with results of subjective sensory testing for astringency (Llaudy et al., 2004; Horne et al., 2002; Dinella et al., 2009; Fontoin et al., 2008). Even so, it has not escaped our attention that TA, as it happens with any tannin, is a complex mixture of (gallotannin) polyphenols quite probably differing from each other in their reactivity towards proteins (Bacon and Rhodes, 1998 and 2000; Baxter et al., 1997; Haslam, 1998). Accordingly, our observations do not discard the possibility that, in addition to quantitative considerations, some particular gallotannins may form soluble complexes with BSA while others may form insoluble complexes with that protein. That differential reactivity may occur naturally in the mouth during sensory assessment of astringency, where complex tannins are mixed with an array of salivary protein families (Levine, 1993; Schenkels et al., 1995). Anyhow, the procedure we are describing now may be readily adapted to evaluate tanninprotein interactions using either particular polyphenol, polyphenol families or tannin extracts together with a particular model protein, protein extract (gelatins) or salivary fluid containing proteins of physiological relevance for astringency perception. Such an array of possibilities may be of great help for the assay of tannin-protein interactions that are part of technological evaluations in food industry, such as the assessments of astringency and phenolic maturity of grapes in wine industry. The method is simple. - 120 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 1. Diffusion and precipitation assays for detection of interactions between tannic acid and bovine serum albumin. Series of aliquots of working solutions of TA were thoroughly mixed with a constant amount of BSA in solution. After a 5 min incubation period, 20- L aliquots of each mixture were placed punctually on a cellulose membrane and allowed to diffuse. The membrane was fixed and stained with Coomassie blue to assess protein distribution (diffusion assay). The rest of the TA plus BSA mixtures of each tube were centrifuged at 5000 rpm x 5 min to produce a supernatant and a sediment. Aliquots were taken from the supernatants and seeded on a cellulose membrane for protein detection as indicated above. In this latter assay, absence of Coomassie blue staining represents full precipitation of TA-BSA complexes (precipitation assay). - 121 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 2. HPLC fractionation of tannic acid. Representative chromatogram of a TA sample dissolved, extracted, fractionated and detected at 275 nm, as indicated under Materials and Methods. Absorption spectrum of each individual peak was compared against those of pure polyphenol standards. With no exception, only gallotannins (GT) and gallic acid (GA) were identified as components of TA. Representative absorption spectra of a gallotannin and gallic acid are shown at the bottom of the figure. - 122 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 3. Selective detection of BSA and TA on cellulose membranes. Aliquots of 10, 20 and 30 L of 1 mg/ml BSA (left to right, upper figure) and 30- L aliquots of a series of solutions containing 1, 2, 3, 5 and 10 mg/ml TA (left to right, lower figure) were placed punctually on separate cellulose membranes, fixed, stained with Coomassie blue and distained as described under Materials and Methods. Note the intense staining of BSA in contrast with the poor reactivity of TA. - 123 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 4. Inhibitory effect of TA on BSA diffusion on cellulose membranes. A 100- L aliquot of 1 mg/ml BSA was thoroughly mixed with 10 L of either distilled water (control condition) or 10 mg/mL TA. Aliquots of 10- and 30- L of both the control mixture (A and B, respectively) and the TA plus BSA mixture (C and D, respectively) were placed punctually on a cellulose membrane and processed for protein staining. Note the homogeneous distribution of BSA all over the roughly circular surface of the membrane that was wetted by the aliquots of the control mixture (A and B). By contrast, in presence of TA, BSA did not diffuse and remained close to the spotting site (C and D). - 124 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 5. Titration of the inhibitory effect of tannic acid on BSA diffusion. Twenty- L aliquots of TA plus BSA mixtures in a range of ratios from 0 to 1 g/ g were placed punctually on a cellulose membrane and after marking the boundaries of the wetted surface with carbon pencil the membrane was processed for protein staining, as described under Materials and Methods. Note that the higher the TA/BSA ratio the lower was BSA diffusion. Note also that with a progressive increase in the TA/BSA ratio a nondiffusible protein fraction, probably insoluble TA-BSA complexes, became increasingly more evident and that the surface of the originally wetted area was mostly unaffected by TA. - 125 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 6. Effect of TA on BSA precipitation. Ninety- L aliquots of 1 mg/mL BSA were mixed with 10- l aliquots of twofold serial dilutions containing from 400 to 12.5 g TA. After incubation for 5 minutes at room temperature, the tubes were centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes and 20- l aliquots of the corresponding supernatants were placed punctually on cellulose disks (water aliquots were placed on blank disks). The cellulose disks were processed for protein staining, as described under Materials and Methods. Note the progressive decrease in the BSA present in the supernatant as the amount of TA in the TA plus BSA mixture increases (white arrows). The equivalence point (black arrow) represents the minimal amount of TA that is necessary to fully precipitate a given amount of BSA. Levels of TA much higher than the one of the equivalence point (4- to 8-fold that of the equivalence point) show the well-known mordant effect of tannins that accounts for the observed binding of Coomassie blue. - 126 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.3.: Interacción tanino-proteína en membranas de celulosa Figure 7. Model of a TA-BSA unitary complex at the equivalence point. Considering an average molecular weight of 1000 Da for TA and 66000 Da for BSA together with a TA/BSA ratio of 0.55 g/ g at the equivalence point, a representative insoluble TA/BSA complex would comprise 36.7 molecules of TA per molecule of BSA. Different models for this supramolecular structure can be drawn. According to data in this study and considering that 583 aminoacids constitute the primary structure of BSA (Hirayama et al., 1990) TA molecules would be bound in average at 15.9-aminoacid intervals. These interactions would break the native tertiary structure of BSA. Because of the abundance of gallic acids in gallotannins, hydrogen bonds between phenol groups would contribute to generate an intramolecular hydrophobic environment comprising TA molecules and parts of the refolded BSA molecule. Because of the aqueous environment, part of the TA molecules would be also exposed on the surface of the TA-BSA complex. These might participate also in intermolecular bridgings with other TA-BSA complexes. - 127 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.4. LA INTERACCIÓN TANINO-PROTEÍNA ESTA MÁS ASOCIADA A LA ASTRINGENCIA QUE LA PRECIPITACIÓN DEL COMPLEJO TANINOPROTEÍNA Artículo enviado para su publicación a: International Journal of Food Science and Technology Manuscript ID: IJFST-2010-05870 18 de Febrero del 2010 - 129 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína INTRODUCTION Astringency is among the most relevant sensory features of some foods, in addition to color, aroma and bitterness (Bacon and Rhodes, 1998). This sensation has been defined as a complex group of sensations involving dryness of the oral surface and tightening and puckering sensations of the mucosa and muscles around the mouth (Lee and Lawless, 1991; Gawel et al., 2000; Dinella et al., 2009). In addition to concentration, proanthocyanidin composition such as polymer size, extent of galloylation and formation of derivatives, affect both bitterness and astringency (Noble, 1994; Vidal et al., 2003; Vidal et al., 2004). Other factors, including the pH, ethanol, sweetness, viscosity and turbidity in saliva-tannin mixtures have also been shown to contribute to astringency perception in wine (Kallithraka et al., 1997; Fisher and Noble, 1994; Smith et al., 1996; Peleg and Noble, 1999; Horne et al., 2002). Red wine astringency has been mostly associated with condensed tannins or proanthocyanidins, particularly flavan-3-ol polymers, which come mainly from grape seeds and skins (Gawel, 1998; PeñaNeira et al., 2000). Other tannins that also contribute to wine astringency and that differ chemically from grape tannins are the hydrolyzable tannins. These tannins come mostly from oak barrels or from other commercial products that are used during wine aging (Matejícek et al., 2005; Cadahía et al., 2001; De Simon et al., 1996; Chatonnet, 1992; Chatonnet et al., 1994). Previous reports have shown that different tannins vary in the intensity of the astringency response they elicit (Bacon and Rhodes, 1998; Baxter et al., 1997; Haslam, 1998). Astringency assessment is performed by a panel of trained tasters whose reports use to involve some degree of subjectiveness (Valentova et al., 2002). Accordingly, the use of complementary chemical analytical methods for estimating astringency has become a common practice. The Gelatin Index, the most popular of these methods, gives an estimate of tannin reactivity towards proteins by measuring the concentration of procyanidins both before and after their precipitation by the addition of an excess of gelatin (Glories, 1984). However, a main drawback of this index is that gelatin, which is produced by partial hydrolysis of collagen from various sources, is a highly heterogeneous protein material whose activity as tannin precipitant may vary markedly among commercial products. For that reason, Llaudy et al. (2004) have recently proposed a new method to assess astringency by using ovalbumin, a pure protein, as a tannin precipitant agent. This method, which estimates precipitation of tannin-protein complexes by measuring the 280 nm absorbance of the corresponding supernatant, is more reproducible than the Gelatin Index and correlates well with sensory assessment. However, considering that both tannins and ovalbumin absorb intensely at 280 nm, differential contribution of either tannin or protein to absorbance cannot be defined. Nevertheless, whatever the nature of the tannin-precipitant protein, both methods are taken as a measure of the magnitude of the interactions between tannins and protein and as a direct reflection of the ability of tannins to elicit an astringent response. Tannin-protein interaction and precipitation have been a main subject of study in the past few years (Bacon and Rhodes, 1998 and 2000; Baxter et al., 1997; Haslam, 1998; Llaudy et al., 2004; De Freitas and Mateus, 2001; Charlton et al., 2002a; Jöbstl et al., 2004). Thus, polyphenol-protein binding have been associated to the - 131 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína involvement of hydrogen bonds and hydrophobic interactions between them (Bacon and Rhodes, 1998; Baxter et al., 1997; Charlton et al., 2002a; Jöbstl et al., 2004; Hagerman and Butler, 1980 and 1981; Hagerman et al., 1998; Simon et al., 2003; Bajec and Pickering, 2008). In addition, Versari et al. (1998) have suggested that at wine pH the positively charged gelatins interact with the negatively charged tannins and only if a critical mass of tannin-protein complexes is reached they may be precipitated. Thus, whichever the binding mechanism may be interaction between tannins and proteins would be previous to precipitation of tannin-protein complexes. To test that hypothesis the experimental design must be able to distinguish between interaction and precipitation. Noncovalent immobilization of proteins on solid supports is a technique fundamental to a number of modern analytical methods in biochemistry and molecular biology (Bramhall et al., 1969; Morcol and Subramanian, 1999). For instance, protein detection and quantification methods using solid matrices involve the fixation of the protein sample by denaturation on a nonreactive cellulose surface and its staining with a dye that binds selectively, stoichiometrically and with high affinity to proteins (López-Cisternas et al., 2007). Tannins do not display some of those features what may be used advantageously to gain insight into protein-tannin interactions. The purpose of this study was to evaluate the relative ability of two enological tannins to interact with a single gelatin and to correlate this with the relative intensity of the astringency elicited by both tannins. Tannin-gelatin interaction was estimated by measuring the relative ability of tannins both to interfere with gelatin diffusion on a cellulose membrane as well as to induce precipitation of the protein. A trained sensory panel assessed astringency. - 132 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína MATERIALS AND METHODS Materials. “Tanin Gallique a l´alcohol”, an alcoholic extract of tannins from the oak gall nut, and “Protanin R-instantáneo”, a 100% instantaneously soluble proanthocyanidic tannin, were purchased from Vinicas Industry Co., Santiago, Chile. “Gélatine Extra Nº1”, a polyvalent gelatin, was purchased from Laffort Oenologie, Bordeaux, France. Tartaric acid, bovine serum albumin (BSA), tannic acid and standards of gallic acid (G-7384), protocatechuic acid (P-5630), protocatechuic aldehyde (E-24859), quercetin (Q-0125), miricetin (M-6760), kaempherol (K-420325), (+)-catechin (C-1251), (-)epicatechin (E-1753) and (-)-epicatechin-3-gallate (E-3893), were purchased from Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. Cellulose membranes (Whatman # 1) were purchased from Whatman Ltd., Maidstone, England. Acetic acid HPLC degree and acetonitrile HPLC degree were purchased from Merck, Darmstadt, Germany. Other pro-analysis solvents were obtained from Oxiquim-Chile. The HPLC system consisted of a photodiode-array detector Model G1315B, a pump Model Quat G1311A, an autosampler Model ALS G1329A (Agilent Technologies 1200) and a reversed phase Nova Pack C18 column (4 m, 3.9 mm di x 300 mm) (Waters Corporation, Milford, M.A. USA). Absorbances were measured using an UNICAM UV–VIS spectrophotometer Model Helios-Gamma 2000. Sensory Evaluation. Both enological tannin extracts were evaluated sensorially by a panel of 13 judges trained to rate intensity of astringency. A paired comparison test was used. Results from duplicate assessments were expressed in percentage and tested by chi-square analysis. Chemical characterization of tannins. Stock solutions (3 g/L) of both enological tannins were prepared in hydroalcoholic solution (10% v/v ethanol and 0.5% w/v tartaric acid). Total phenol content was determined by UV-absorptiometry at 280 nm using gallic acid as standard (Glories, 1984). Total tannin content was measured by the method of Ribéreau-Gayon and Stonestreet (1966). The gelatin index of tannins was measured according to the method of Glories using 50 mL of tannin stock solutions and 5 mL of 70 g/L gelatin (Glories, 1984). For HPLC–DAD analysis, tannins were extracted with ethyl ether (3 x 20 mL) and ethyl acetate (3 x 20 mL). The total extracts were evaporated to dryness at 30 ºC, re-dissolved in 2 mL of 50% (v/v) methanol/water and membrane-filtered (0.45 µm pore size). Aliquots of 100 µL were subjected to reversed-phase fractionations at 20 oC using a Nova Pack C18 column. A photodiode-array detector was set at 280 nm. Two mobile phases were used: A, water/acetic acid (98:2 v/v) and B, water/acetonitrile/acetic acid (78:20:2 v/v/v). A two-step gradient was carried out at a constant flow rate of 1.0 mL/min: 0-55 min, 100-20% A and 55-70 min, 20-10% A. Equilibration times of 15 min were allowed between injections (Obreque-Slier et al., 2009). Each major peak in the HPLC chromatograms of the tannin extracts was characterized both by its retention time and absorption spectrum (from 210 to 360 nm). Identification of specific compounds was achieved by comparison against pure standards. Quantification of specific components of the tannin extracts was - 133 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína performed by using external standards. Calibration curves were obtained by using gallic acid (gallotannins) and (+)-catechin (proanthocyanidins). All the qualitative and quantitative analyses of phenolic composition of tannins were performed in triplicate. Assays of tannin-gelatin interaction. In a final volume of 1000 µL, a constant amount of tannin (750 g) was mixed thoroughly with one of a series of gelatin dilutions (range from 250 to 0 µg) and allowed to stand for 5 minutes at room temperature. After vortex mixing again an aliquot of 15 L taken from each of the tubes was spotted punctually on a cellulose membrane. The membrane was then dried under a light-lamp, fixed for 5 minutes in 5% trichloroacetic acid, rinsed for 5 minutes in 80% ethanol, stained for protein during 20 minutes in 0.5% Coomassie blue R-250 dissolved in 45% isopropanol/10% acetic acid and washed in 7% acetic acid until clear background. Following a final wash in distilled water the membrane was dried again under a light-lamp (Figure 1). In this diffusion assay on cellulose membranes, a blue-stained circular spot represents the diffusion area of the protein present in the sample. Blue diffusion areas observed at varying gelatin/tannin ratios were visually compared with gelatin diffusion in the absence of tannin (control). In a variant assay, the Eppendorf tubes containing the tannin/gelatin mixtures were centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes and, after visual inspection of the sediments, 15- L aliquots were taken from each supernatant and were orderly spotted on a cellulose membrane. The membrane was processed for protein detection as described above. In this assay (precipitation assay), a complete loss of protein staining represents the equivalence point of gelatin precipitation (Figure 1). Assays were performed in duplicate by each of two independent experienced operators. - 134 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína RESULTS Sensory Analysis. The proanthocyanidin and hydrolyzable tannins were assayed for astringency by means of a paired comparison test conducted by a trained sensory panel. In two successive assessments, 84% and 76% of the panelists reported that the hydrolyzable tannin was more astringent than the proanthocyanidin tannin (Chi squared, p < 0.05). Characterization of enological commercial tannins. Table 1 shows a physicochemical characterization of both enological tannins on a weight basis, the content of total phenols in the hydrolyzable tannin was about four-fold the one in the proanthocyanidin tannin whereas the concentration of total tannins in the proanthocyanidin tannin was 2.6 times the one in the hydrolyzable tannin. The hydrolyzable tannin presented a significantly higher gelatin index as compared to the proanthocyanidin tannin. As shown in representative HPLC-DAD chromatograms (Figure 2), both tannins presented gallic and protocatechuic acids. In the proanthocyanidic tannin, we also observed protocatechuic aldehyde, flavonols and proanthocyanidins. Gallotannins were identified only in the hydrolyzable tannin. Table 1 summarizes the relative contributions of a number of compounds identified in each of both enological tannins. No significant differences (Tukey test, p > 0.05) were observed in the content of protocatechuic acid and protocatechuic aldehyde of both tannins. By contrast, both tannins showed significant differences (p < 0.05) in the content of most of the individual phenolic compounds identified by HPLC-DAD. As expected, the hydrolyzable tannin showed a much higher content of gallotannins and gallic acid. As also expected, the proanthocyanidin tannin displayed a higher content of proanthocyanidins and flavonols. Diffusion of gelatin and tannins on cellulose membranes. Stock solutions of both tannins (1.5 mg/mL) and gelatin (4.4 mg/mL) were serially diluted with either hydroalcoholic solution (tannins) or distilled water (gelatin). Each one of the seried dilutions of gelatin and tannins were punctually spotted on cellulose membranes and processed for detecting protein with the protein-binding dye Coomassie blue R-250. As shown in Figure 3A, gelatin diffused radially and homogeneously from the spotting site on the cellulose membrane. Distribution of gelatin was clearly identified at the whole range of concentrations in the assay. At higher concentrations of gelatin the protein was distributed all over the circle moistened by the sample. At lower concentration, gelatin was partly retained by its interaction with the cellulose matrix (Figure 3A). By contrast, most of the seried dilutions of both tannins remained undetected against the cellulose background, excepting a faint staining of the sample of stock solution of the hydrolyzable tannin (Figures 3B and 3C). Differential interaction of tannins with a single gelatin. Interaction of tannin with protein may result in soluble and insoluble tannin-protein complexes. This might be evidenced either by a decreased diffusion of the protein on the cellulose membrane, by the appearance of precipitates - 135 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína following the centrifugation of the mix or by the disappearance of the protein from the corresponding supernatant. Under the experimental conditions in this study, gelatin solutions in the range 250 to 0.0 g were easily detected and found to diffuse homogeneously on the cellulose membrane (Figure 4A). When fix amounts of the hydrolyzable or proanthocyanidin tannins (750 g) were combined with serially diluted solutions of gelatin over the range from 250 to 0.0 g followed by centrifugation and spotting of the supernatants, protein diffusion on the cellulose membrane was found to be markedly reduced over the whole series of protein concentrations (Figures 4B and 4C). At variance of the hydrolyzable tannin, the proanthocyanidin tannin not only diminished the protein diffusion but it also provoked the whole disappearance of the protein from the corresponding supernatant (“equivalence point”) (Figure 4C). That observation suggested that the proanthocyanidin tannin is also a precipitant of the protein. Altogether, these studies indicate that under the present experimental conditions both tannins interact with gelatin but that only the interaction of proanthocyanidin tannin with gelatin results in precipitation of the complexes. Time-dependency of the interaction between tannins and gelatin. So far most of the assays for interaction between tannins and gelatin had been performed at 10 minutes following their mix. When this assay was repeated at 48 hours following the mix of tannins and gelatin we did not observe any major difference. Likewise, precipitation of tannin-gelatin complexes as observed either indirectly on the cellulose membranes (Figures 4B and 5B) or directly in the tubes after centrifugation showed no major difference (Figures 4C and 5C) excepting slight displacements in the equivalence point toward a lower amount of gelatin (Figure 4C). - 136 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína DISCUSSION Enological tannins are used in wine industry to ensure sensory balance, sensory complexity, color stability and antioxidant protection (Obradovic et al., 2005). However, the influence of tannins on the properties of wine will depend on their chemical nature (e.g. hydrolyzable or proanthocyanidin). Tannins as a whole have been closely associated to the sensation of astringency. Wine astringency is usually evaluated using trained panels of tasters (Valentova et al., 2002). On the other hand, the ability of tannins to produce astringency has been usually associated to their ability to precipitate proteins (Jöbstl et al., 2004). Thus, the Gelatin Index, a method based on measuring the relative fraction of unprecipitated tannins from an aliquot of wine mixed with an excess of a commercial gelatin, has become a sort of Golden Standard for astringency. Among enologists, however, the utility of this index for assessing astringency has become highly controversial mostly because of its low reproducibility and frequent disagreement with trained sensory panel score (Llaudy et al., 2004). Probably, the lability of hydrolyzable tannins and the formation of colored products derived from the Maillard reaction taking place during the incubation of the sample at 100 ºC in a very acid medium seem to explain those inconsistencies. A recent effort to improve reproducibility and the acceptance of this type of biochemical assays is based on the replacement of gelatin by ovalbumin as the precipitant protein (Llaudy et al., 2004). This method also analyses a correlation between precipitation of tannin-protein complexes and astringency. In the present study we have investigated the relative abilities of two enological tannins to precipitate a single enological gelatin. Both tannins were shown to differ markedly in their chemical nature (HPLCDAD chromatography and spectroscopic analysis) as well as in the astringency they produce (sensory panel assessment). Surprisingly, we found that the tannin that was more astringent was also a far poorer protein precipitant than the less astringent tannin. However, we also found that the more astringent tannin interacts with the commercial gelatin without producing its precipitation. Thus, the results of the present study support the hypothesis that astringency correlates better with gelatintannin interaction than with gelatin-tannin precipitation. To perform this study we took advantage of a procedure based on protein immobilization on solid cellulose membranes followed by protein staining with Coomassie blue under conditions in which tannins remain mostly undetected. At variance with conventional assays, our study was designed to observe not only precipitation of protein-tannin complexes but also to observe interaction between protein and tannins resulting in soluble tanninprotein complexes. When serially decreasing amounts of single gelatin were mixed with a constant amount of a tannin extract and after a centrifugation step aliquots of the supernatants were orderly placed on a cellulose membrane we observed a progressive disappearance of the protein because of precipitation of tannin-gelatin complexes. In this precipitation assay, the equivalence point is the experimental condition resulting in full disappearance of the protein from the supernatant and represents an objective parameter for comparison between tannin samples. In addition, the outcome of this assay can be contrasted with the direct observation of the sediments in the centrifuge tubes. When - 137 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína both enological tannins under consideration in the present study were compared as to their relative abilities to produce protein precipitation, either by the precipitation assay on cellulose membranes or by direct inspection of the sediments in the centrifuge tubes, a striking difference became evident. In effect, over the whole range of experimental concentrations of the gelatin, the hydrolyzable tannin was fully ineffective in forming insoluble complexes whereas the proanthocyanidin tannin was able to produce the full precipitation of the protein. A first major conclusion of this comparison was that the ability of the hydrolyzable tannin to elicit astringency cannot be properly represented by its ability to form insoluble tannin-gelatin complexes. In this study we also observed the mode of diffusion of the gelatin in solution when spotted on a cellulose membrane. In effect, this protein in solution diffuses freely, radially and homogeneously after being placed punctually on a cellulose membrane. That mode of diffusion was markedly affected when the protein was mixed with tannins. In this assay, even the lowest hydrolyzable tannin/gelatin and proanthocyanidin tannin/gelatin ratios were found to be associated to a marked restriction of gelatin diffusion on the cellulose membrane. Such decreased gelatin diffusions are indicative of interactions between tannins and gelatin. Thus, the more astringent hydrolyzable tannin affected gelatin diffusion without provoking its precipitation at all the experimental conditions in the study. On the other hand, for the series of gelatin concentrations mixed with a given amount of the proanthocyanidin tannin, we could compare the equivalence point with the relative amount of tannin affecting gelatin diffusion. In this case, the equivalence point was obtained at a proanthocyanidin tannin/gelatin ratio much lower than those found to affect gelatin diffusion on the cellulose membrane, that is, we observed a range of proanthocyanidin tannin/gelatin ratios in which the gelatin-tannin complexes are soluble in nature whereas higher proanthocyanidin tannin/gelatin ratios induce the formation of insoluble tannin-gelatin precipitates. It remains to be seen whether those insoluble proanthocyanidin-gelatin complexes are simple aggregates of soluble proanthocyanidin tannin-gelatin complexes or rather the insoluble complexes are formed with participation of particular components of the tannin extract once they reach a critical concentration. Finally, our study strongly contradicts the wide use of the conventional Gelatin Index. To further substantiate this view and considering that the Gelatin Index comprises a 3-day incubation period of the “reactants”, we additionally controlled our precipitation assay on cellulose membranes by incubating the mixtures of gelatin with each of the experimental tannins for either 10 minutes or 2 days. In these studies, the observed patterns of gelatin-tannin interactions, with or without precipitation of the corresponding complexes, were mostly unaffected by the time of incubation. Thus, an expedite and objective evaluation of interactions of gelatin and tannins or tannin-containing foods, whether or not gelatintannin complexes precipitate, may be more informative about the subjective sensation of astringency that foods may elicit. - 138 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Table 1. Chemical composition of two enological tannins Hydrolyzable tannin Phenols total a Tannins total b Gelatin index Gallic Acid d Gallotannin d Protocatechuic acid d Protocatechuic aldehyde d Flavonols d Proanthocyanidins d Procyanidins Gallated c Proanthocyanidin tannin 260.1 ± 23.7 ± 36.5 ± 0.2 ± 0.0 ± 0.0 ± 0.0 ± 1.3 ± 26.0 ± 0.5 ± 14.0 5.6 3.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 1.8 0.2 * * * * * * * * 1036.8 ± 9.0 ± 67.2 ± 3.3 ± 177.8 ± 0.0 ± 0.0 ± 0.0 ± 0.0 ± 0.0 ± 9.3 2.9 2.3 0.4 80.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Figures represent mean ± standard deviation (triplicates). Asterisks indicate significant difference between both enological tannins (Tukey test, p < 0.05). a b c d mg equivalent gallic acid/g tannin mg equivalent procyanidin/g tannin expressed as percentage mg/g enological tannin (HPLC-DAD data) - 139 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Figure 1. Assay for detection of tannin-gelatin interactions - 140 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Figure 2. HPLC-DAD chromatograms of two enological tannins and representative UV spectra of most of the corresponding identified components (procyanidins or gallotannins). - 141 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Figure 3. Differential detection of gelatin and enological tannins by a protein-binding dye on cellulose membranes. Fifteen- l aliquots of either gelatine in solution (Figure 3A), hydrolysable tannin (Figure 3B) or proanthocyanidin tannin (Figure 3C) were spotted and processed. Concentrations of gelatin (top) and tannins (bottom) are indicated. - 142 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Figure 4. Interaction between gelatin and tannins. Gelatin in solution (range 0-250 g from right to left) (Figure 4A) was mixed with 750 g of either hydrolysable tannin (Figure 4B) or proanthocyanidin (Figure 4C) in final 1-mL and incubated for 10 minutes. After centrifugation only proanthocyanidin tannin-gelatin precipitates were observed (Eppendorf tubes in Figure 4C). Fifteenl aliquots of the supernatants from the whole series of tubes were spotted on cellulose membranes and allowed to diffuse. Note that the hydrolysable tannin restricted markedly the free diffusion of gelatine (Figure 4B) whereas the proanthocyanidin tannin both affected protein diffusion (low tannin/protein ratio) and provoked then its full disappearance from the supernatant (precipitation) (Figure 4C). - 143 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.4.: Interacción versus precipitación tanino-proteína Figure 5. Interaction between gelatin and tannins at later times. Both precipitations of tannin-gelatin complexes as well as gelatin diffusion on cellulose membranes shown in the experiment of Figure 4 were re-evaluated after a 48-hours period of incubation. Note that at this time the results are mostly undistinguishable from those observed at short times of incubation. - 144 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.5. AMPLIFICACIÓN DE LAS INTERACCIONES TANINO-PROTEÍNA Y PERCEPCIÓN DE ASTRINGENCIA POR ETANOL Artículo publicado en: Journal of Agricultural and Food Chemistry Manuscript DOI: 10.1021/jf903659t - 145 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 147 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 148 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 149 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 150 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 151 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 152 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.5.: Efecto del etanol sobre la astringencia - 153 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO II: Interacción tanino-proteína - SUBCAPÍTULO II.6. EFECTO DEL PH SOBRE LA INTERACCIÓN TANINO-PROTEINA Y LA PERCEPCIÓN DE ASTRINGENCIA Artículo enviado para su publicación a: Chemical Senses Manuscript ID: CS-10-000030 22 de Febrero del 2010 - 155 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia INTRODUCTION Phenolic compounds constitute one of the most important quality parameters of wines and other foods since they contribute to a variety of organoleptic characteristics, such as color, aroma, bitterness and astringency (Monagas et al., 2005). Astringency, a sensation that is described as a puckering, rough, or drying mouth-feel, has been associated with interactions between some phenolic compounds (tannins) and salivary proteins (Bacon and Rhodes, 2000). Tannins responsible for wine astringency consist mostly of flavan-3-ol polymers that are commonly referred to as proanthocyanidins or condensed tannins (De Freitas and Mateus, 2001; Gawel, 1998). These compounds are extracted from grape skins and seeds during various phases of wine-making (Ribéreau-Gayon, 1972a; Obreque-Slier et al., 2009). Although astringency is considered to be a tactile sensation rather than a taste (Breslin et al., 1993), its perception is markedly affected when overlapped with taste stimuli (Kallithraka et al., 1997). A number of physical and chemical properties have been involved in the complex mechanisms of astringency perception. In addition to the concentration and composition of proanthocyanidins (Vidal et al., 2004), both organic and inorganic acids (Hartwig and McDaniel, 1995), ethanol (Fischer and Noble, 1994; DeMiglio et al., 2002), sweetness (Smith et al., 1996), viscosity (Peleg and Noble, 1999), some minerals (Lawless et al., 2004) and pH (Kallithraka et al., 1997; Sowalsky and Noble, 1998; Fischer and Noble, 1994; Lawless et al., 1996) have also been shown to contribute to astringency perception. A number of authors have studied the effect of pH on astringency perception. Fisher and Noble (1994), observed that dealcoholized white wine at pH 3.0 was perceived more astringent than the same wine at pH 3.6. Similar results were obtained for red wines across a series of pH between 2.2 and 2.8 (DeMiglio et al., 2002) and by using different acids (Kallithraka et al., 1997). Guinard et al. (1986) did not observe such a relationship between pH and astringency in high-phenol red wines subjected to progressive acidification. However, these latter authors suggested that high levels of astringency in red wines may have resulted in precipitation of salivary proteins at the start of the assay thus preventing a change in astringency perception by the addition of acids. Also, astringency perception produced by aqueous solutions of phenolic compounds (i.e. grape seed tannins, tannic acid, catechin, gallic acid) and by a number of model solutions have been shown to be affected by a decrease in pH (Kallithraka et al., 1997; Guinard et al., 1986; Peleg et al., 1998). From a molecular perspective, the increased intensity of perceived astringency at lower pH has been temptatively related to an increase in undissociated phenol groups, which may form hydrogen bonds with salivary proteins (Sowalsky and Noble, 1998; Guinard et al., 1986). On the other hand, Peleg et al., (1998) reported that astringency of alums is decreased by the addition of acids and invoked that because of chelation by organic acids the interaction of aluminium ions with salivary proteins is reduced. Anyhow, most of these studies oriented to assess the impact of pH on astringency have been restricted to or primarily based on sensory evaluation by a group of wine taster experts (Valentova et al., 2002). Significant efforts have been made to find more objective parameters to describe or to measure astringency (Llaudy et al., 2004). - 157 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia The present study was aimed at conducting a parallel assessment of the effect of pH on tannin-induced astringency and tannin-salivary protein interactions. A trained sensory panel evaluated astringency perception. Tannin-salivary protein interactions were assessed under in vitro conditions reflecting both the degree of dilution experienced by saliva during wine tasting and the expected pH in the wine-saliva mixture in mouth (Lagerlöf and Dawes, 1984; Weatherell et al., 1992).We examined the effect of two different enological tannins, a proanthocyanidin tannin and a hydrolyzable tannin, on two physicochemical properties of the salivary protein, namely, the mode of diffusion on cellulose membranes and precipitation (López-Cisternas et al., 2007). - 158 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia MATERIALS AND METHODS Materials. An enological hydrolyzable tannin (Tanin Gallique a l´alcohol) and a proanthocyanidin tannin (Protanin R-instantáneo) were obtained as kind gifts from Vinicas Industry Co., Santiago, Chile. Cellulose membranes (Whatman # 1) were purchased from Whatman Ltd., Maidstone, England. Tartaric acid, gallic acid, (+)-catechin and Coomassie blue were from Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. HPLC grade acetic acid and acetonitrile were purchased from Merck, Darmstadt, Germany. Pro-analysis solvents were obtained from Oxiquim-Chile. Tannin extract solutions. Both the hydrolyzable tannin and the proanthocyanidin tannin were dissolved (6 mg/mL) under agitation for 20 min at 20 ºC in 0.5% w/v of tartaric acid. Each tannin solution was distributed in halves and the pH of each subfraction was adjusted with sodium hydroxide either to pH 3.5 or pH 7.0. Just prior to the experiments, concentrations of all the four solutions of tannins were normalized by dilution with distilled water to absorbance at 280 nm of 0.40. Concentrations of the resulting solutions corresponded to 1 mg/mL (hydrolyzable tannin) or 4.2 mg/mL (proanthocyanidin tannin). Sensory evaluation. All the four tannin solutions were rated for astringency by a 13-member trained sensory panel. Assessment of hydrolyzable tannins was independent from that of proanthocyanidin tannins. Tannin solutions (15 mL) at 20ºC (± 0.1ºC) in black cups were presented at random to the panel members, who were asked to describe the intensity of the perceived astringency for each sample on a 0-15 score scale. Each sample was evaluated twice. Solutions of 0.5% w/v of tartaric acid both at pH 3.5 and pH 7.0 served as controls. Pectin dissolved in distilled water (1 g/L) was used for mouth rinsing between consecutive samples. Characterization of tannin extracts. Total phenol content was determined by UV-absorptiometry at 280 nm (Ribéreau-Gayon, 1970) using gallic acid as standard. Characterization of phenolic compounds was performed using an Agilent 1200 HPLC system (quaternary pump model Quat G1311A, autosampler model ALS G1329A and photodiode-array detector model G1315B) fitted with a reversed phase Nova Pack C18 column (4 m, 3.9 mm di x 300 mm) (Waters Corporation, Milford, M.A. USA). Briefly, tannin extract solutions (50 mL) were extracted successively with ethyl ether (3 x 20 mL) and ethyl acetate (3 x 20 mL). Total extracts were evaporated to dryness at 30 ºC, re-dissolved in 2 mL of 50% (v/v) methanol/water and membrane-filtered (0.45 µm pore size). Aliquots of 100 µL of the extracts were reversed-phase fractionated at 20oC with detection at 280 nm. Two mobile phases were used: A, water/acetic acid (98:2 v/v) and B, water/acetonitrile/acetic acid (78:20:2 v/v/v). A two-step gradient was carried out at a constant flow rate of 1.0 ml per min: 0-55 min, 100-20% A and 55-70 min, 20-10% A. Equilibration times of 15 min were allowed between injections (Obreque-Slier et al., 2009). For reference, a few major peaks in the HPLC chromatograms of the tannin extracts were characterized - 159 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia both by retention time and absorption spectrum (from 210 to 360 nm). Identification of specific compounds was achieved by comparison against pure standards. Calibration curves were constructed by using gallic acid (gallotannins) and (+)-catechin (proanthocyanidins). All the qualitative and quantitative analyses of phenolic composition of tannins were performed in triplicate. Whole saliva collection. A single 31-year-old healthy male with no evidence of illness in the past 60 days and with values of serum biochemical profile, hemogram and urine analysis within reference ranges, was a permanent voluntary saliva donor throughout the study. A conventional procedure for collection of saliva with no use of sialagogues (unstimulated whole saliva) was carried out under standardized conditions always between 9.00 and 10.00 AM and just before each experiment (Nordbö et al., 1984). Briefly, saliva was accumulated in mouth during 1 minute and then expectorated into a sterile glass container. Saliva collected in three successive procedures was pooled and maintained in ice during the experiment. Salivary protein-tannin complexation. A.- Diffusion assay. One-hundred-microliters of a fresh sample of whole saliva were mixed with 1500- L aliquots of pH 3.5 and pH 7.0 solutions of either proanthocyanidin (PaT) or hydrolyzable tannin (HT). Saliva mixed with either pH 3.5 water or pH 7.0 water in a ratio of 1:15 served as controls. After incubation for 5 minutes at room temperature, 15- l aliquots of the mixtures were placed punctually on a cellulose membrane and allowed to diffuse. The dry membrane was fixed in 5% trichloroacetic acid, rinsed in 80% ethanol and stained for protein with Coomassie blue for 20 minutes, destained with several rinses of 7% acetic acid and dried under a heat lamp (López-Cisternas et al., 2007). Both diffusion area and stain intensity of the protein spots were semi-qualitative estimates for protein-tannin interaction. B.- Precipitation assay. The rest of the whole saliva-tannin extract mixtures of the diffusion assay were centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes in a Sorvall microcentrifuge. Fifteen- L aliquots of each supernatant were placed punctually on a cellulose membrane, allowed to diffuse and processed for protein staining, as indicated above. In this latter assay, reduced protein staining was taken as indicative of protein precipitation. This observation was complemented by a direct visual inspection of the centrifuge tubes (Figure 1). - 160 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia RESULTS Characterization of enological tannins. Figure 2 shows representative HPLC chromatograms of extracts of the proanthocyanidin and hydrolyzable tannins used in the study. On a weight basis, this fractionation showed marked composition differences between both enological tannins. Thus, gallotannins were identified only in the hydrolyzable tannin (43.2 mg/g enological tannin) whereas proanthocyanidins were present only in the proanthocyanidinic tannin (28.0 mg/g enological tannin). Gallic acid was far more abundant in the hydrolyzable tannin (1.4 mg/g enological tannin) than in the proanthocyanidin tannin (0.1 mg/g enological tannin). Sensory analysis. Proanthocyanidinin tannin and hydrolyzable tannin extracts, each of them at pH 3.5 and 7.0, were assayed for astringency by using a descriptive test in two independent successive sessions. As shown in Table 1, both pH 3.5 tannin extracts were recognized by the trained sensory panelists as being significantly more astringent compared to the corresponding pH 7.0 tannin extracts (Chi squared, p < 0.05). Diffusion of salivary protein on cellulose membranes. When an aliquot of whole saliva is spotted onto a cellulose membrane, radial diffusion of the salivary fluid participates in a chromatographic fractionation of the protein component of saliva, thus producing a biphasic mode of diffusion. In effect, once diffusion has ended, a protein-binding dye shows an intense blue-stained roughly circular area close to the spotting site (non-diffusible fraction of salivary protein) which becomes surrounded by a weaker blue-stained outer band (diffusible fraction of salivary protein) (Figure 3). Aiming to analyze whether tannin solutions at pH 3.5 and 7.0 affected diffusion of salivary proteins on the cellulose membranes we firstly examined any eventual effect of the corresponding solvents on that parameter. To that end, saliva was diluted 1:15 volume ratio with either pH 3.5 water or pH 7.0 water (6.25 % v/v in saliva). Dilution of saliva with pH 7.0 water did result in no major effect upon the biphasic mode of salivary protein diffusion on cellulose membranes, excepting the expected decrease in the intensity of protein staining (Figure 4A). By contrast, dilution of saliva with pH 3.5 water produced a significant anti-diffusive effect on the diffusible salivary protein fraction together with an also significant condensing effect of the non-diffusible salivary protein fraction (Figure 4B). pH-Dependence of the effect of two enological tannins upon salivary protein diffusion on cellulose membranes. Considering the different effect of diluting saliva with pH 3.5 water and 7.0 water on the biphasic mode of diffusion of the salivary protein we then analyzed the effect of mixing saliva with tannin solutions at either pH 3.5 or pH 7.0. Mixing of whole saliva with an aqueous solution of the proanthocyanidin tannin at pH 7.0 in a 1:15 volume ratio followed by spotting of an aliquot of the mixture onto a cellulose membrane resulted in a typical biphasic mode of diffusion, that is, a diffusible protein fraction and a more intensely stained non-diffusible protein fraction (Figure 5A). By contrast, - 161 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia mixing of an aliquot of whole saliva with an aqueous solution of the proanthocyanidin tannin at pH 3.5 in a 1:15 volume ratio produced a dramatic aggregation of the non-diffusible salivary component and a marked decrease in the diffusible protein component (Figure 5B). Likewise, mixing saliva with an aqueous solution of hydrolyzable tannin at pH 7.0 in the same 1:15 volume ratio did not affect the biphasic mode of salivary protein diffusion whereas mixing saliva with an aqueous solution of the same hydrolyzable tannin at pH 3.5 resulted in a marked aggregation of the non-diffusible salivary protein fraction together with a complete disappearance of the diffusible salivary protein fraction (Figures 5C and 5D). pH-Dependence of the effect of two enological tannins upon salivary protein precipitation. Interactions between tannins and salivary proteins result in the formation of soluble and insoluble complexes that may underlie the above-described tannin-induced alterations in the mode of diffusion of the salivary protein on cellulose membranes. In order to further substantiate and extend this observation, reaction tubes containing saliva-tannin mixtures in a 1:15 volume ratio were subjected to centrifugation experiments aimed at simultaneously detecting both salivary protein in the supernatants (protein-dye assay on cellulose membranes) and the eventual occurrence of tanninsalivary protein precipitates (direct visual inspection of the sediments). Simple dilution of 100 L of whole saliva with 1500 L of water at pH 7 followed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes produced a supernatant whose assessment on a cellulose membrane showed a readily visible and mostly monophasically distributed blue-stained protein material (Fi gure 6A). Under these conditions a minor, whitish, cell-rich and mucinous sediment could be also observed (unshown). When the procedure was performed by diluting saliva with water at pH 3.5, the supernatant was also markedly positive for protein but diffusion of the salivary protein component on the cellulose membrane was significantly reduced (Figure 6B). No differences could be appreciated in the corresponding sediment (unshown). By contrast, mixing whole saliva with an aqueous solution of the proanthocyanidin tannin at pH 7.0 in a 1:15 volume ratio followed by centrifugation produced a supernatant displaying an intense positive reaction for protein on the cellulose membrane (Figure 7A) together with a clearly visible dark precipitate comprising insoluble proanthocyanidin-salivary protein complexes (Figure 7C). When whole saliva was mixed with an aqueous solution of proanthocyanidin tannins at pH 3.5 and processed as before, the supernatant showed a weak reaction when probed for protein on the cellulose membrane (Figure 7B). Under these conditions, a large dark sediment of insoluble proanthocyanidin-salivary protein complexes was observed (Figure 7D). In parallel assays, whole saliva was mixed with aqueous solutions of the hydrolyzable tannin both at pH 7.0 and pH 3.5. At pH 7.0 the supernatant was clearly positive for protein (Figure 7E) whereas at pH 3.5 the absence of protein reactivity was indicative of its complete precipitation as hydrolyzable tanninsalivary protein complexes (Figure 7F). In effect, a somewhat bigger and darker grey precipitate was observed at pH 3.5 compared with the one observed at pH 7.0 (Figures 7G and 7H). Altogether, these observations suggest that precipitation occurring after interaction of both hydrolyzable and - 162 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia proanthocyanidinic tannins with the protein fraction of saliva is also greatly enhanced at pH 3.5 compared to 7.0. - 163 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia DISCUSSION Saliva is the first physical contact of polyphenols with a mouth structure just before astringency is perceived. Two highly diverse families of salivary proteins, namely, histidine-rich and proline-rich proteins, have been recurrently mentioned in the past few years as part of a frontline for polyphenol neutralization in the upper part of the gastrointestinal tract (Lu and Bennick, 1998). Interaction of other salivary proteins with polyphenols has not been discarded (Nautaro et al., 1999). In addition, all of those interactions would underlie astringency perception. As a sort of corollary to this statement, local conditions in the mouth that may affect polyphenol-tannin interactions during degustation, such as pH, ethanol, sugars and polysaccharides, would play a major influence on astringency perception (Kallithraka et al., 1997; Vidal et al., 2004; Hartwig and McDaniel, 1995; Sowalsky and Noble, 1998; Fischer and Noble, 1994; DeMiglio et al., 2002; Smith et al., 1996; Peleg and Noble, 1999; Lawless et al., 2004; Lawless et al., 1996; Guinard et al., 1986; Peleg et al., 1998). In the present study we assessed the effect of pH on the ability of two enological tannins to interact in vitro with salivary proteins as well as on the ability of a trained sensory panel to score the astringency those tannins provoke. We used two independent phenomena as indicative of interaction between tannins and the protein fraction of saliva, namely, the restrictive effect of tannins on protein diffusion on cellulose membranes and salivary protein precipitation (López-Cisternas et al., 2007). In this study, we used normalized solutions of a representative hydrolyzable tannin and a representative proanthocyanidin tannin, both of which were firstly characterized by HPLC chromatography and spectral analysis (Obreque-Slier et al., 2009). Tannin concentrations in these experiments are part of the range of concentrations that can be assessed for astringency perception by a trained panel. Also, those concentrations are usually in the range of those obtained during the preparation of tannin extracts from grape seeds and skins (Canals et al., 2005; Pérez-Magariño and González-San José, 2006). Another distinctive characteristic of our experimental design, which in our view is essential for a proper contrast between the in vitro and in vivo observations, was the assay of salivary protein–tannin interaction by mixing saliva with tannin solutions in a 1:15 volume ratio. Such a ratio reproduces the degree of saliva dilution occurring during a wine degustation. In that circumstance, around 15 mL of the beverage become thoroughly mixed with approximately 1 ml of whole saliva in the mouth of the panelist (Lagerlöf and Dawes, 1984; Weatherell et al., 1992). Under both considerations, in this study a trained sensory panel reported that both the proanthocyanidin tannin and the hydrolyzable tannin were perceived as clearly more astringent at pH 3.5 compared with pH 7.0. A transition between those pHs may result in significant differences both in the degree of dissociation of carboxyl groups of aspartic acid and glutamic acid side chains and in the imidazole-imidazolium ring of histidine residues of salivary proteins as well as in the degree of dissociation of the carboxyl groups of complex polyphenols, such as tannins containing gallic acid or gallate residues (Monagas et al., 2005). Thus, significant pH-dependent changes in the electrical charge or in the structure of hydrogen bond forming sites of those potentially interacting - 164 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia molecules may explain marked changes in the ability of tannins and salivary proteins to interact with each other and thence in astringency perception. In the present study we investigated the ability of two different enological tannins to interact with salivary proteins at the “physiological” pH 7 and at the “enological” pH 3.5. To this aim, we assessed whether two enological tannins affected in a pH-dependent fashion the mode of diffusion of salivary proteins on a cellulose membrane and, in a more conventional complementary assay, whether those tannin extracts affected also in a pH-dependent fashion the solubility of the salivary protein fraction. Control conditions of these experiments considered a conventional 1:15 volume ratio of saliva with either pH 3.5 water or pH 7.0 water, as corresponding. Both analytical approaches showed unequivocally a significant reactivity between the aqueous extracts of tannins and the salivary protein fraction, that is, a tannin-dependent increased aggregation of the non-diffusible protein fraction (and a decrease in the diffusible protein fraction) on an absorbing cellulose membrane and a tannin-induced precipitation of salivary protein. All those effects were clearly exacerbated at pH 3.5 on the basis of several objective indicators. Thus, upon mixing saliva with tannins at pH 3.5 diffusion of the diffusible salivary protein was markedly restricted, salivary protein mostly disappeared from the supernatants obtained after centrifugation of tannin/saliva mixtures and the corresponding sediments of tannin/salivary protein complexes were bulkier than those observed by mixing tannins with saliva at pH 7.0. All these exacerbating effects of pH 3.5 were observed regardless the type of tannin used in this study. This observation, which fully agrees with a previous report from other laboratory using the same pH conditions but a different analytical approach and different tannin extracts (Lawless et al., 1996), strongly suggests that salivary proteins may be primary targets of the pH condition affecting their interaction with tannins. Regardless the molecular mechanism by which pH affects salivary proteintannin interactions, astringency might also be a pH–dependent sensory perception. In this study we observed that the intensity of astringency perceived by a trained sensory panel at pH 3.5 was significantly higher than at pH 7.0. Previous reports from other laboratories have also shown an increased astringency perception at lower pH (Fischer and Noble, 1994). Altogether, these observations strongly suggest that for a proper sensory assessment of the astringency produced by tannins and for a proper assessment of salivary protein-tannin interactions, pH should be considered a relevant experimental parameter. - 165 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Table 1. Intensity of perceived astringency of tannin solutions as a function of pH pH 3.5 Proanthocyanidinic tannin Hydrolyzable tannin 10.4 ± 1.2 8.0 ± 1.1 pH 7.0 6.9 ± 0.8 * 5.1 ± 1.0 * Assay as described under Materials and Methods. Figures represent mean ± standard deviation of duplicate scores by a 13member sensory panel. Asterisks indicate significant difference (p < 0.05) between scores for each tannin at different pH. - 166 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 1. Diffusion and precipitation assays for tannin-protein complexation. Onehundred- L aliquots of freshly collected whole saliva were mixed with 1500 L of pH 3.5 or pH 7.0 tannin extract solutions (proanthocyanidins and hydrolyzable tannins). After spotting a 15-uL aliquot from each experimental condition on a cellulose membrane (diffusion assay) the tubes were centrifuged to produce a supernatant and to assess visually the occurrence of sediment. Aliquots of the supernatants were used for protein detection on a cellulose membrane (precipitation assay). - 167 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 2. HPLC-DAD chromatograms of the enological tannins used in the study. A proanthocyanidin tannin extract and a hydrolyzable tannin extract were prepared from commercially available enological products and characterized by HPLC-DAD (280 nm) fractionation. Retention times, absorption spectra of individual peaks and pure standards were used compounds in the extracts. to identify specific - 168 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 3. Mode of diffusion of the salivary protein fraction on cellulose membranes. When an aliquot of whole saliva is placed on an absorbing cellulose membrane, radial diffusion occurs. Upon fixing and staining for protein with Coomassie blue, a biphasic distribution of the salivary protein is revealed, that is, a non-diffusible protein fraction is seen surrounded by a diffusible protein fraction. - 169 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 4. Effect of pH on the mode of diffusion of the protein fraction of diluted whole saliva on cellulose membranes. When whole saliva is diluted 1:15 volume ratio with water and then an aliquot is placed punctually onto an absorbing cellulose membrane, radial diffusion occurs. Upon fixing and staining with Coomassie blue, distribution of the salivary protein is revealed. When saliva is diluted with pH 7.0 water (A) the fraction of diffusible salivary protein is clearly more visible compared with the one observed after dilution with pH 3.5 water (B). Also, the non-diffusible fraction of salivary protein is somehow more aggregated at pH 3.5. - 170 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 5. Enhancing effect of low pH on the tannin-induced inhibition of salivary protein diffusion on cellulose membranes. Solutions of either proanthocyanidin tannin (A, B) or hydrolyzable tannin (C, D) both at pH 7.0 (A, C) and pH 3.5 (B, D) were mixed with whole saliva in a 15:1 volume ratio and incubated for 5 minutes at room temperature. Fifteen- l aliquots of the mixtures were placed punctually on a cellulose membrane and allowed to diffuse. The dry membrane was fixed and stained for protein with Coomassie blue. At pH 7.0, mixtures of either tannin with saliva displayed a well-defined biphasic mode of diffusion. By contrast, at pH 3.5 the same mixtures displayed a dramatic aggregation together with the almost complete disappearance of the diffusible protein component. - 171 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 6. Soluble protein in diluted whole saliva at pH 7 and 3.5. The experiment is similar to the one described in Fig. 4, except that after dilution to 1:15 either with pH 7.0 water or pH 3.5 water, saliva was centrifuged at 3000 rpm x 5 min. and 15-µL aliquots of the supernatants were spotted onto a cellulose membrane. At pH 7.0 (A) the soluble protein diffuses homogeneously whereas at pH 3.5 (B) diffusion of the soluble salivary protein is markedly inhibited thus suggesting the occurrence of soluble tannin-salivary protein complexes. - 172 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo II Subcapítulo II.6.: Efecto del pH sobre la astringencia Figure 7. Enhancing effect of low pH on the tannin-induced precipitation of salivary protein. Solutions of either proanthocyanidin tannin (A-D) or hydrolyzable tannin (E-H) both at pH 7.0 (A, C, E and G) and pH 3.5 (B, D, F and H) were mixed with whole saliva in a 15:1 volume ratio, incubated for 5 minutes at room temperature and centrifuged at 3000 rpm x 5 min to produce sediments (bottom panels). In addition, fifteen-µL aliquots of the supernatants were spotted onto cellulose membranes for protein detection as indicated in Materials and Methods (top panels). Note the almost full disappearance of protein reactivity in the supernatant of both tannins at pH 3.5 (B and F) compared to the corresponding supernatants at pH 7.0 (A and E), which is consistent with the occurrence of larger precipitates observed at the lower pH (D versus C and H versus G). - 173 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO III: Efecto de taninos de semillas sobre las proteínas salivales - SUBCAPÍTULO III.1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS En el capítulo anterior, se demostró que mediante ensayos de difusión y precipitación de proteínas salivales sobre membranas de celulosa, es posible evaluar en forma expedita y objetiva las interacciones entre proteínas y extractos de taninos de interés enológico. Sería entonces de suma importancia utilizar la metodología propuesta en la evaluación de extractos de taninos más complejos, como por ejemplo, los provenientes de semillas de bayas de Vitis vinifera. Tal como se observó en las mediciones que se muestran en el capítulo I, la semilla es la fuente más importante de proantocianidinas en las bayas de uva. Uno de los factores relevantes en la decisión de cosecha de la uva vinífera para su posterior vinificación, esta dado por la astringencia percibida en la degustación de las semillas durante la maduración. Por ello, sería de interés identificar proantocinidinas de semillas que interactúan y precipitan con las proteínas salivales, así como evaluar si el método propuesto para la evaluación de interacciones entre taninos y proteínas permite diferenciar extractos de semillas de diferente grado de madurez. Considerando lo expuesto, en este capítulo se han propuesto los siguientes Objetivos Específicos: • Identificar los compuestos fenólicos de un extracto de semillas del cultivar Carménère con capacidad de interactuar y precipitar con componentes de la saliva humana. • Evaluar y comparar la capacidad de los compuestos fenólicos provenientes de semillas del cultivar Carménère de diferente grado de madurez para interactuar con la fracción proteica de la saliva mediante ensayos de difusión y precipitación realizados en membranas de celulosa. Los estudios orientados al cumplimiento de los Objetivos Específicos señalados se presentan a continuación en los Subcapítulos III.2. y III.3., respectivamente. - 177 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO III: Efecto de taninos de semillas sobre las proteínas salivales - SUBCAPÍTULO III.2. PRECIPITACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE BAJO PESO MOLECULAR DE SEMILLAS DE BAYAS CV. CARMÉNÈRE (Vitis vinifera L.) POR SALIVA ENTERA Artículo enviado para su publicación a: European Food Research and Technology Manuscript ID: EFRT-10-0167 23 de Febrero del 2010 - 179 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva INTRODUCTION Polyphenols constitute one of the most common and widespread groups of substances in vegetables. Polyphenols include the tannin group, which comprises water-soluble compounds of molecular weights between 500-3000 Da that confer a variety of special features to foods, such as, bitterness, color and astringency (Bakker, 1998). Astringency is a tactile sensation perceived as dryness and roughness throughout the oral cavity that is thought to be provoked by physico-chemical interactions, followed by precipitation, between salivary proteins and tannins (Gambuti et al., 2006; Naczk et al., 2001). Accordingly, interactions between tannins and proteins, particularly salivary proteins, have been extensively studied in order to understand astringency (Haslam, 1998; Bacon and Rhodes, 1998; Bacon and Rhodes, 2000; De Freitas and Mateus, 2001; He et al., 2006; Mateus et al., 2004; Cosme et al., 2008; Dinnella et al., 2009; Horne et al., 2002; Nautaro et al., 1999; Lu and Bennick, 1998; SarniMachado et al., 2008). Modifications in the profile of salivary proteins have been invoked as a mechanism affecting tannin/protein interactions and hence the intensity of perceived astringency (Dinnella et al., 2009). Salivary proline-rich proteins (PRPs), a highly diverse family of parotid gland-produced proteins among herbivorous and omnivorous mammals, including man, have been shown to display a high affinity for tannins. Currently, binding of tannins to salivary PRPs has been proposed as an initial step in the development of astringent sensations (Horne et al., 2002). However, polyphenols also bind tightly to salivary histatins, α-amylase, lactoferrin, and mucins and a number of non-salivary proteins, such as gelatin, bovine serum albumin and casein (Gambuti et al., 2006; De Freitas and Mateus, 2001; Lu and Bennick, 1998). Bacon and Rhodes (2000) had observed differential affinities between a single tannin and different proteins and suggested that epigallocatechin has a higher binding affinity for PRPs than for many other proteins. Binding studies with purified salivary proteins have shown that interactions depend on the nature of the protein and particularly on their level of glycosylation (SarniMachado et al., 2008). In open contrast with salivary proteins, properties of tannins participating in astringency-inducing mechanisms have been far less studied (Naczk et al., 2001; He et al., 2006; Cosme et al., 2008). Two factors have been suggested to be critical in the affinity of tannins for salivary proteins: tannin size (e.g. degree of polymerization) and degree of galloylation (presence of gallic acid and their derivates in the tannin structure) (Vidal et al., 2004). For instance, tannic acid comprises a high proportion of gallotannins and shows a high affinity for salivary proteins whereas tannins with low degree of galloylation display a lower affinity for salivary proteins (Bacon and Rhodes, 2000). On the other hand, it has been shown that larger and more complex polyphenols interact more strongly with fragments of PRPs (Baxter et al., 1977). In this regard, it has been postulated that larger tannins form multiple bonds with adjacent proline residues and that also associate and stack with other tannin molecules after binding to proteins. In contrast, simple phenols would bind only to single proline residues (Haslam, 1998). In addition, some authors have observed that high molecular weight proanthocyanidins are - 181 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva selectively precipitated by the supernatant obtained from saliva spun at 10000g for 10 min while dimeric and trimeric proanthocyanidin oligomers remain in solution. On the other hand, in presence of small amounts of proanthocyanidins, low molecular weight PRP and probably histatins displayed a higher tendency to precipitate (Sarni-Machado et al., 1999). Altogether, most of the referred studies on molecular mechanisms underlying astringency and focusing on the tannin component, have been performed under experimental in vitro conditions or have used salivary fluids that may drastically differ from native salivary secretions both in structure, composition and properties (Mateus et al., 2004; Nautaro et al., 1999; Lu and Bennick, 1998; Sarni-Machado et al., 2008, Sarni-Machado et al., 1999) or have been based on the use of model proteins, polypeptides and tannins (Dinella et al., 2009; Horne et al., 2002; Llaudy et al., 2004). This work was aimed at identifying low molecular weight phenols (LMWP) from cv. Carménère berry grape seeds that may interact and precipitate while in contact either in vivo or in vitro with human saliva. - 182 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Materials and Methods Materials. Standards of gallic acid (G-7384), (+)-catechin (C-1251), (-)-epicatechin (E-1753) and (-)epicatechin-3-O-gallate (E-3893) as well as 0.45- m pore size membranes were acquired from Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. HPLC grade acetonitrile and pro-analysis solvents were purchased from Merck, Darmstadt, Germany. Major instrumentation. The HPLC system (Agilent Technologies Santa Clara, CA., USA) used for characterization of phenolic compounds consisted of a photodiode-array detector model G1315B, a quaternary pump model Quat G1311A, an autosampler model ALS G1329A and a reversed phase Nova Pack C18 column (4 m, 3.9 mm ID x 300 mm; Waters Corporation, Milford, MA., USA). Grape samples. Plants of Vitis vinifera L. cv. Carménère, vintage 2008, grown in the Maule Valley at the VII Region of Chile were used. One-thousand berries (25 °Brix) selected from 200 plants were harvested on April 15th. Extraction of phenolic compounds. All the seeds (N=1000) were separated by hand from the berries, weighed and grounded. After adding two liters of distilled water, maceration was performed for 2 hours at 20ºC under mechanical stirring. The suspension was centrifuged at 3600 rpm for 15 minutes and filtered through a 0.45- m pore size membrane. HPLC–DAD analysis of individual phenolic compounds. The seed extract of phenolic compounds was characterized as previously described (Obreque-Slier et al., 2009). Briefly, a 25 mLaliquot of the extract was re-extracted with ethyl ether (3 x 20 mL) and ethyl acetate (3 x 20 mL). The new extracts were combined and evaporated to dryness at 30 ºC, re-dissolved in 1 mL of 50% (v/v) methanol/water and membrane-filtered (0.45 µm pore size). Fifty-µL aliquots of the final solution were subjected to reversed-phase chromatographic separation at 20oC using a Nova Pack C18 column. A photodiode-array detector was set at 280 nm. Two mobile phases were used: A, water/acetic acid (98:2 v/v) and B, water/acetonitrile/acetic acid (78:20:2 v/v/v). A two-step gradient was carried out at a constant flow rate of 1.0 mL per min: 0-55 min, 100-20% A and 55-70 min, 20-10% A. Equilibration times of 15 min were allowed between injections. Each major peak in the HPLC chromatograms of the extracts was characterized both by its retention time and UV absorption spectrum (from 210 to 360 nm). Identification of specific compounds was achieved by comparison of UV spectra and retention times against those of pure standards. The proanthocyanidins for which no standards were available, were identified by their retention time and spectral parameters reported by Peña-Neira et al. (2004). Quantitative determinations were made by using an external standard method with commercial standards. For proanthocyanidins quantification, a (+)-catechin standard curve was produced. All the qualitative and quantitative analyses of phenolic composition were performed in quintuplicate. - 183 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Saliva. A 31-year old male volunteer, without history of smoking, alcoholism or medication consumption, with no evidence of disease and displaying normal saliva flow (over 1mL/min) was included under the terms of a signed informed consent. Immediately before the experiments and following a mouth rinse with water, samples were always collected between 10:00 and 12.00 A.M. to minimize eventual diurnal variations in salivary composition (Sarni-Machado et al., 2008). Saliva was conserved in an ice-bath during the experiments. Assays for interaction between seed tannins and saliva. 1. In vitro (or indirect) assay: Aliquots of saliva (1, 2 and 8 mL) from a single donor volunteer were mixed with 40 mL of the primary grape seed extract in centrifuge tubes. After 5 min incubation at 37ºC each mixture was centrifuged at 3600 rpm during 5 minutes. The supernatant was eliminated whereas the sediment was dissolved in 50 mL of distilled water with the aid of mechanical stirring during 10 minutes. The resulting suspension was divided into two halves and a half was used for the analysis of LMWP by using HPLC-DAD and the other half was placed on a glass plate and dried for 1 hour to obtain the dry weight of the sediment (Figure 1). 2. In vivo (or direct) assay. A second assay was carried out by placing 20 and 40 mL of the primary grape seed extract in the mouth of the single volunteer donor of saliva. After mixing thoroughly the extract with the saliva present in the mouth, the volunteer returned the mixture into centrifuge tubes. After a 5-min rest, the tubes were centrifuged and the resulting sediments were analyzed as described above (Figure 1). Both the direct and indirect assays were carried out daily for 5 days (each day was a replicate). In order to keep constant the experimental conditions, the volunteer kept the same diet since 3 days before beginning the experiment. Just before the start of the experiment at about 10.00 A.M. every morning, the volunteer drank 200 mL of water (Figure 1). - 184 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva RESULTS Low molecular weight phenolic compounds in grape seeds. As shown in Table 1 and Figure 2, eleven flavonoid and non-flavonoid compounds were identified and quantified by HPLC-DAD analysis in the extract of Carménère seeds. Among those LMWP, we identified three mon omers [(+)catechin (C), (-)-epicatechin (EC) and (-)-epicatechin-3-O-gallate (B4), (ECG)], four dimeric (B2), proanthocyanidins [catechin-(4α→8)-epicatechin epicatechin-(4β→8)-epicatechin catechin-(4α→8)-catechin (B3) and epicatechin-(4β→8)-catechin (B1)], dimers esterified with gallic acid (BG), two trimeric proanthocyanidins and only one non-flavonoid compound [gallic acid (GA)]. LMWP compounds in the sediment produced by mixing saliva with a seed extract (in vitro assay). Forty-mL aliquots of the extract were mixed in vitro with various volumes of whole saliva in the range from 1 to 8 mL. After incubation for 5 minutes, the mixtures were centrifuged and the sediments were analyzed by HPLC-DAD. Figure 3 shows a representative chromatogram including the identities of most of the peaks observed in the fractionation. Figure 4 shows that the composition of LMWP in the sediments produced by mixing different volumes of saliva with a single volume of seed extract is dependent upon the saliva to seed extract v/v ratio. Thus, the LMWP observed in the sediments of either 1 mL or 2 mL of saliva with 40 mL of seed extract (1S/40T and 2S/40T, respectively) were GA, C, EC, ECG and BG. In addition, compared with the 1S/40T mixture, the sediment produced from the 2S/40T mixture showed a higher content of all the LMWP compounds identified. Likewise, the LMWP compounds present in the sediment corresponding to the 8S/40T mixture were the same as those present in the seed extract with the exception of trimer 1 (Figure 3). Concentrations of all the LMWP present in the 8S/40T sediment were higher than those observed in the 1S/40T and 2S/40T sediments, with the exception of GA, a LMWP whose highest concentration occurred consistently in the sediment of the 2S/40T mixture (Figure 4). Finally, in relation to the corresponding concentrations in the seed extract, ECG was the LMWP displaying the highest precipitated fraction in all the three sediments, followed by either GA in the 1S/40T and 2S/40T sediments or the proanthocyanidin B1 in the 8S/40T sediment. LMWP compounds in the sediment obtained after mouthrinsing with a seed extract (in vivo assay). After mouthrinsing during 15 seconds with either 20 or 40 mL of the primary seed extract, the volunteer returned the mouth content corresponding to each experimental condition into a centrifuge tube. After centrifugation at 3600 rpm for 5 min, the sediments were analyzed using HPLCDAD as described previously. Figure 5 is a representative HPLC-DAD chromatogram of those sediments. Sediments obtained after mouthrinsing with 20 mL of the primary seed extract (R/20T) contained GA, C, EC, ECG, dimers B1 and B2 and a dimeric procyandin (P1). In the sediments obtained after mouthrinsing with 40 mL of the seed extract (R/40T), besides those LMWP, dimeric - 185 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva proanthocyanidins B3 and B4 were also observed. Finally, this latter sediment showed the highest contents of the identified LMWP in these assays (Figure 6). - 186 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva DISCUSSION Astringency has been described as a sensation of roughness and/or ruggedness in the mouth surface and has been attributed to interactions of phenolic compounds from a wide variety of vegetables, food and drinks with salivary proteins (Dinella et al., 2009; Horne et al., 2002). The main phenolic compounds thought to be responsible for wine astringency are flavan-3-ol polymers, commonly designated as proanthocyanidins or condensed tannins (Bakker, 1998; Haslam, 1998; De Freitas and Mateus, 2001). In the case of wine, these compounds are extracted from grape skins and seeds during the stage of vinification. Both the nature, level of galloylation and average degree of polymerization of tannins would strongly influence their interaction with salivary proteins (Haslam, 1998; Bacon and Rhodes, 2000; Sarni-Machado et al., 1999). In order to assess the effect of low molecular weight phenolic compounds (LMWP) on the formation of insoluble tannin-salivary protein complexes, they were differentially extracted from grape seeds by using distilled water as solvent. By HPLC-DAD analysis we observed a qualitative and quantitative composition of flavonoid and non flavonoid compounds that was similar to the one reported by other authors (Santos-Buelga et al., 1995). The most abundant compounds in the extract were C and EC monomers, followed by GA and ECG. Various dimeric and trimeric proanthocyanidins were identified, such as eight proanthocyanidin gallates. These low molecular weight compounds have been found to influence both astringency and bitterness sensations (Mateus et al., 2004; Peleg et al., 1999). Thus, Pelleg et al. (1999) evaluated intensities of both astringency and bitterness of seven flavonoid compounds by using a time-intensity (TI) procedure. Those seven stimuli included two flavan-3-ol monomers [(+)-catechin and (-)-epicatechin], three dimers and two trimers. As the degree of polymerization increased among the three proanthocyanidin classes, both the maximum intensity (Imax) and total duration (Ttot) of bitterness decreased whereas astringency Imax increased. In the present study, single volumes of the extract of grape seeds containing LMWP were mixed with varying volumes of whole saliva from a single volunteer, that is, saliva accumulated in mouth and expectorated passively. At variance of a number of studies, saliva was not subjected to any kind of preparative fractionation prior to the experiments. After centrifugation, the sediments displayed a differential composition of LMWP, as assayed by HPLC-DAD. Sediments of the 1S/40T and 2S/40T mixtures comprised three flavan-3-ol monomers (C, EC and ECG), GA and some GPs, with a higher concentration of each of those LMWP in the 2S/40T sediment. Most of the seed extract LMWP were precipitated when the relative volume of saliva was risen up to 8S/40T. Studies on the stoichiometry of tannin-protein interactions have shown that less tannin is required to precipitate proteins from concentrated solutions than from dilute ones (Frazier et al., 2003). In addition, at high protein concentrations direct bridging between proteins and epigallocatechin gallate does occur (Pascal et al., 2007). Unpublished studies from our laboratory have shown that an equivalence point, that is, the lowest amount of tannin needed to fully precipitate a protein, can be defined for a definite pair of a tannin (extract) and a protein. Thus, the equivalence point for the LMWP extract and saliva could be - 187 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva estimated from the mass of total tannin and total salivary protein present in 40 mL of the tannin extract and 8 mL of saliva, respectively. Under those conditions, bridging between salivary proteins and various LMWP would be expected to occur. Interestingly, ECG was the LMWP whose presence in the composition of all the sediments in relation to its presence in the seed extract was the highest among all the LMWP, that is, ECG seems to have been the most active precipitant of salivary proteins or, at least, a highly selected member of the LMWPsalivary protein complexes. This important observation might well be due to the relative high number of potentially reactive sites and substituents in ECG, such as the flavonoid skeleton allowing hydrophobic bonds and the three OH groups of the gallic acid residue each corresponding to a potential hydrogen-bond forming site between polyphenols and proteins (Bacon and Rhodes, 1998; He at al., 2006). Our observations also suggest that precipitation of the LMWP compounds present in the seed extract depends positively on the concentration of saliva in the mix. According to Pascal et al. (2007), at low EGCG/protein ratios, EGCG binds progressively a model protein in suspension without inducing aggregation. At higher ratios, EGCG bridges the partially bound protein molecules and provokes the appearance of EGCG-protein aggregates. Such in vitro observation would support the hypothesis that interindividual differences in salivary volume and salivary protein composition may be of major relevance in differential astringency perception towards the tannin content of a food (Dinellla et al., 2009; Lu and Bennick, 1998). In this regard, total protein contents in whole stimulated saliva of a single group of patients have been shown to vary from 1.1 to 3.8 mg/mL (Martins et al., 2006). Also, average volume of saliva in the mouth of healthy subjects has been reported to be around 1 ml per mouth although this parameter seems to vary markedly in a sex- and age-dependent manner (Lagerlöf and Dawes, 1984; Watanabe et al., 1990; Weatherell et al., 1992). Besides, the rate of saliva production is around 1 mL/min (Lagerlöf and Dawes, 1984; Watanabe et al., 1990). Considering that set of parameters and the fact that in sensory evaluation tasters use to place around 15 to 20 mL of wine in the mouth (Jackson, 2009), the experiment in this study consisting in the assessment of the sediment composition obtained from an in vitro 2S/40T mixture would represent an experimental condition mimicking a real one. Under those conditions, precipitation of LMWP was only partial. In the present study we also conducted comparative in vivo assays. In these very uncommon assays in the literature, the same saliva donor volunteer placed either 20 or 40 mL of the same seed extract used in the in vitro assays, mixed it with saliva in the mouth and returned it into centrifuge tubes to obtain then the corresponding R20T and R40T sediments. While the R20T sediment showed the presence of two thirds of the LMWP present in the seed extract, the R40T sediment displayed almost all the LMWP of the extract excepting the trimeric proanthocyanidins. Once again, relative to its presence in the seed extract, in these in vivo experiments ECG was the LMWP with the highest precipitation ratio. Comparatively, the R40T sediment showed the highest contents of all the LMWP, being the ECG, EC and C monomers (decreasing order) the ones displaying the highest levels in the sediment. Thus, this assay would demonstrate that the amount of sample used in tasting is of high relevance because the - 188 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva higher the volume of sample the higher the precipitation of LMWP compounds from the seed extract. As shown in this study, several LMWP compounds observed in the R40T sediment were not present in the R20T sediment. Those differences may well result in differences in the perceived astringency by the taster. On the other hand, our study has also shown that significant differences may occur between the observations made on the composition of insoluble complexes obtained by similar mixtures of saliva and seed extract through the use of in vivo and in vitro assays. Factors accounting for those differences are a matter of ongoing experiments in our laboratory. A number of reports have described the formation of insoluble complexes between high molecular weight phenolics and salivary proteins and its correspondence with astringency perception (Gambuti et al., 2006; Naczk et al., 2001; Haslam, 1998, He et al., 2006; Llaudy et al., 2004). In this study we have shown that LMWP compounds that have been selectively extracted from grape seeds, particularly flavanol monomers, display a marked tendency to interact with and precipitate salivary proteins. This main finding from our study would suggest that the low astringency, and bitterness, that is perceived in seeds from more mature grapes, may well be associated not only with the presence of flavan-3-ol polymers but with the decrease in the content of flavan-3-ol monomers. The latter one has been observed in studies with seeds during grape ripening (Kennedy et al., 2000b). In various experiments we have now observed that ECG was the LMWP compound from the seed extract with the highest precipitated fraction with respect to its content in the seed extract. By contrast, trimer 1 was not present in any sediment in the various assays of the study. These observations would suggest that the seed extract comprises LMWP displaying either a high- or a low-affinity for salivary proteins, such as ECG and trimer I, respectively. Altogether, this study has shown that LMWP from grape seeds may interact differentially with the salivary protein fraction to become part of insoluble complexes. These interactions may well be part of the molecular mechanisms underlying astringency perception and should be taken into account in the interpretation of changing sensory attributes during grape maturation. Standardization of experimental protocols for the assessment of those interactions are strongly needed. - 189 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Table 1. Composition of low molecular weight phenolics of aqueous extracts from grape seeds cv. Carménère. mg/Kg seeds Gallic acid Proanthocyanidin B3 Proanthocyanidin B1 (+)-catechin Trimer 1 Proanthocyanidin B4 Proanthocyanidin B2 (-)-Epicatechin Proanthocyanidin 1 Trimer 2 Epicatechin-3-O-gallate Proanthocyanidin 2 Total of proanthocyanidin gallates 51.4 37.0 25.7 12.1 32.2 96.4 6.5 23.1 47.1 15.7 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 5.2 2.6 0.5 86.0 0.8 3.1 1.5 8.1 2.0 3.0 3.3 3.4 22.9 585.8 ± 343.2 ± 228.5 ± - 190 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Figure 1. In vitro and in vivo assays for tannin-salivary protein interactions. - 191 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Figure 2. HPLC-DAD chromatogram of an aqueous extract of seed grapes from Vitis vinifera cv. Carménère. Identification of LMWP was mostly achieved by comparison of UV spectra and retention times against those of pure standards. Further details are given under Materials and Methods. - 192 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Figure 3. HPLC-DAD chromatogram of the sediment produced by in vitro mixing of 8 mL of whole saliva with 40 mL of seed grape extract (8S/40T). - 193 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva 100 A 80 60 40 20 0 GA B3 B1 C T1 B4 B2 EC P1 T2 ECG P2 GPs 100 B 80 LMWP 60 40 20 0 GA 100 B3 B1 C T1 B4 B2 EC P1 T2 ECG P2 GPs C LMWP 80 60 40 20 0 GA B3 B1 C T1 B4 B2 EC P1 T2 ECG P2 GPs LMWP Figure 4. Contents of LMWP in the sediments produced by in vitro mixing of various volumes of saliva with a constant volume of seed extract. Top panel (A): 1S/40T; Middle panel (B): 2S/40T; Bottom panel (C): 8S/40T. Contents are expressed as mg of LMWP/Kg of precipitated. - 194 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva Figure 5. HPLC-DAD chromatogram of the sediment produced by mouthrinsing with 40 mL-aliquot of seed grape extract (R/40T). In vivo assay. - 195 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.2.: Precipitación de fenoles de semillas por saliva 100 A 80 60 40 20 0 GA 100 B3 B1 C T1 B4 B2 EC P1 T2 ECG P2 GPs B LMWP 80 60 40 20 0 GA B3 B1 C T1 B4 B2 EC P1 T2 ECG P2 GPs LMWP Figure 6. Contents of LMWP in the sediments produced by mouthrinsing with various volumes of seed grape extract. Top panel (A): 20 mL of extract (R/20T); Bottom panel (B): 40 mL of extract (R/40T). Contents are expressed as mg of LMWP/Kg of precipitated. - 196 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - CAPÍTULO III: Efecto de taninos de semillas sobre las proteínas salivales - SUBCAPÍTULO III.3. INTERACCIÓN DIFERENCIAL ENTRE PROTEÍNAS SALIVALES Y TANINOS DE SEMILLAS DE BAYAS CV. CARMÉNÈRE DE DIFERENTES ESTADOS DE MADUREZ - 197 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva INTRODUCTION The tannins present in foods and beverages constitute a large family and are associated to some organoleptic properties of the wine, such as astringency and bitterness (Wiel et al., 2001; Monagas et al., 2005). The sensation of astringency is sensorially described as a complex group of sensations involving dryness of the oral surface and tightening and puckering sensations of the mucosa and muscles around the mouth (Lee and Lawless, 1991; Gawel et al., 2000). Chemically, the perception of astringency results from binding and subsequent precipitation of tannins with salivary proteins (Kielhorn and Thorngate, 1999). Recently Payne at al. (2009) have reported that the cells of the oral cavity may play a direct role in the astringent sensation. Astringent procyanidins bind to oral epithelial cells, and that the binding is concentration-, pH- and temperature - dependent, but is not affected by the presence of up to 13% ethanol. Despite the importance of astringency and its economic importance to the wine industry, the mechanism by which the astringent stimulus is perceived is yet to be elucidated. Tannins responsible for wine astringency are mostly flavan-3-ol polymers commonly referred to as proanthocyanidins or condensed tannins (De Freitas and Mateus, 2001; Gawel, 1998). Human saliva contains three main classes of protein: acidic, basic and glycosilated which permit it multifunctional characteristics (Benninck, 1982). Recent research into the salivary proteome has identified 437 proteins in saliva (Xie et al., 2005), but only proline-rich proteins, histatins, α-amylase, lactoferrin, and mucins have been implicated in the sensation of astringency (De Freitas and Mateus, 2001; Lu and Benninck, 1998; Gambuti et al., 2006; Condelli et al., 2006). Charlton et al. (2002a) have proposed a 3-stage model of the binding and precipitation of proteins by polyphenols where the initial polyphenol-protein interaction results from the binding of the hydrophobic face of the polyphenol’s aromatic ring with the pyrrolidine ring of the protein’s proline residues. This polyphenol–salivary protein interaction may form a layer that acts as a water barrier and produces a mouth-drying sensation. Another hypothesis is that the binding could modify the lubricant properties of the saliva, limiting the amount of saliva which is produced and leading to changes in protein composition (Kallithraka et al., 1998). Actually, several studies have studied the complexation between proteins and polyphenols (Lu and Benninck; 1998; Gambuti et al., 2006; Kallithraka et al., 1998; Bacon and Rhodes, 1998 and 2000; Baxter et al., 1997; Jöbstl et al., 2004; Valentova et al., 2002; Simon et al., 2003), but the influence of seed grape tannins on the behavior of fluid saliva has been less investigated. The aims of this work was to evaluate the effect of the phenolic compounds present in samples of seeds from Carménère grapes of different maturity stages on the difusibility and precipitability of salivary proteins in cellulose membranes. - 199 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva MATERIALS Y METHODS Materials. Standards of gallic acid (G-7384), (+)-catechin (C-1251), (-)-epicatechin (E-1753) and (-)epicatechin-3-O-gallate (E-3893), as well as 0.45- m pore size membranes were acquired from Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA. Solvents used for cellulose membrane processing, vanillin 99% (code V-8510), trifluoroacetic acid, ethyl acetate, acetonitrile HPLC grade and proanalysis solvents were purchased from Merck, Darmstadt, Germany. The HPLC system (Agilent Technologies Santa Clara, CA., USA) consisted of a photodiode-array detector Model G1315B, a pump Model Quat G1311A and an autosampler Model ALS G1329A. A reversed phase Nova Pack C18 column (4 m, 3.9 mm ID x 300 mm; Waters Corporation, Milford, MA., USA) was used for HPLC-DAD analysis of individual phenolic compounds. Absorbances were measured using a Jasco UV-Vis spectrophotometer Model V-530 (Jasco International Co., Ltd., Tokyo, Japan). Other solvents and reactive pro-analysis degree were obtained from Oxiquim-Chile. Grape samples. Self-rooted Vitis vinifera L. cv. Carménère vines, vintage 2009, planted in 2003 and grown in the Maule Valley at the VII Region of Chile were used (parallel 35º 28' and 36º 40' south latitude). 120 berries were selected from 4 clusters per plant among a total of 30 plants. The samples were harvested in February the 10th (postveraison) and May the 10th (harvest). Seeds were separated by hand from the berries, weighed and grounded. 7 g of seeds were blended with 250 mL of water containing 5 g/L of tartaric acid. After maceration during 2 hours at 20ºC under mechanical stirring, the extracts were filtered through a 0.45- m pore size membrane and adjusted a pH 3.7 with sodium hydroxide. Grape seeds characterization. Total phenol content was determined by UV-absorptiometry at 280 nm (Glories, 1984) using gallic acid as standard. Total tannin content was measured by the method of Ribéreau-Gayon and Stonestreet (1966). Likewise, the low molecular weight phenolic compounds in grape seeds were identified and quantified by HPLC-DAD analysis (Peña-Neira et al., 2000 and 2004; Obreque-Slier et al 2009). Saliva collection. A 31 years old volunteer, men, without history of smoking, alcoholism and medication consumption and without evidence of disease and normal flow saliva (superior to 1mL/min) was included under the terms of a signed informed consent. The Ethics Committee of the Faculty of Medicine, University of Chile, approved the study protocol, which was in accordance with the Declaration of Helsinki. The recollected saliva was centrifuged during 5 minutes at 3600 rpm and the supernatant was stored for 4ºC before it immediately utilization. Sensory evaluation. The two seeds extract were evaluated for astringency by a 13-member trained sensory panel. Seeds extract(15 mL) at 20ºC (± 0.1 ºC) in black cups were presented at random to the - 200 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva panel members, who were asked to describe the intensity of the perceived astringency for each sample on a 0-15 score scale. Each sample was evaluated twice. Water solution of 5 g/L of tartaric acid and adjusted a pH 3.7 with sodium hydroxide was served as control (level 0 on the score scale). Pectin dissolved in distilled water (1 g/L) was used for mouth rinsing between consecutive samples. Assays of diffusibily and precipitability of proteins. The two seeds extract were diluted with distilled water (2.5 %, 5.0 %, 7.5 %, 10 %, 12.5 %, 15.0 %, 17.5 %, and 20 %) and were mixture with agitation vortex, 1500 L of the serial of seeds extract and 100 L saliva centrifuged in Eppendorf tubes. In the diffusivity assay, from each Eppendorf tube were spotted aliquots of 15 L of different blends on the cellulose membranes. Membranes were processed according to the disc method described by Bramhall et al. (1969), with some modifications (Durham and López-Solís, 1979). In brief, the membranes were air-dried at room temperature for 10 minutes, fixed for 5 minutes in 5% trichloroacetic acid, rinsed for 5 minutes in 80% ethanol, and stained for 20 minutes in 0.5% Coomassie blue R-250 dissolved in 45% isopropanol/10% acetic acid. The membranes were washed thoroughly in 7% acetic acid until they displayed a clear background and were dried under a heat lamp. Blue-stained areas of the membranes corresponding to each sample or standard solution were compared visually according at the distribution protein area in presence of different concentrations of seed tannins. In the precipitability assays, after of mixture the protein and tannin solutions, the Eppendorf tubes were centrifuged during 5 minutes at 5000 rpm of each Eppendorf tubes were spotted aliquots of 15 L on cellulose membranes. The cellulose membranes were processed in the same form used at the diffusibility assay. The reproducibility of the procedure was determined by comparing the results obtained by 3 experienced independent. - 201 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva RESULTS Chemical characterization of Carménère grape seeds. Table 1 shows total phenols, total tannins and a group of 10 flavonoid and non-flavonoid compounds that were identified and quantified by HPLC-DAD analysis in Carménère grape seeds from both extracts. Seeds extract from grapes harvested at February the 10th shows higher values of total phenols and tannins than seeds extract obtained from grapes harvested at May the 10th. By the other hand, by using HPLC-DAD analysis, it were identified three monomers [(+)-catechin, (-)-epicatechin and (-)-epicatechin-3-O-gallate], four procyanidin dimers [catechin-(4α→8)-epicatechin (B4), epicatechin-(4β→8)-epicatechin (B2), catechin-(4α→8)-catechin (B3) and epicatechin-(4β→8)-catechin (B1)], three procyanidins, two dimers esterified with gallic acid and only one non-flavonoid compound (gallic acid) (Figure 1). It was possible to observe that the concentration of each of those compounds was higher in the extract of seeds harvested near veraison than of those harvested lately. Sensory evaluation. Seed grape extracts were assayed for astringency by using a descriptive test in two independent successive sessions. As shown in Table 2, seeds extract from grapes harvested at 10th February were recognized by the trained sensory panelists as significantly more astringent compared to the seeds grape extract from grapes harvested at May the 10th. Effect of seed grape extracts on salivary protein diffusion. According to Figure 2A, the saliva shown a biphasic diffusion behavior when it was placed on cellulose membranes, with a fraction that diffuses freely along the water and other non-diffusible fraction with an intense blue-stained roughly circular area close to the spotting site. When the saliva sample was centrifuged, it was provoked a significant loss of non diffusible fraction while the fraction that diffuses freely remained unchanged (Figure 2B). By the other hand, when the centrifuged saliva was mixed with water, and 15 L of the mixture was placed on the cellulose membrane, it was observed a radial distribution from the deposit sample point, moisturizing finally a roughly circular area, but also with a loss of the biphasic mode initially described (Figure 3A and 3J). Similarly, when the centrifuged saliva was mixed with water but in presence of increase quantities of seeds extract, it was observed a gradual loss of the bluestained. This effect was accompanied by the appearance of an insoluble material (Figure 3D and 3O). This double effect was amplified when it was used seeds extract obtained near veraison. In the case of seeds extract from grapes harvested at veraison, the gradual loss of staining was observed after the fourth mixture (Figure 3E), whereas in the case of the extract obtained near harvest this effect was observed from the penultimate mixture (Figure 3Q). Similarly, the appearance of an insoluble material in the case of seeds extract near veraison occurred after the third mixture (Figure 3D), whereas for the seed from grapes harvested later in the fifth mixture (Figure 3O). - 202 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Effect of seed grape extracts on salivary protein precipitability. Protein precipitation through tannins is an objective parameter of interaction between both kinds of compounds. In this study, after the seeds extract was mixed with saliva, the samples were centrifuged to sediment the supernatants. On cellulose membranes were deposited supernatant aliquots of each experimental treatment, estimating the precipitation of seed tannin-saliva complex by the extinction of the stain in the supernatant (precipitibility test). Figures 4 and 5 show a comparative assay of the ability of two seed extracts to produce the precipitation of salivary proteins. When the supernatants were deposited in the cellulose membranes, it was observed a gradual disappearance of the salivary proteins supernatant in presence of both seeds extract. This observation was doubly confirmed by the decrease of blue dye in the cellulose membrane and the gradual emergence of a material (pellet) at the bottom of Eppendorf tubes. This dual behavior was amplified when it was used a seeds extract from early harvested grapes (Figure 4). It was so for, seed from grapes harvested earlier; the disappearance of the blue dye was observed from the fifth sample (Figure 4F) and disappeared completely in the follow sample (Figure 4G). Similarly, it was observed the appearance of a pellet of a larger size than those observed in previous samples (Figure 4H). In the case of seed harvest lately, the gradual disappearance of salivary proteins is observed from the seventh sample (Figure 5H), but remaining a staining slightly blue on cellulose membranes until the last sample. In this case, the magnitude of the size of the precipitates at the bottom of the tubes was constant. - 203 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva DISCUSSION In this study was evaluated the tannins ability from Carménère grapes seeds at maturity stages to affect salivary proteins diffusivility and precipitability. The two groups of Carménère grape seeds used in this study were harvested with 100 days between them during the ripening period, thus producing two phenolic extracts with evident differences. The total phenols, total tannins and low molecular weight phenolic compounds concentrations observed in this study were consistent with those observed by other authors (Peña-Neira et al., 2004; Pastor del Rio and Kennedy, 2006; Yilmaza and Romeo, 2006; Labarbe et al., 1999; Santos-Buelga et al., 1995). The extracts of seeds from grapes harvest earlier (February the 10th) presented higher concentrations in all the compounds analyzed than those from seeds extract from grapes harvest lately (May the 10th). According to some authors, these differences are caused by oxidation produced under aqueous conditions that affect the concentration of these compounds (Fuleki and Ricardo da Silva, 1997; Kennedy et al., 2000a) and due to compositional changes produced in seeds during maturation (Labarbe et al., 1999; Fuleki and Ricardo da Silva, 1997; Peña-Neira et al., 2004). These differences in the phenolic concentration could provoke changes in the saliva structure and hence differences in the astringency perception. By the other hand, the chemical differences observed between both seeds extract were strongly supported by the sensory analysis, where the panelists perceived as clearly as more astringent the extracts of seed from grapes harvested earlier. Furthermore, in previous studies it was described that salivary fluid diffuse biphasically (LópezCisternas et al., 2007). Although this behavior was again observed in this study, when the saliva was centrifuged, is observed a significant loss of the non diffusible fraction, due probably by the differential composition and structural conformation of both fractions. Likewise, when the centrifuged saliva was mixed with water, it was observed a total loss of biphasic mode. Excess of water could have provoked a disruption of the non-diffusible fraction transformed it into a fraction that diffuse along the water. According these initial observations, it were carried out studies to assess the effect of grape seeds extract of Carménère cultivar with different levels of astringency on centrifuged saliva. The staining of proteins on the cellulose membranes showed that increasing the ratio seeds extract/saliva, the staining is lost gradually. This phenomenon is observed by both, the progressive reduction of the diffusion protein total area and by the appearance, also progressive, with a particulate matter nondiffusible bluestained in the center of the diffusion circle. That material would correspond to tannin-protein complexes that probably contain a higher content of tannin. Comparatively, it were required higher concentrations of seeds extract from the late harvested grapes to achieve similar effects that those provoked by seeds extract from grapes harvested near veraison. These observations together, suggest that the phenolic differences of both seeds extracts provoke a differential interaction with salivary proteins, being the seeds extract from grapes harvested early (10 days after veraison) which needed lower quantities to cause these effects compared with seeds extract - 204 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva from grapes harvested later, affecting the natural characteristics of the saliva and thus exacerbating the perception of astringency, as was stablished by the sensory panel. When the saliva was mixed with increasing amounts of both seed grape extracts, followed by centrifugation of the tubes and the supernatants were deposited in serial aliquots, it was observed a gradual disappearance of the blue dye on cellulose membranes. This observation confirms the precipitating ability of proteins that exhibit polyphenols such as those described in seeds (Lee and Lawless, 1991; De Freitas and Mateus; 2001; Jöbstl et al., 2004; Versari et al., 1998). By using the “precipitability test”, it was possible observe that seeds extract from grapes harvested later were less effective in the precipitation of salivary proteins, compared with seeds from grapes harvested at veraison, that produced the total precipitation of salivary proteins. This condition has been denominated as "equivalence point", which corresponds to the condition where the tannin concentration is enough to precipitate totally the protein presented in a solution, while lower amounts are insufficient to fully precipitate salivary proteins. This point of equivalence was not observed when it was used the extract of seeds from grapes harvested at technological maturity. Taken together, these observations show that protein-tannin interaction, and therefore the sensory effects such as astringency perception, would be highly dependent on the chemical nature and qualitative properties of the phenolic components involved in agreement with results obtained by other authors (Lee and Lawless, 1991; De Freitas and Mateus; 2001; Charlton et al., 2002a; Kallithraka et al., 1998; Bacon and Rhodes, 1998 and 2000; Baxter et al., 1997; Jöbstl et al., 2004). The moment of harvest of grapes is a factor that influences the astringency and for this reason could affect the acceptability and quality of the wines. Finally, the methodology employed in this work would allow the independent evaluation, prompt and objective of the interactions between salivary proteins and different types of grape seeds extract, becaming a tool to evaluate the astringency and the “phenolic matirity” of seeds extract from grapes used in wine production. - 205 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Table 1. Total phenols, total tannins and phenolic compounds of low molecular weight of two Carménère seeds grapes extract with different maturity stages. 10th february Total phenols & Total tannins Gallic acid * Proanthocyanidin B3 # Proanthocyanidin B1 (+)-catequin # # † 10th may 14,4 ± 1.8 28,8 ± 2.6 68,0 ± 5.2 12,4 ± 1.4 16,7 ± 1.5 149,0 ± 9.7 15,1 ± 1.1 51,1 ± 4.7 161,6 ± 12.5 9,7 ± 1.4 27,9 ± 1.6 37,0 ± 3.0 20,3 ± 2.2 48,9 ± 4.5 127,9 ± 10.1 56,0 ± 3.6 36,5 ± 2.8 580,7 ± 36.8 41,0 ± 2.8 91,5 ± 8.7 583,6 ± 61.2 136,4 ± 9.8 127,8 ± 8.9 143,9 ± 11.5 Proanthocyanidin B4 # Proanthocyanidin B2 # (-)-epicatequin # Epicatequin-3-O-galato* Other proanthocyanidins # Proanthocyanidin gallates * & mg equivalent gallic acid/g seed equivalent cyanidin/g seed mg equivalent catechin/Kg seed † mg # * mg equivalent gallic acid/Kg seed - 206 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Table 2. Intensity of perceived astringency of seed grape extracts. Date harvest of seed grapes February 10th May 10th 11.3 ± 1.1 * 8.3 ± 0.8 * Figures represent mean ± standard deviation of duplicate scores by a 13-member sensory panel. Asterisks indicate significant difference (Chi squared, p < 0.05) between both seed grape extracts harvested at different dates. - 207 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Figure 1. HPLC-DAD chromatogram of seed Carménère grape. The compounds identified were: (A) gallic acid, (B) procyanidin B3, (C) procyanidin B1, (D) (+)-catechin, (E) procyanidin B4, (F) procyanidin B2, (G) (-)-epicatechin, (H, J and K) other procyanidins (I and M) dimers esterified with gallic acid and (L) (-)-epicatechin-3-O-gallate. - 208 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Figure 2. Mode of diffusion of the salivary protein fraction on cellulose membranes. When an aliquot of saliva is placed onto the center of an absorbing cellulose disc, radial diffusion occurs. Upon staining with Coomassie blue, a biphasic distribution of the salivary protein is revealed, that is, a non-diffusible protein fraction is surrounded by a diffusible protein fraction (A). When an aliquot of saliva is previously centrifuged, the non-diffusible fraction increase significantly, while the diffusible fraction remains invariable (B). - 209 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Figure 3. Effect of seed extract on salivary proteins difussibility. Solutions of either extracts of seed harvest early (B-I) or seed harvest early (C, D) were mixed with whole saliva in a 15:1 volume ratio and incubated for 5 minutes at room temperature. Previously the seed extract were diluted with water (2.5 %, 5.0 %, 7.5 %, 10 %, 12.5 %, 15.0 %, 17.5 %, and 20 %). Fifteen- l aliquots of the mixtures were placed punctually on a cellulose membrane and allowed to diffuse. The dry membrane was fixed and stained for protein with Coomassie blue. Controls correspond to Figures A and J. Note presence of material particulate (↓). - 210 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Figure 4. Effect of seed extract harvest at February 10th on salivary proteins precipitability. Each diffuse circle was obtained according conditions described in the Figure 3, previous centrifugation of each sample. Mixtures of saliva with water (A) and concentration increase of seed extract (B-I). Below are show eppendorf tubes after centrifugation for each corresponding circle. Note the differential presence of precipitated material compared to its predecessors (↓). - 211 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva Figure 5. Effect of seed extract harvest at May 10th on salivary proteins precipitability. Each diffuse circle was obtained according conditions described in the Figure 3, previous centrifugation of each sample. Mixtures of saliva with water (A) and concentration increase of seed extract (B-I). Below are show eppendorf tubes after centrifugation for each corresponding circle. Note the differential presence of precipitated material compared to its predecessors (↓). - 212 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 Capítulo III Subcapítulo III.3.: Interacción entre taninos de semillas y saliva - 213 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - Capítulo I: Caracterización de la composición fenólica de hollejos y semillas de bayas del cultivar Carménère durante la maduración. El propósito del trabajo presentado en este capítulo, fue caracterizar la composición fenólica de semillas y hollejos del cultivar Carménère (CA) durante el proceso de maduración. Paralelamente se efectuó el mismo análisis en otros cultivares de la familia Carmenets, tales como Merlot (M), Cabernet Franc (CF) y Cabernet Sauvignon (CS). Los cuatro cultivares pertenecían a un mismo predio y fueron manejados técnicamente en forma similar durante la temporada del estudio, lo que permitió apreciar más particularmente la influencia varietal sobre la composición fenólica. Además de algunas similitudes de composición, propias de cultivares pertenecientes a una misma familia, también se observaron claras y evidentes diferencias entre ellos. En algunos casos estas diferencias fueron puntuales entre algunos cultivares y fechas de muestreo, mientras que en otros fueron diferenciadoras entre dos cultivares durante todo el ensayo. Entre ellas destacan: • En algunos muestreos, los extractos de semillas del cultivar CA presentaron diferencias significativas con el cultivar CS en cuanto al contenido de fenoles totales y luminosidad y con el cultivar CF en cromacidad. También hubo diferencias en algunos muestreos entre los cultivares M y CS (tonalidad) y entre CF y CS (contenido de fracción monomérica). Del mismo modo, durante todo el período de maduración, CA presentó diferencias respecto de CF en parámetros como peso de semillas, taninos totales y contenido de fracción polimérica. • Las semillas del cultivar CA se caracterizaron por sus altas concentraciones de procianidinas B1 y B5 durante todo el estudio y de algunas procianidinas galoiladas (B1G, B2G y B4G) en algunos muestreos. Por otra parte, mientras las semillas del cultivar M presentaron altas concentraciones de procianidinas monómericas y algunas procianidinas di y triméricas, las semillas del cultivar CF presentaron altas concentraciones de ácido gálico y otras proantocianidinas galoiladas. • En cuanto a la composición fenólica de los hollejos, el cultivar CA presentó diferencias, en algunos muestreos, con el cultivar CS (peso de hollejos, fenoles totales, taninos totales, antocianos totales y cromacidad) y el cultivar CF (lumninosidad). Paralelamente, se observó que el cultivar CS presentó los mayores valores de fracción monomérica y oligomérica de flavan-3-oles, grado medio de polimerización y peso molecular promedio, en comparación con el resto de los cultivares. • Dentro de los fenoles de bajo peso molecular presentes en hollejos, el cultivar CA presentó las mayores concentraciones de Mgl, Qgr, Kgl e Igl en comparación al resto de los cultivares. - 215 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - En base a las observaciones anteriores y bajo las condiciones del estudio, se puede concluir que existen diferencias en la composición fenólica de semillas y hollejos del cultivar CA y los demás cultivares de la familia Carmenets durante la maduración. Para acotar las diferencias observadas, en la temporada siguiente se realizó un nuevo estudio comparativo sobre la composición fenólica de semillas y hollejos de bayas entre los cultivares CA y CS entre los estados fenológicos de envero y sobremaduración. Este ensayo fue realizado en un Valle distinto, con plantas contiguas, de la misma edad y manejadas vitivinícolamente de forma similar. En este estudio se observó que: • Con respecto de las semillas de CS, las semillas de las bayas de CA presentaron un menor contenido de flavan-3-oles monoméricos y (+)-catequina, mayores contenidos de (-)epicatequina, epicatequina-3-O-galato, ácido gálico, procianidinas diméricas esterificadas con ácido gálico y mayores valores de grado medio de polimerización, porcentaje de galoilación y peso molecular promedio. • Asimismo, con respecto de los hollejos de CS, los hollejos del cultivar CA presentaron mayores contenidos de antocianos totales, fracción monomérica, flavonoides totales, grado medio de polimerización, porcentaje de galoilación, peso molecular promedio e intensidad colorante. Estos antecedentes permiten concluir que las bayas del cultivar Carménère presentaron una composición diferencial de los compuestos fenólicos durante la maduración respecto de las bayas de Cabernet Sauvignon en las condiciones del ensayo. Tomados en conjunto los tres estudios descritos es posible afirmar que, a pesar que no todas las diferencias observadas en años consecutivos entre semillas y hollejos de los cultivares CA y CS fueron consistentes, hubo diferencias en la composición fenólica que se mantuvieron a pesar de realizarse en distintos predios. Entre las diferencias en las semillas de ambos cultivares destacan los contenidos de (-)-epicatequina, epicatequina-3-O-galato, acido gálico, procianidinas diméricas esterificadas con ácido gálico y el porcentaje de galoilación. Entre los hollejos de bayas de ambos cultivares las diferencias más destacadas fueron en los contenidos de antocianos totales y flavonoides totales. - 216 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - Capítulo II. Evaluación de la interacción tanino-proteína. El propósito de este capítulo fue implementar un método de aplicación general para evaluar la interacción tanino-proteína. Para ello se diseñó un método de detección diferencial de proteínas en presencia de taninos sobre un soporte sólido laminar de celulosa. En el estudio, se consideraron dos elementos indicadores de interacción entre taninos y proteínas: por una parte, la inhibición de la difusión de las proteínas sobre la superficie de la lámina de celulosa producida por la presencia de taninos y, por la otra, la detección de precipitación de las proteínas producida por la presencia de taninos. Los ensayos fueron realizados utilizando distintos extractos de taninos enológicos que fueron caracterizados mediante análisis espectrofotométrico, fraccionamiento cromatográfico HPLC-DAD y análisis espectral UV. El método establecido se utilizó para caracterizar el efecto de condiciones generales de interés enológico que pudieran afectar la interacción tanino-proteína, particularmente proteínas salivales humanas, y una eventual relación con la percepción de astringencia. Las observaciones principales de este capítulo fueron: • Se analizó 10 taninos comerciales de uso enológico. Se observó importantes diferencias entre ellos en cuanto a la concentración de fenoles totales y valores de índice de gelatina. Mediante análisis HPLC-DAD fue posible clasificar los distintos productos en relación a sus componentes en: taninos hidrolizables, taninos proantocianidínicos y mezcla de los dos anteriores. En este estudio se observaron notables diferencias entre los resultados del análisis y la información indicada en los rótulos de algunos de los productos comerciales. • El depósito de una alícuota de una suspensión con una proteína hidrofílica (albúmina sérica comercial) sobre un punto en una membrana de celulosa, provoca una difusión radial de la solución y la proteína desde el punto de depósito. La membrana tratada con un colorante de proteínas de alta afinidad (Coomassie blue) permite apreciar que la proteína se distribuye en forma homogénea (modo monofásico de difusión). La presencia de un tanino comercial (ácido tánico) en la suspensión proteica previo al depósito de las muestras sobre el papel afectó la magnitud de la difusión de las proteínas. La intensidad del efecto inhibidor de la difusión de las proteínas fue dependiente de la razón masa de tanino / masa de proteína (Test de difusión). Por otra parte, la centrifugación de tubos con mezclas de taninos y proteínas y la detección de proteínas en alícuotas de los sobrenadantes depositadas sobre láminas de celulosa permitió estudiar la precipitación de proteínas causada por taninos a través de la detección de la desaparición de la proteína desde el sobrenadante. Este ensayo (Test de precipitación) permitió definir un “Punto de Equivalencia”, condición en que ocurre la precipitación total de las proteínas con un mínimo de tanino. • En un tercer ensayo se avaluó la capacidad relativa de dos taninos enológicos comerciales (caracterizados mediante análisis sensorial, espectrofotométrico y HPLC-DAD) para interactuar con gelatina y su relación con la percepción astringencia que de ellos hizo un panel - 217 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - sensorial entrenado. La mayoría de los panelistas reconoció al tanino hidrolizable como más astringente que el proantocinidínico. En este estudio se observó que el tanino más astringente interfirió marcadamente en la difusión de la gelatina sobre las membranas de celulosa pero fue débil en producir la precipitación del complejo tanino-proteína. Por el contrario, el tanino proantocianidínico interfirió la difusión de la gelatina y provocó una fuerte precipitación del complejo. • En dos ensayos se evalúo la contribución de pH y alcohol, dos factores de la composición del vino, cuyos efectos son materia de controversia en cuanto al efecto en la interacción taninoproteína y su relación con la percepción de astringencia. Ambos taninos enológicos fueron percibidos más astringentes por el panel entrenado cuando estaban disueltos en un medio alcohólico (comparado con el acuoso) y en una solución ajustada a pH 3,5 (comparada con una solución a pH 7,0). En el primer caso, el modo bifásico de difusión sobre membranas de celulosa mostrado por las proteínas salivales no fue afectado después de su dilución con agua destilada o bajas concentraciones de etanol. Sin embargo, en soluciones acuosas la presencia de taninos provocó una fuerte restricción de la difusión de las proteínas salivales sobre las láminas de celulosa, la precipitación de proteínas salivales y astringencia. Estos efectos fueron amplificados notablemente cuando el tanino se encontraba disuelto en etanol 13%. Este mismo tipo de efectos se observó cuando se utilizaron comparativamente ambos taninos comerciales a pH 7,0 y 3,5, Bajo esta última condición ocurrió una exacerbación de la percepción de astringencia, interacciones tanino- proteína y precipitación de complejos tanino/proteína. Las observaciones anteriores permiten concluir que la evaluación de las interacciones tanino-proteína a través de la apreciación del efecto de los taninos sobre la difusión de proteínas en membranas de celulosa, así como el uso de éstas para la evaluación de la precipitación de complejos tanino-proteína pueden ser de amplia utilidad en estudios enológicos. El método funciona apropiadamente con extractos de taninos de interés enológico de distinta naturaleza (ácido tánico, taninos proantocianidínicos e hidrolizables) así como con proteínas hidrofílicas puras (albúmina sérica), extractos proteicos complejos (gelatina) y fracción proteica salival. Asimismo, permite romper la sinonimia convencional entre interacción tanino-proteína y precipitación de complejos tanino/proteína. También, permite evaluar la relevancia de variables propiamente enológicas, como el pH y la presencia de etanol, en el ensayo de interacciones tanino-proteína. Finalmente, para distintos tipos de muestras de interés enológico, permitiría hacer en forma objetiva y expedita estudios de asociación entre interacción tanino-proteína y la percepción de astringencia por parte de paneles sensoriales entrenados. - 218 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - Capítulo III. Efecto de los taninos de semillas de Carménère sobre la difusibilidad y precipitabilidad proteína salivales. En esta última etapa del estudio, se realizaron ensayos para evaluar la interacción entre proteínas salivales y taninos presentes en extractos de semillas de bayas del cultivar Carménère de diferente grado de madurez. Con este fin se realizaron ensayos de difusión y precipitación sobre membranas de celulosa y se realizaron estudios de identificación de polifenoles de bajo peso molecular de las semillas que precipitan al interactuar con la saliva. Paralelamente, se efectuaron estudios de asociación con la percepción de astringencia (panel sensorial) de este tipo de extractos obtenidos a partir de semillas Carménère con distinto grado de madurez. Las observaciones más relevantes de estos estudios fueron: • Mediante análisis cromatográfico HPLC-DAD se identificó los compuestos de bajo peso molecular presentes en precipitados formados entre extractos de semillas Carménère y saliva. Para la formación de los complejos tanino-proteínas salivales se diseñó dos tipos de ensayos: un ensayo in vitro en el que taninos y saliva fueron mezclados en un tubo de vidrio y un ensayo in vivo en el que la mezcla se hizo en la cavidad bucal. El ensayo in vitro mostró que a medida que aumenta la relación saliva/tanino los precipitados estuvieron constituidos por cantidades crecientes de monómeros de (+)-catequina, (-)-epicatequina y epicatequina-3-O-galato. Cuando bajo las condiciones del ensayo la participación de la saliva en la mezcla fue máxima, el precipitado estuvo conformado, además de los compuestos antes mencionados, por proantocianidinas diméricas y trímericas. En la condición in vivo también se observó que a mayor relación saliva/tanino ocurría una mayor participación de proantocianidinas de las semillas en los precipitados. Comparativamente, a igualdad de condiciones, los complejos formados in vitro presentaron una mayor cantidad de proantocianidinas comparados con la condición in vivo. • Al evaluar la capacidad de dos extractos de taninos de semillas de bayas Carménère de diferente grado de madurez para interactuar con la fracción proteica de la saliva mediante los ensayos de difusión y precipitación, se observó que a medida que aumenta la relación extracto de semillas/saliva en la mezcla, las proteínas salivales pierden gradualmente su capacidad de difundir y aumenta su precipitación. Para un mismo efecto se necesitó una mayor cantidad del extracto de semillas cosechadas tardíamente que de semillas cosechadas tempranamente. En otras palabras, los taninos de las semillas cosechadas tempranamente fueron mejores inhibidores de la difusión y mejores precipitantes de las proteínas salivales que los taninos de las semillas cosechadas tardíamente. Estas observaciones se asociaron estrechamente con los análisis del panel sensorial entrenado, quienes evaluaron como más astringente al extracto de semillas cercano a envero. - 219 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Conclusiones - Los antecedentes expuestos permiten concluir que el tipo de polifenoles que participan en la interacción tanino-proteínas salivales es altamente dependiente de la concentración relativa de los componentes tanino/saliva en la mezcla y de la naturaleza química de los compuestos presentes en los extractos de taninos. Los monómeros de proantocianidinas serían especies moleculares altamente reactivas con la fracción proteica de la saliva, siendo componentes de los precipitados de complejos tanino-proteínas salivales. Por otra parte, con el transcurso de la maduración, los extractos de semillas Carménère pierden progresivamente su reactividad con las proteínas salivales, proceso objetivo que se asocia a una progresiva pérdida de la astringencia evaluada sensorialmente. CONCLUSIÓN GENERAL Tomadas en conjunto las observaciones alcanzadas en las tres etapas de la tesis, es posible concluir que la composición fenólica de las bayas del cultivar Carménère cambia durante la maduración. Estas variaciones afectan la capacidad de interacción de las proantocianidinas de la baya con las proteínas salivales, afectando así la percepción de astringencia. Lo anteriormente expuesto, sería la causa de la disminución de la sensación de astringencia de las bayas durante la maduración. - 220 - UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN FENÓLICA DE UVAS DEL CULTIVAR CARMÉNÈRE Y SU RELACIÓN CON LA SENSACIÓN DE ASTRIGENCIA ISBN:978-84-693-6430-7/DL:T-1632-2010 - Referencias - Adams, D. Phenolics and ripening in grape berries. Am. J. Enol. Vitic. 2006, 57 (3), 249-256. Arnold, R.; Noble, A.; Singleton, V. Bitterness and astringency of phenolic fractions in wine. J. Agric. Food Chem. 1980, 28, 675-678. 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