Caracterización funcional de la vía Wnt/catenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje anteroposterior durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea Marta Iglesias García ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author. FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE DOCTORADO DE GENÉTICA Caracterización funcional de la vía Wnt/βcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje anteroposterior durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea Memoria presentada por MARTA IGLESIAS GARCIA Para obtener el grado de Doctora por la Universidad de Barcelona Tesis doctoral realizada bajo la dirección de los Drs. Emili Saló i Boix y Teresa Adell Creixell en el Departamento de Genética de la Facultad de Biología de la Universidad de Barcelona Firmado, Firmado, Los directores: La doctoranda, Dr. Emili Saló i Boix Teresa Adell Creixell Marta Iglesias Garcia Barcelona, 30 Octubre de 2015 ÍNDICE         INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 Capítulo 1. La vía Wnt/βcatenina .................................................................................... 5 1.1 La βcatenina ............................................................................................................ 8 1.2 La Axina ................................................................................................................... 9 Capitulo 2. El establecimiento de organizadores y de la polaridad del eje primario .............................................................................................................. 11 2.1 Diversos mecanismos regulan el establecimiento de la polaridad ........................ 12 Modelización de la formación y auto-regulación del patrón corporal ........................... 14 2.2 La vía Wnt/βcatenina establece la polaridad del eje primario durante el desarrollo embrionario ................................................................................................. 16 Procesos aguas arriba que activan asimétricamente la vía Wnt/βcatenina ................. 19 Establecimiento de regiones organizadoras y la polaridad en Xenopus ..................... 20 2.3 La vía Wnt/βcatenina restablece la polaridad del eje primario durante el desarrollo post-embrionario ......................................................................................... 22 Procesos aguas arriba que activan asimétricamente la vía Wnt/βcatenina ................. 24 Capítulo 3. Elaboración del patrón a lo largo del eje primario .................................. 27 3.1 Modelos teóricos de formación del patrón ............................................................. 27 3.2 Funciones tardías de la vía Wnt en la formación del patrón del eje primario ........ 29 Desarrollo y crecimiento de la parte posterior en bilaterales ....................................... 30 Especificación regional del neuroectodermo y desarrollo de la cabeza en bilaterales ..................................................................................................................... 31 Divisiones asimétricas en C. elegans y Platynereis ..................................................... 34 Desarrollo del eje oral-aboral de cnidarios .................................................................. 34 Capítulo 4. Mantenimiento del eje primario: crecimiento y homeostasis ................ 35 Capítulo 5. La planaria como organismo modelo para el estudio del restablecimiento y mantenimiento del eje AP ............................................................. 37 5.1 Biología de las planarias ........................................................................................ 39 Morfología general ....................................................................................................... 39 Reproducción ............................................................................................................... 41 5.2 Plasticidad morfológica .......................................................................................... 42 Las células madre de la planaria: los neoblastos ........................................................ 45 Capítulo 6. La regeneración en planarias .................................................................... 49 6.1 Respuesta a la herida y estímulos de la regeneración .......................................... 50 6.2 Restauración del patrón corporal ........................................................................... 51 Restablecimiento de la polaridad AP ........................................................................... 53 6.3 Dinámicas de proliferación y muerte celular .......................................................... 55 Capítulo 7. Regeneración del Sistema Nervioso Central anterior ............................ 59 Capítulo 8. La vía Wnt en planarias ............................................................................. 61 OBJETIVOS ......................................................................................................... 65 RESULTADOS ..................................................................................................... 69 Informe de los directores sobre la participación de la doctoranda y el índice de impacto de las publicaciones ....................................................................................... 71 Artículo 1: Silencing of Smed-βcatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians ....................................................................................................................... 75 Resumen en castellano ............................................................................................... 77 Artículo ......................................................................................................................... 79 Material Suplementario ................................................................................................ 87 Artículo 2: Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/βcatenin pathway ........................................................ 93 Resumen en castellano ............................................................................................... 95 Artículo ......................................................................................................................... 97 Material suplementario ............................................................................................... 109   DISCUSIÓN ........................................................................................................ 125 1. Conservación de los elementos de la vía de señalización Wnt/βcatenina en planarias ....................................................................................................................... 128 1.1 Los ligandos y antagonistas extracelulares de la vía Wnt ................................... 129 1.2 La βcatenina ........................................................................................................ 130 1.3 La Axina ............................................................................................................... 131 2. La vía Wnt/βcatenina controla la polaridad Antero-Posterior de regeneración en planaria .................................................................................................................... 133 2.1¿Qué mecanismo activa asimétricamente la vía Wnt/bcatenina y establece la polaridad de regeneración? ....................................................................................... 135 2.2 Integración de los mecanismos y vías de señalización que controlan la polaridad AP de regeneración ................................................................................... 137 La vía Wnt/βcatenina controla la polaridad AP de regeneración sujeta a un gradiente de señalización preexistente ...................................................................... 139 El potencial de membrana y la señalización por calcio regulan la polaridad de regeneración de manera antagónica a la vía Wnt/βcatenina ..................................... 141 Señales nerviosas de largo alcance y las GJC controlan la polaridad regenerativa en sinergia con la vía Wnt/βcatenina ......................................................................... 144 2.3 La polaridad inicial del SNC es independiente de la polaridad que adopte el blastema tras manipular la vía Wnt/βcatenina ........................................................... 145 3. La vía Wnt/βcatenina y la elaboración del patrón a lo largo del eje AP en planarias ....................................................................................................................... 148 3.1 La vía Wnt/βcatenina y la regeneración de la cola .............................................. 149 3.2 La vía Wnt/βcatenina y la regeneración de la cabeza ......................................... 150 3.3 La vía Wnt/βcatenina es esencial para restaurar todo el eje AP ......................... 152 4. Mantenimiento del eje AP durante la homeostasis .............................................. 154 5. Hipotético modelo del papel de la vía Wnt/βcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje AP ........................................................................................... 155   CONCLUSIONES .............................................................................................. 169 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 173 ANEXOS ............................................................................................................ 189 Anexo 1 ......................................................................................................................... 191 Anexo 2 ......................................................................................................................... 192 Anexo 3 ......................................................................................................................... 193 Anexo 4 ......................................................................................................................... 195 Resumen castellano .................................................................................................. 197 Artículo 3 .................................................................................................................... 199   INTRODUCCIÓN A pesar de la inmensa diversidad morfológica animal, todos los organismos bilaterales nos caracterizamos por tener un eje longitudinal anteroposterior (AP), uno dorsoventral (DV) ortogonal a éste, así como el derecho-izquierdo que se intercala entre ellos (figura 1). Estos ejes definen un sistema de coordenadas cartesianas que determina dónde se forman los diferentes órganos y estructuras corporales. Por ejemplo, el sistema nervioso presenta frecuentemente estructuras centralizadas en el polo anterior –el cerebro–, y en un dominio localizado en el polo dorsal de vertebrados o ventral de invertebrados (concepto de la inversión del eje DV (Arendt et al., 2008). D’Arcy Thompson propuso que cambios en este sistema cartesiano podría subyacer a la evolución de las distintas formas corporales observadas (figura 2) (Niehrs, 2010; Thompson, 1917). Los ejes corporales regionalizan los organismos y son la base de su plan corporal, y por tanto, saber como se forman es esencial para entender la diversidad animal (De Robertis, 2008; Finnerty, 2003; Martindale, 2005; Niehrs, 2010). Los ejes corporales se forman típicamente durante el desarrollo embrionario de cada organismo. Sin embargo, durante la homeostasis de un organismo adulto también es necesario que esa Figura 1. Plan corporal de los organismos bilaterales. Imagen extraída de https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/ 3/34/Anatomical_Directions_and_Axes. Figura 2. Evolución morfológica de los animales por la transformación de un sistema de coordenadas Cartesianas. Transformación del plan corporal del pez Diodon (A) en la especie estrechamente relacionada Orthagoricus (B). De Niehrs, 2010). 3 información posicional esencial se mantenga, y en aquellos organismos adultos que poseen la capacidad de regenerar partes perdidas del cuerpo o reproducirse asexualmente, que se restablezca. Así pues, ¿cómo de conservados están los mecanismos celulares y moleculares de formación de los ejes corporales en la filogenia animal? ¿Y en los distintos contextos del desarrollo dónde se requieren? El objetivo general de esta tesis doctoral es contribuir a una mayor comprensión de estas preguntas fundamentales de la biología del desarrollo. Puesto que durante el desarrollo embrionario de la mayoría de animales estudiados, así como durante la regeneración de cnidarios, la vía Wnt/βcatenina tiene una función clave en la formación del eje primario del cuerpo, el objetivo concreto de esta tesis doctoral es caracterizar el papel de la vía Wnt/βcatenina en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria Schmidtea mediterranea (Platelmintos). A continuación voy a introducir cuál era el conocimiento previo al inicio de este trabajo sobre la función de la vía Wnt/βcatenina en la formación del eje primario, y posteriormente voy a presentar la planaria S.mediterranea como organismo modelo para el estudio de la formación del eje AP en un contexto post-embrionario. Antes sin embargo, debo aclarar el término “eje primario” y los diferentes procesos involucrados en su formación para justificar el hilo conductor de esta introducción. La formación del eje corporal primario El eje primario del cuerpo, también conocido como eje anteroposterior (AP), rostro- caudal (cabeza-cola en cordados), u oral-aboral en metazoos, es definido clásicamente por la dirección de movimiento del animal, con el polo anterior/aboral al frente y el posterior/oral detrás (Martindale, 2005; Niehrs, 2010). En la mayoría de animales, el eje primario se forma de manera gradual por crecimiento y regionalización celular. Durante este proceso, uno de los primeros eventos que es clave es el establecimiento temprano de una región organizadora en un polo del organismo en desarrollo. A posteriori, estos centros señalizadores primarios organizan el plan corporal y el desarrollo subsecuente del eje primario en embriones (Martindale and Hejnol, 2009), o durante el desarrollo post-embrionario de hidras adultas (Guder et al., 2006a; Lee et al., 2006). Por motivos prácticos, la introducción relacionada con la formación del eje primario ha sido estructurada en diferentes apartados que reflejan la temporalidad de estos acontecimientos: (i) el establecimiento de organizadores y de la polaridad del eje primario y, (ii) la posterior elaboración del eje primario; así como, (iii) el mantenimiento del eje durante el crecimiento y homeostasis. 4 Introducción Capítulo 1 La vía Wnt/βcatenina La información relativa a este apartado proviene principalmente de los siguientes artículos científicos: (Croce and McClay, 2008; Logan and Nusse, 2004; MacDonald et al., 2009; van Amerongen and Nusse, 2009; Wodarz and Nusse, 1998) El nombre de “Wnt” deriva de la combinación de dos genes que a posteriori fueron descritos como homólogos: el gen wingless de Drosophila, implicado en la polaridad de segmentos, y el gen int1 (renombrado Wnt1) de ratones, originariamente clonado como un proto-oncogen. Desde su identificación a finales de 1970, se han clonado más de 100 genes Wnt que se agrupan en un total de 13 subfamilias (Wnt1 a Wnt11, Wnt16 y WntA), doce de ellas ya presentes en cnidarios. Fuera de los metazoos no se han identificado Wnts, indicando que aparecieron con la multicelularidad durante la evolución. Estos genes codifican para una familia de glicoproteínas secretadas que actúan como moléculas de comunicación intercelular durante el desarrollo de metazoos. De hecho, las proteínas de tipo Wnt son ligandos extracelulares que pueden dar lugar a gradientes morfogenéticos e inducir diferentes respuestas celulares dependiendo de la concentración local. Clásicamente los genes Wnt se han agrupado en dos clases funcionales que reflejan las diferentes cascadas de transducción que activan. Los miembros de la clase Wnt-8 (entre ellos Wnt-1 y Wnt-3) actúan a través de la vía Wnt canónica o dependiente de βcatenina, inducen un eje AP secundario cuando son inyectados en los blastómeros ventrales de embriones de Xenopus y son capaces de transformar cultivos de células epiteliales de mamífero. Por el contrario, los miembros que no tienen estas capacidades son de la clase Wnt-5a (entre ellos Wnt-4 y Wnt-11) y actúan independiente de 5 βcatenina. Esta última clase, al ser inyectados en Xenopus afectan los movimientos morfogenéticos y pueden antagonizar los miembros de la clase Wnt-8. La vía Wnt no canónica se divide además en la vía Wnt de la polaridad celular plana (PCP), conocida por controlar los movimientos de convergencia y extensión asociados con la gastrulación y neurulación, la vía de Wnt/calcio y la vía de Wnt/Ror2. En todas estas vías independientes de βcatenina encontramos componentes intracelulares exclusivos que transducen la señal Wnt, pero en general, todas ellas están involucradas en regular las dinámicas del citoesqueleto y adhesión celular. No obstante, es importante remarcar tres aspectos importantes de estas clasificaciones. Primero, la clasificación de los Wnts en canónicos o no canónicos no es absoluta, sino que la habilidad que tienen de activar una vía u otra depende del contexto celular. Por ejemplo, en embriones de Xenopus, Wnt-11 media tempranamente la especificación de los ejes a través de activar la βCATENINA, pero también es necesario para activar la vía no canónica durante los movimientos de convergencia y extensión que tienen lugar durante la gastrulación. Segundo, la vía Wnt/βcatenina puede activarse por otros ligandos como Norrin. Y tercero, las vías de Wnt no pueden entenderse como vías lineales, sino que están interrelacionadas y comparten muchos componentes intracelulares. Por tanto, es más preciso hablar de la red génica de Wnt (aunque para simplificar seguiré nombrándola vía) (figura 3). Red, que está involucrada en coordinar el complejo comportamiento de las células durante el desarrollo animal, donde a grandes rasgos, la señalización por Wnts dependiente de βcatenina controla el destino y proliferación celular, y la independiente modula la forma de los tejidos y células. La vía Wnt más estudiada y objeto de estudio de la presente tesis doctoral es la canónica. Según el modelo más aceptado, ésta depende de la regulación de los niveles citosólicos de la proteína βCATENINA. De manera global, en ausencia de señal Wnt, la Figura 3. Red de señalización de Wnt. Diferentes familias de wnts (amarillo o azul) transducen la señal a través de la vía canónica (βcatenina) o a través de diferentes vías independientes de βcatenina (JNK, Calcio o Src), pero todas estas vías están relacionadas a diferentes niveles y mútuamente se regulan (flechas dobles). En verde y rojo diferentes moduladores de la señal Wnt en la membrana. De (van Amerongen and Nusse, 2009). 6 Introducción βCATENINA citosólica es conducida a la degradación por un complejo multi-proteico conocido como complejo de destrucción de la βCATENINA o complejo de la Axina, que incluye los supresores de tumores Axina y Adenomatous Polyposis Coli (APC), las Serina/Treonina kinasas GSK-3beta y CK1, y la E3-ubiquitina ligasa β-TrCP/Slimb. El andamiaje de este complejo por la Axina facilita que las kinasas fosforilen la βCATENINA en su extremo amino-terminal, marca que la β -TrCP reconoce y ubiquitiniza para que el proteosoma degrade la βCATENINA. La vía se activa por la interacción del ligando Wnt con el receptor primario de la vía Frizzled (Fz) y con el co- receptor de la familia de lipoproteínas de baja densidad (LRP) que es exclusivo de la vía Wnt canónica. La interacción Wnt-Fz-LRP recluta la proteína de andamiaje Dishevelled (Dsh) a la membrana y esta a su vez a la Axina. Estos eventos inhiben el complejo de destrucción de la βCATENINA y estabilizan los niveles de βCATENINA en el citoplasma, la cual se acumula y es translocada al núcleo. Una vez en el núcleo, la βCATENINA interacciona con los factores de transcripción de la familia TCF/LEF y regula la transcripción de genes diana (figura 4). En condiciones fisiológicas, la vía Wnt/βcatenina es mucho más compleja que el esquema de la figura 4 y la actividad de la βCATENINA como co-activador transcripcional está regulada a diferentes niveles y por muchos más componentes. Por ejemplo, a nivel extracelular la vía Wnt es antagonizada por diferentes inhibidores secretados que actúan a nivel de los ligandos, como los miembros de la familia de proteínas secretadas relacionadas con los Frizzled (sFRP), la proteína inhibidora de Wnt (WIF) y Cerberus. Dickkopf (Dkk) es otro antagonista secretado más específico de la vía Wnt/βcatenina al actuar a nivel de LRP. A nivel nuclear también se han descrito diferentes factores que pueden regular la especificidad de los genes diana (p.ej. diferentes isoformas de TCF), o bien antagonizar su actividad (p. ej. Chibby o Nemo- Like Kinase, NLK). NLK es un ejemplo además, de mecanismo de inhibición mediado por la vía Wnt/calcio no canónica (Sugimura and Li, 2010). Figura4. Esquema simplificado de la vía Wnt/βcatenina. En ausencia (A) o presencia (B) de la señal Wnt (detalles en el texto). De (MacDonald et al., 2009) 7 La vía Wnt/bcatenina La vía Wnt/βcatenina regula muchos procesos del desarrollo (proliferación, especificación del destino celular, diferenciación, etc.) durante toda la vida del animal y por tanto, los genes diana que regula son diversos y específicos del contexto celular (para una lista actualizada de los genes diana descrita véase:: http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/). Entre los genes que regula encontramos muchos componentes agonistas (wnts, fz, LRP, etc.) y antagonistas (dkk, axin-2 de vertebrados, naked etc.) de la misma vía Wnt, indicando que la retroalimentación es un importante nivel de control (figura 3). Esta autorregulación puede contribuir a modular el gradiente morfogenético de Wnt y la competencia de las células a responder a él. Además, es específica del contexto celular, lo que incrementa la complejidad en el control de la intensidad y duración de la señalización Wnt. No obstante, axin-2 de vertebrados y naked (antagonista de Dsh) de Drosophila melanogaster parece que representan genes diana de la vía Wnt/βcatenina universales (no dependen del contexto celular). Algunas familias génicas como Cerberus, Dkk y Wnt3 se han perdido en el linaje de los protóstomos, pero en general, los componentes de la vía Wnt/βcatenina están altamente conservados a lo largo de la escala animal. Sorprendentemente, también podemos trazar hasta la ameba Dictyostelium discoideum homólogos de algunos componentes intracelulares como GSK3 y βcatenina, que tienen una función relacionada con la vía Wnt/βcatenina de metazoos. Dado que los elementos de la vía analizados en la presente tesis son la βcatenina y la Axina, a continuación paso a describirlos en mayor detalle. 1.1 La βcatenina En la gran mayoría de animales se ha descrito un único ortólogo de βcatenina que codifica para una proteína bifuncional altamente conservada. Por un lado, la podemos encontrar en la membrana celular mediando las uniones adherentes, y por otro, en el núcleo realizando una función clave en la vía de transducción de la señal Wnt como co- activador transcripcional (figura 5a). La función de adhesión depende principalmente de la interacción con las cadherinas y la α -catenina, mientras que la de señalización depende de la interacción con los componentes del complejo de destrucción y con los factores de transcripción TCF/LEF1 (Nelson and Nusse, 2004). Los residuos aminoacídicos de la βCATENINA involucrados con esta doble funcionalidad están bien descritos y conservados, tal y como muestra la figura 5b. 8 Introducción Sin embargo, se han descrito linajes con más de un parálogo de la βcatenina y con funciones y dominios divergentes. Por ejemplo, el nemátodo Caenorhabditis elegans tiene una vía Wnt muy divergente con 4 βcateninas (BAR-1, HMP-1,WRM-1 y SYS-1). Se ha descrito que BAR-1 solo está involucrada en la señalización Wnt, HMP-2 solo está involucrada en adhesión celular, WRM-1 tiene una función en señalización modificada, y SYS-1 - la última βcatenina identificada - funciona en señalización y parece estar especializada en controlar las divisiones asimétricas (Jackson and Eisenmann, 2012; Korswagen, 2002; Liu et al., 2008). En el caso de cordados encontramos una β catenina con las dos funciones conservadas y la Plakoglobina, la cual tiene una función en adhesión modificada en desmosomas. A partir de estos datos Schneider y colaboradores han postulado que, a partir de una βcatenina bifuncional presente en el ancestro común de los metazoos, diferentes eventos de duplicación génica facilitaron la evolución de βcateninas con funciones nuevas o monofuncionales (Schneider et al., 2003) 1.2 La Axina La Axina es un inhibidor muy conservado de la vía Wnt/βcatenina que fue identificado originalmente en ratones como Fused, pero renombrado como tal (axis inhibition) por su capacidad de inhibir la especificación de los ejes en anfibios y mamíferos (Zeng et al., 1997). Como se ha mencionado anteriormente, la Axina funciona como proteína de andamiaje del complejo de destrucción de la βCATENINA y estructuralmente presenta varios dominios de interacción con los componentes de la vía Figura 5. Bifuncionalidad de la βCATENINA. (a) Por un lado la βCATENINA media las uniones adherentes interaccionando con la α-catenina y la cadherinas de membrana, y por el otro, la transducción de la señal Wnt al núcleo como co-activador transcripcional de los tcf. (b) Dominios estructurales de la βCATENINA. En rojo los residuos implicados en la señalización Wnt, y en azul los involucrados en la función de adhesión. (a) (Nelson and Nusse, 2004) (b) De (Schneider et al., 2003)   9 La vía Wnt/bcatenina Wnt. En particular, se caracteriza por poseer un dominio RGS (reguladores de la señalización por proteínas G) en su extremo N-terminal, y un dominio DIX (dominio homólogo en dishevelled y axin) en su extremo C-terminal que es necesario para formar homodímeros o interactuar con Dsh (Luo and Lin, 2004). Como en el caso de βcatenina, se ha descrito un único ortólogo para axina en la mayoría de animales a excepción de vertebrados y C.elegans. Los vertebrados presentan dos parálogos funcionalmente equivalentes, axin-1 y axin-2 o conductin/axil. Sin embargo, estos no son totalmente redundantes en experimentos in vivo, quizás relacionado con sus patrones de expresión diferentes: axin-1 se expresa ubicuamente, mientras que axin-2 es un gen diana de la misma vía que se expresa en dominios más restringidos (Chia and Costantini, 2005; Jho et al., 2002). C. elegans presenta dos parálogos para la Axina muy divergentes pero con la función conservada de inhibir la vía Wnt canónica (PRY-1 y AXL-1). Ambos parálogos tienen funciones redundantes y específicas ahí donde sus patrones de expresión no se solapan, pero a diferencia de los parálogos de vertebrados, tienen diferentes eficiencias de inhibición de BAR-1/βcatenina (Korswagen et al., 2002; Oosterveen et al., 2007). 10 Introducción Capitulo 2 El establecimiento de organizadores y de la polaridad del eje primario El eje primario del organismo adulto o larva está íntimamente relacionado con el eje animal-vegetal del embrión (el polo animal es el marcado por los cuerpos polares que resultan de las divisiones meióticas del oocito) y el sitio donde se forma el endomesodermo durante la gastrulación (Goldstein and Freeman, 1997; Martindale, 2005). En general, la especificación del endomesodermo (las células que formarán los tejidos internos del embrión) ocurre en el polo vegetal en bilaterales y establece la parte posterior del animal adulto, mientras que en los animales no-bilaterales tiene lugar en el polo animal y establece el futuro polo oral (p. ej. cnidarios y ctenoforos) (Martindale, 2005; Martindale and Hejnol, 2009). El proceso de internalización de estas células se conoce como gastrulación, y es un evento crítico en el establecimiento del patrón corporal de cada embrión, y por extensión, en el establecimiento del eje primario. En la mayor parte de organismos, la gastrulación involucra la formación de un blastoporo, una abertura embrionaria transitoria a través de la que se internaliza el endomesodermo. En muchos casos, entorno al blastoporo se sitúan células con capacidad organizadora que controlan el desarrollo subsecuente del plan corporal (apartado 3.2) (Martindale and Hejnol, 2009). Durante el desarrollo post-embrionario, se ha definido el hipostoma de hidra (modelo clásico en estudios de restauración del patrón corporal; apartado 2.3) como la región oral del organismo adulto con capacidades organizadoras durante la regeneración equivalentes al blastoporo del embrión (Guder et al., 2006a; Lee et al., 2006). Estos datos indican que la formación de organizadores primarios como el blastoporo o el hipostoma, es una característica en común para formar el eje primario a lo largo de la escala animal y en diferentes contextos del desarrollo (Niehrs, 2010). 11 2.1 Diversos mecanismos regulan el establecimiento de la polaridad En muchos casos, la polaridad del eje primario es especificada antes que se establezca el sitio de gastrulación o el hipostoma durante el desarrollo, y los mecanismos físicos involucrados pueden ser muy diferentes (Burton and Finnerty, 2009; Goldstein and Freeman, 1997). Así, fruto de la oogenesis, muchos organismos poseen asimetrías preexistentes en el huevo que son suficientes para especificar la polaridad del eje primario (Goldstein and Freeman, 1997). El caso más estudiado es, sin duda, el de D. melanogaster, donde un mecanismo basado en gradientes de genes o factores maternales establece la polaridad inicial. En otros organismos, el eje primario se especifica después de la fertilización con el sitio de entrada del espermatozoide; ya sea a través de desencadenar una reorganización polarizada de componentes maternales previamente distribuidos homogéneamente (C. elegans), o asimétricamente (Xenopus laevis). Estos mecanismos tempranos que rompen la simetría del huevo condicionan en gran medida cómo se determina la polaridad del eje primario. Por ejemplo, una vez el espermatozoide especifica la polaridad del oocyto en el nemátodo C. elegans, ésta determina y fija inmediatamente la polaridad del eje primario del embrión; el organismo en desarrollo no es capaz de adaptarse y reformar el eje si éste se altera. A este tipo de desarrollo se le denomina desarrollo determinado o en mosaico. No obstante, en un buen número de animales el establecimiento de la polaridad del eje primario está condicionada a mecanismos celulares extrínsecos y por tanto, el organismo en desarrollo es capaz de reformar el patrón corporal si éste es alterado (Gilbert, 2013; Wolpert et al., 2015). Es lo que se conoce como desarrollo regulativo y es el modo más común de formación del patrón corporal y del eje primario durante el desarrollo embrionario. Así por ejemplo, si los blastómeros de un embrión de erizo de mar son separados en el estadio de cuatro células, cada uno de ellos dará lugar a una larva pluteus perfecta (Figura 6a). Otro ejemplo impresionante de auto-regulación del patrón corporal lo encontramos en embriones de anfibios (Figura 6b), o en el desarrollo de gemelos idénticos en humanos (De Robertis, 2006; De Robertis, 2009). 12 Introducción El establecimiento de la polaridad del eje primario durante la regeneración o reproducción asexual tiene lugar en un contexto celular y del desarrollo muy diferente. Primero, los estímulos externos que desencadenan la regeneración y promueven el (r)establecimiento del eje primario (p. ej. una lesión) no son los mismos que durante la embriogénesis, o la reproducción asexual. Y segundo, la polaridad se restablece en un organismo adulto que tiene su patrón corporal ya formado por miles de células (Burton and Finnerty, 2009). Sin embargo, el conocimiento que tenemos hoy en día de cómo estos estímulos externos desencadenan el restablecimiento de la polaridad del eje primario durante el desarrollo post-embrionario, es escaso. Los modelos de formación del patrón abogan por un mecanismo basado en gradientes de señalización preexistentes en el organismo adulto que, al ser perturbados (daño que conlleva a la regeneración de un fragmento del eje primario, o crecimiento y reproducción asexual) regulan la polaridad axial. De hecho, la regeneración es otro fenómeno de desarrollo regulativo, o auto-regulación del patrón corporal, que se manifiesta durante la vida adulta (figura 6c). Figura 6. Regulación del patrón corporal. (a) Dibujo representativo comparando una larva pluteus de erizo de mar con las cuatro larvas que se obtienen si se separan los primeros cuatro blastómeros del embrión. (b) Dos mitades de una blástula de Xenopus son capaces de regenerar la mitad que falta siempre y cuando ambos fragmentos retengan tejido del organizador de Spemann-Mangold. Imágenes a la misma escala de un renacuajo normal arriba, y de los gemelos que se obtienen de la misma blástula abajo. (c) Regeneración de todo el cuerpo a partir de prácticamente cualquier pequeño fragmento de una planaria adulta. (a-b) De (De Robertis, 2009); (c) Extraído de la página web del grupo de Agata. 13 El establecimiento de organizadores y de la polaridad Modelización de la formación y auto-regulación del patrón corporal La regulación del patrón corporal depende de señales inductivas entre células y la competencia de éstas a responder diferencialmente con un programa génico de formación del patrón. Estas señales morfogenéticas pueden ser moléculas localizadas en la superficie de las células que se transmiten por contacto celular, y por tanto son de corto alcance; o moléculas solubles y difusibles llamadas morfógenos (Turing, 1952), cuya acción puede ser de largo alcance a través de distribuirse de célula-célula directamente (por conexiones como argosomas o uniones tipo GAP) o indirectamente por medio de su secreción y difusión (Tabata and Takei, 2004; Wolpert et al., 2015) El concepto de gradientes de señalización para explicar la regulación del patrón corporal fue propuesto por primera vez en las planarias de agua dulce (Adell et al., 2010; Morgan, 1904). Al igual que las hidras, estos organismos son un modelo clásico en estudios de restauración del patrón y son conocidos por su capacidad de regenerar invariablemente una cabeza en las heridas anteriores, y una cola en las posteriores (fenómeno conocido como polaridad regenerativa) (Allman, 1864; Morgan, 1901). Sin embargo, Morgan observó (Morgan, 1898) que si se amputaba transversalmente un fragmento muy pequeño del centro de la planaria, éste regeneraba ocasionalmente heteromorfos con dos cabezas (“Janus heads”). Esta y otras observaciones en planarias (véase apartado 6.2) condujeron a Morgan a sugerir que la polaridad regenerativa está bajo control de un gradiente estructural a lo largo del eje AP o de substancias producidas por la cabeza (Morgan, 1905). Así, cuando se amputa la cabeza y la cola de una planaria, la concentración del hipotético gradiente de señalización preexistente en el sitio de la herida especifica la polaridad axial del fragmento regenerante (por encima o por debajo de un umbral se regenerará una cabeza o una cola) (Figura 7a). Sin embargo, si el fragmento regenerante es muy pequeño, las diferencias de concentración del gradiente entre la herida anterior y la posterior son escasas, el gradiente no se detecta y se regeneran dos cabezas (janus heads) (Figura 7b). No obstante, un gradiente de señalización simple como éste no es capaz de explicar todas las observaciones conocidas sobre la regeneración de las planarias. Por ejemplo, fragmentos que resultan del mismo plano de amputación (figura 7a a nivel de P1), regenerarán una cabeza o una cola dependiendo del tejido preexistente; además, debe partir de la necesidad de asimetrías iniciales u organizadores que establezcan dichos gradientes. 14 Introducción Uno de los modelos matemáticos que mejor explica la auto-regulación del patrón corporal y otros patrones observados en sistemas biológicos es el que se basa en el mecanismo de reacción y difusión de substancias solubles de Alan Turing (1952) (Gierer and Meinhardt, 1972; Meinhardt, 2008). El modelo de Gierer-Meinhardt (1972) postula que solo es necesario una reacción local de auto-activación acoplada a otra antagónica que difunde más rápido para que un patrón o eje corporal pueda auto-regularse, e incluso auto-organizarse a partir de situaciones iniciales homogéneas. Un prototipo de tal reacción de formación del patrón consiste en un morfógeno de corto alcance, el activador, que promueve – directa o indirectamente – su propia producción, y la de su antagonista que difunde más rápido, el inhibidor. Una reacción de formación del patrón como tal conlleva a la localización asimétrica del activador e inhibidor en los polos opuestos de un eje o región, y establece regiones organizadoras que dirigen la formación del patrón, de tal manera, que el sistema se auto-regula (figura 8). De manera importante, es necesario cierta distancia o tejido para que la reacción de formación del patrón tenga lugar (p.ej. janus heads de Morgan) (Meinhardt, 2008; Meinhardt, 2009). Este modelo no es solo teórico, sino que encaja por ejemplo con las interacciones descritas entre Nodal y Lefty2 en la formación del eje izquierda-derecha en embriones de erizo de mar (Duboc et al., 2008), o con la regulación opuesta de los organizadores de BMP y ADMP en la regulación del eje dorso-ventral (figura 8i). Este último mecanismo, se ha descrito en embriones de anfibios (De Robertis, 2006; De Robertis, 2009; Reversade and De Robertis, 2005), y más recientemente también se ha demostrado que subyace la regeneración del eje dorso-ventral en planarias (Gavino and Reddien, 2011; Molina et al., 2011). Figura 7. Restablecimiento de la polaridad de planarias según un modelo de gradientes de señalización. (a) Fragmentos del cuerpo de una planaria regeneran manteniendo la polaridad original de acuerdo con la concentración local del morfógeno en la zona de la herida. (b) Un fragmento muy fino del cuerpo de la planaria es incapaz de detectar el gradiente y regenera dos cabezas. Adaptado de (Gilbert, 2013; Lobo et al., 2012)   15 El establecimiento de organizadores y de la polaridad 2.2 La vía Wnt/βcatenina establece la polaridad del eje primario durante el desarrollo embrionario La información relativa a este apartado ha sido extraída principalmente de los siguientes artículos científicos: (Croce and McClay, 2006; Holland, 2000; Niehrs, 2010; Petersen and Reddien, 2009) A pesar de que los mecanismos físicos que desencadenan el establecimiento de la polaridad axial pueden ser muy diferentes entre animales, en la mayoría de animales estudiados éstos convergen en activar asimétricamente las mismas vías de señalización en un polo del organismo en desarrollo. La vía de señalización de BMP (Bone Morphogenic Protein) tiene una función muy conservada en la formación del eje DV durante el desarrollo embrionario de bilaterales (De Robertis, 2006; Molina, 2011 - Tesis Doctoral). Esta función de la vía de BMP no se limita al desarrollo embrionario, sino que también se ha visto conservada en los últimos años en la regeneración y homeostasis de planarias (Gavino and Reddien, 2011; Molina et al., 2011). Por otro lado, en la gran mayoría de embriones de eumetazoos, las asimetrías iniciales que desencadenan el establecimiento del eje primario acaban convergiendo en la activación de la vía de señalización de Wnt/βcatenina en el futuro polo posterior u oral (Niehrs, 2010; Petersen and Reddien, 2009). Figura 8. Auto-regulación y auto-organización de patrones biológicos por un sistema de reacción-difusión de moléculas solubles activadoras e inhibidoras. (a) Esquema de la reacción: el activador promueve su propia producción y la de su inhibidor que difunde más rápidamente. (b) La distribución de ambas substancias es inestable y pequeñas fluctuaciones desencadena que el activador se localice de forma asimétrica en un polo de un eje. La distribución polar del activador e inhibidor pueden ser interpretados como una señal morfogenética y dirigir la formación del patrón a lo largo de un eje. (c-d) Ejemplo de formación del eje izquierda-derecha en embriones de erizo de mar por la interacción entre el activador Nodal (c) e inhibidor Lefty (d). (e-h) Regeneración del patrón ante una perturbación. Después de la fragmentación, el inhibidor remanente decae en la parte con bajos niveles de activador (e) hasta que desaparece (f) y se desencadena un nuevo pico del activador (g). El patrón se restaura al promover la producción de nuevo del inhibidor que difunde más rápidamente (h). (i) La regulación transcripcional opuesta de los organizadores de BMP y ADMP auto-regula el eje DV en embriones de Xenopus (izquierda) y planarias adultas (derecha). (a-h) De (Meinhardt, 2009); (i) De (Gavino and Reddien, 2011). 16 Introducción En general, la activación de la vía Wnt/βcatenina es necesaria para el desarrollo del tronco y la cola de metazoos, y su represión para el desarrollo de la cabeza. Así lo sugieren los patrones de expresión de diferentes componentes de la vía Wnt (figura 9), y lo demuestran los diferentes fenotipos de pérdida o ganancia de función de esta vía en los diversos animales donde se ha analizado (figura 10) (Petersen and Reddien, 2009). Figura 9. Expresión polarizada de la vía Wnt en diferentes estadios del desarrollo de metazoos: durante la gastrulación temprana de ratones o gastrulación tardía de Xenopus y Amphioxus; en el estadio de tailbud de pez cebra; en el estadio de blástula de S. urchin, C. lacteus y N.vectensis; durante el cleavage de P. dumerilli y C. elegans (arriba) o en la larva de C.elegans (abajo); en el estadio de blastodermo de Tribolium o durante la segmentación temprana de Gryllus; en hidras adultas; en larvas de N. vectensis o Amphimedon. Modificado de Petersen y Reddien P., 2009   17 El establecimiento de organizadores y de la polaridad La vía Wnt/βcatenina sin embargo, está involucrada en regular varias facetas del desarrollo del eje primario de metazoos. Diferentes estudios muestran que esta vía al menos desempeña dos funciones temporalmente separables en la formación del eje primario: tempranamente establece regiones organizadoras y la polaridad, y más tarde polariza diferentes características a lo largo del eje primario (véase apartado 3.2). Por ejemplo, la inhibición o la sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina después de la transición de la blástula media (TBM) anterioriza o posterioriza el cerebro respectivamente en vertebrados. En cambio, la manipulación de la vía antes de la TBM tiene consecuencias mucho más dramáticas dado su papel temprano de especificar un organizador primario: ventralizar (inhibición de la vía Wnt/βcatenina) o dorso-anteriorizar (sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina) el embrión, e incluso inducir ejes secundarios (activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina) (Kiecker and Niehrs, 2000; Logan and Figura 10. La manipulación de la vía Wnt causa defectos polarizados del eje primario. (a) Embriones de ratón anteriorizados por la falta de gastrulación tras inhibir wnt3, o posteriorizados tras inhibir APC. (b) Explantes laterales del mesodermo de embriones de pollo revelan una anteriorización tras sobre-expresar Dkk1, o una posteriorización tras sobre-expresar Wnt3a y BMP4. (c) Embriones de rana en el estadio de néurula tras sobre-expresar Dkk1, o Wnt8. (d) Embriones de pez cebra en estadios tardanos de epibolia tras inhibir wnt3a y wnt8, o inyectar wnt3a mRNA. (e) Blástulas de nemertinos animalizadas tras bloquear la gastrulación después de inhibir la ßcatenina, o vegetalizadas tras sobre-expresar un dominante negativo de GSK3. (f) La progenie de la célula EMS que dará lugar a derivativos del endodermo (E) y mesodermo (MS) en el estadio de 4 células de C. elegans está alterada tras inhibir mom-2/wnt o wrm-1/ßcatenina, o pop-1/tcf. (g) Blástulas del cnidario C. hemisphaerica aboralizadas tras inhibir wnt3, o oralizadas tras sobre-expresar Wnt3. En naranja se muestra la expresión de marcadores de estructuras anteriores (A) o del polo animal (An) en bilaterales, o aboral (Ab) en cnidarios; en lila, estructuras posteriores (P) o del polo vegetal (V) en bilaterales, u oral (Or) en cnidarios. Modificado de Petersen y Reddien P., 2009.   18 Introducción Figura 11. Duplicaciones axiales tras activar ectópicamente la vía Wnt/βcatenina en embriones tempranos de Xenopus (A) o ratón (B-E). (A) Inyección ventral de componentes de la vía Wnt/βcatenina en embriones tempranos (8-16 células) de Xenopus induce ejes ectópicos. Adaptado de (Gilbert, 2013). (B- E) La expresión ectópica de Wnt8C en oocytos de ratón induce duplicaciones axiales incompletas anteriormente. Adaptado de (Popperl et al., 1997). (B) Imagen lateral 9 dpc (días post-coitum) de dos ejes opuestos fusionados a nivel anterior. Tinción de la actividad B-galactosidasa en el rombencéfalo (puntas de flecha) y el mesodermo somítico. (C) Imagen ventral a 8.5 dpc de dos ejes paralelos fusionados a nivel posterior. La tinción con el anticuerpo anti-T marca la notocorda y la línea primitiva. Las puntas de flecha marcan el limite anterior de las dos notocordas. (D) Tinción T de embriones a 7-7.5dpc mostrando la duplicación axial en un transgénico para Wnt8 (arriba) y en controles (abajo). (E) Expresión reducida de Hesx1 (cerebro anterior; puntas de flecha) en embriones transgénicos (izquierda) comparada con la expresión en embriones control (derecha) a 7-7.5 dpc.   A B C D E Nusse, 2004) (figura 11). Por tanto, es crucial distinguir los diferentes procesos del desarrollo del eje primario que regula la vía Wnt/βcatenina. La función más conservada y ancestral de la vía Wnt/βcatenina es el establecimiento de la polaridad axial. En la gran mayoría de eumetazoos estudiados la polarización temprana de la vía Wnt/βcatenina durante el desarrollo embrionario especifica el endomesodermo y establece la polaridad del eje primario (Figura 10 y 11). Procesos aguas arriba que activan asimétricamente la vía Wnt/βcatenina Como ha sido comentado anteriormente (apartado 2.1), los mecanismos que desencadenan la activación asimétrica de la βCATENINA durante la embriogénesis varían entre organismos. Así, en Xenopus y en el cnidario Clytia hemysphaerica la activación de la βCATENINA depende de ligandos Wnt localizados asimétricamente en el huevo; en cambio, no depende de Wnts en otro cnidario (Nematostella vectensis) o en el equinodermo Strongylocentrotus purpuratus, pero sí de la localización de Dsh en el hemisferio animal o vegetal respectivamente. Además, en Xenopus, pero no en S. purpuratus o cnidarios, la reorganización del citoesqueleto inducida por la entrada del espermatozoide tiene un papel clave en localizar los componentes de la vía 19 El establecimiento de organizadores y de la polaridad Wnt/βcatenina en el futuro polo postero-dorsal (figura 12) (Croce and McClay, 2006). Una vez rota la simetría, la red génica que activa la βCATENINA desencadena la formación del patrón. Frecuentemente, la activación de la βCATENINA está acompañada por mecanismos de retro-alimentación que mantienen la activación en el polo vegetal (bilaterales) o animal (cnidarios) del embrión y mecanismos que protegen la activación en el polo opuesto (Figura 9). Estos mecanismos inhibitorios pueden ser factores maternales ya presentes en el huevo (p.ej. sFRPs en Zebrafish, o factores de transcripción localizados en el polo animal en erizo de mar que antagonizan la βCATENINA) o ser activados directa o indirectamente por la βCATENINA (p. ej. inhibidores extracelulares de los Wnts secretados por el organizador de cabeza en anfibios) (Angerer and Angerer, 2000; Lu et al., 2011; Niehrs, 2010). Establecimiento de regiones organizadoras y de la polaridad en Xenopus Uno de los modelos donde se tienen más conocimientos de los eventos tempranos que establecen la polaridad es en embriones de Xenopus laevis. La entrada del espermatozoide promueve la estabilización de la ßCATENINA en el futuro polo postero-dorsal del organismo a través de especificar dos centros señalizadores en el estadío de blástula media: el centro de Niewkoop en la región vegetal (donde la ßCATENINA coincide con los factores maternos VegT y Veg1), y el centro de expresión de Chordin y Noggin (BCNE, blastula Chordin and Noggin expression center) justo por encima del centro de Nieuwkoop (región animal y marginal del embrion) (figura 13). Ambos centros son necesarios para especificar el SNC antes de la gastrulación, y requieren de la actividad de la ßCATENINA materna. Entre otros tejidos, el BCNE dará lugar al mesodermo de la línea media y al neuroectodermo. El centro de Nieuwkoop Figura 12. Diferentes mecanismos polarizan la activación de la βCATENINA en el futuro polo posterior. Distribución de componentes maternales de la vía Wnt canónica antes y después de la fertilización en erizos de mar (arriba) o Xenopus (abajo). De Croce y McClay,2006. 20 Introducción induce el organizador de Spemann y Mangold (el labio dorsal del blastoporo) en el mesodermo suprayacente; las células que derivan de este centro forman el endomesodermo. Las primeras células del endomesodermo en internalizarse durante la gastrulación secretan antagonistas de la vía Wnt y migrarán al polo anterior (conocido como organizador de cabeza), justo por debajo del neuroectodermo; más tarde, ingresarán las células del endomesodermo posterior, las cuales secretan diferentes ligandos Wnts (conocido como el organizador del tronco y la cola) y posteriorizarán el neuroectodermo – inicialmente especificado con carácter anterior –. La acción combinada de estos dos organizadores regionaliza el eje AP de vertebrados durante la gastrulación (véase apartado 3.2). Asimismo, durante estos eventos tempranos también se establecen dos centros de señalización opuestos que formarán el eje DV bajo el control de la vía BMP. En definitiva, la vía Wnt/ßcatenina en vertebrados especifica diferentes regiones organizadoras antes de la MBT, induce y establece el organizador de Spemann y Mangold, y en conjunto la polaridad AP y DV (De Robertis and Kuroda, 2004; Kuroda et al., 2004; Niehrs, 1999; Niehrs, 2004). Es importante remarcar que hasta la fecha, solo se ha descrito en vertebrados que la vía Wnt/βcatenina establezca a la vez el polo posterior y el dorsal del embrión (Holland, 2000). Figura 13. Los centros de señalización de la blástula y la formación del organizador de Spemann y Mangold en X. laevis. Los centros de Nieuwkoop y de BCNE de la blástula (ectodermo y endomesodermo) especifican el neuroectodermo anterior a través de la expresión de diferentes antagonistas de la vía Wnt y TGFß. Ambos centros requieren de la ßcatenina materna. De Kuroda y col., 2004; De Robetis y Kuroda, 2004. 21 El establecimiento de organizadores y de la polaridad 2.3 La vía Wnt/βcatenina restablece la polaridad del eje primario durante el desarrollo post-embrionario El restablecimiento de la polaridad del eje primario en un contexto post- embrionario se ha estudiado principalmente en el pólipo Hydra. Las hidras son hidrozoos (cnidarios) de agua dulce que consisten en un cuerpo tubular con una cabeza y tentáculos en el polo oral y un pie en el polo aboral (figura 14a). Principalmente se reproducen asexualmente por gemación y producción de yemas en la pared corporal que crecen y rompen cuando están maduras. Tienen una extraordinaria capacidad de regeneración y disociados celulares pueden re-agregarse y auto-organizar nuevos pólipos. En todos estos procesos del desarrollo post-embrionario de Hydra, la vía Wnt/βcatenina es necesaria para establecer la polaridad axial y desarrollar el eje oral- aboral (Bode, 2009; Hobmayer et al., 2000; Technau et al., 2000) (figura 14b-d). Esto lo hace a través de especificar el organizador de cabeza o hipostoma, región donde se encuentra la boca en la parte oral. Al igual que los organizadores primarios del desarrollo embrionario (p.ej. el organizador de Spemann y Mangold de anfibios; ver siguiente apartado), el hipostoma es capaz de inducir ejes secundarios cuando es trasplantado al cuerpo tubular de otro pólipo. Del mismo modo, la sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina induce ejes ectópicos a lo largo del cuerpo tubular en hidras (Broun et al., 2005) (figura 14c). La inducción de ejes secundarios después de activar la vía Wnt/βcatenina también se ha observado en pólipos de otras dos especies de cnidaros (Nematostella y Hydractinia) (Guder et al., 2006a). En estos experimentos, así como durante la regeneración de la cabeza, la gemación y la re-agregación de disociados celulares, tcf y βcatenina se expresan tempranamente y de manera local ahí donde se formará un nuevo eje y/o cabeza (figura 15) (Hobmayer et al., 2000; Technau et al., 2000). Esta expresión inicial precede la expresión de Wnt3 de manera focalizada, lo que respalda un mecanismo de retro-alimentación positiva de la vía Wnt/βcatenina. Además, Hobmayer y colaboradores (2000) muestran en sus experimentos con disociados que la auto-formación del organizador de cabeza sigue un mecanismo de reacción-difusión. No obstante, no está tan claro cual es el componente inhibitorio de la reacción de formación del organizador. Un candidato es dkk1/2/4, antagonista de la vía Wnt/βcatenina que se expresa muy tempranamente en el sitio de la herida, aunque horas después se expresa a lo largo del cuerpo excepto en el hipostoma, donde la vía Wnt/βcatenina está activa (figura 16) (Guder et al., 2006b). 22 Introducción Figura 14. La vía Wnt/βcatenina establece el organizador de cabeza e induce ejes ectópicos en hidras adultas. (a) Esquema de una sección longitudinal de una hidra adulta. (b) El tratamiento con alsterpaullona, inhibidor de GSK3, eleva los niveles de β CATENINA nuclear principalmente en el hipostomo y (c) conlleva a la formación de ejes ectópicos a lo largo del cuerpo. (d) Múltiples focos de expresión de wnt3 tras 48h de tratamiento con alsterpaullona. (a) Adaptado de Bode,2009; (b-d) De Broun y col.,2005. Figura 15. La vía Wnt/βcatenina se induce tempranamente y de manera local en el futuro hipostoma en diferentes contextos del desarrollo post- embrionario de Hydra. Expresión de wnt3 y tcf durante la regeneración de la cabeza (a), en re-agregados celulares (b), y durante la gemación de pólipos (c). De Hobmayer y col., 2000.   Figura 16. Posible modelo de formación del hipostoma de Hydra por un mecanismo de reacción-difusión de Wnt3a (activador) y Dkk1/2/4 (inhibidor). (a) Expresión de Dkk1/2/4 durante la regeneración (azul) y en pólipos intactos (rojo) en relación con Wnt3a (azul). (b) Modelo basado en la auto-activación de Wnt3a y la activación del inhibidor Dkk1/2/4. De Guder y col.,2006a y 2006b 23 El establecimiento de organizadores y de la polaridad Procesos aguas arriba que activan asimétricamente la vía Wnt/βcatenina Una reacción auto-catalítica Wnt-βcatenina establece el organizador de cabeza durante el desarrollo post-embrionario de hidras pero, ¿cómo se desencadena esta reacción de manera localizada? Las hidras y las planarias regeneran siempre la parte anterior del eje primario en heridas anteriores, y la parte posterior en heridas posteriores, nunca al revés (figura 17a). Para explicar la restauración de la polaridad original durante la regeneración, el modelo matemático de Gierer-Meinhardt (1972) comentado en el apartado 3.1 incluye el concepto de gradiente de competencia. Éste no es más que otro mecanismo basado en gradientes que otorga a las células la capacidad de formar una región organizadora (p.ej. la reacción de formación del hipostoma por la Wnt-βcatenina) en el polo correspondiente del eje. La naturaleza molecular del gradiente de competencia aún se desconoce, sin embargo, este gradiente de señalización es el que sesga la simetría y regula el mantenimiento de la polaridad ante una perturbación. En la literatura de hidra es conocido como el gradiente de activación de cabeza, y diversos estudios indican que: i) es producido por el organizador de cabeza y decrece hacia el polo aboral del organismo intacto; ii) las señales que transmite son bastante estables y tienen una vida media de 36h (mientras que el organizador de cabeza tiene una vida media de 12h); iii) también funciona como gradiente morfogenético al modular la proliferación y diferenciación a lo largo del cuerpo tubular; y iv) está regulado de manera opuesta por el organizador de cabeza y el organizador de pie. De hecho, otros campos morfogenéticos como el embrión de X. laevis, D. melanogaster y las planarias parecen estar bajo control de dos regiones organizadoras localizadas en polos opuestos. Durante la regeneración de hidra, el polo con valor de gradiente de activación de cabeza relativamente mayor es más competente a formar el organizador de cabeza y éste desencadena la reacción local de auto-activación de formación de cabeza. Acoplada a esta reacción está la antagónica que difunde más rápido e inhibe en el polo opuesto la regeneración de otra cabeza, donde se forma el organizador de pie (figura 17b) (Bode, 2009; Meinhardt, 2008; Meinhardt, 2009) Durante la gemación de hidras, se ha propuesto que la reacción de formación del organizador de cabeza se activa en la zona de formación de yemas (a unas 2/3 partes del polo oral) cuando esta zona sobrepasa cierta distancia de la cabeza y el pie. En términos de modelización, cuando el gradiente de activación de cabeza es mayor que el gradiente de inhibición (también producido por el organizador de cabeza) (figura 18) (Bode, 2009) 24 Introducción Un posible candidato a subyacer el gradiente de activación de cabeza en hidras es la misma vía Wnt, ya que después de sobre-activarla se inducen varios ejes ectópicos en organismos intactos (Broun et al., 2005). Sin embargo, este efecto también puede ser una consecuencia indirecta de afectar el organizador de cabeza, y sigue siendo un enigma cuales son las bases moleculares de los gradientes de activación e inhibición de cabeza en hidras (Meinhardt, 2009). Figura 17. Auto-regulación del eje primario. (a) Mantenimiento de la polaridad original durante la regeneración de Hydra. Invariablemente, la cabeza se forma en heridas orales y el pie en heridas aborales. (b) Modelo de mantenimiento de la polaridad original por el gradiente de competencia a formar cabeza. Las señales que promueven la formación de cabeza (verde), tentáculos (rojo), y el pie (rosa) están bajo control de 3 mecanismos de activador-inhibidor separados. Durante la regeneración, los niveles relativos del gradiente de competencia (azul) en el lugar de la herida orienta dónde se desencadena la reacción de formación de cabeza (altos niveles del gradiente) o cola (bajos niveles de competencia). La cabeza eleva el gradiente de competencia y el pie lo reduce. De Meinhardt, 2008 y 2009.   A B Figura 18. Gradiente de activación e inhibición de cabeza en la gemación de Hydra. La formación de un nuevo eje durante la gemación ocurre ahí donde el nivel del gradiente de activación de cabeza (HA) sobrepasa el del gradiente de inhibición (HI). Ambos gradientes están producidos por el organizador de cabeza (HO). Un segundo hipotético inhibidor producido por el pie inhibe la gemación en zonas más basales. De Bode, 2009. 25 El establecimiento de organizadores y de la polaridad Capítulo 3 Elaboración del patrón a lo largo del eje primario 3.1 Modelos teóricos de formación del patrón En la mayoría de organismos en desarrollo, una vez el polo posterior (bilaterales) u oral (no-bilaterales) se ha establecido, el patrón del eje primario se regionaliza y elabora subsecuentemente aún más. Entre los varios modelos propuestos de formación del patrón, dos son los más relevantes, pero no excluyentes: (i) Gradientes globales de morfógenos que otorgan información posicional a las células (Wolpert, 1969; Wolpert, 2011). Este modelo postula la necesidad de una fuente y un sumidero para el morfógeno. La fuente del morfógeno es una población celular concreta y restringida, a la que se define como organizador morfogenético (p.ej. una región concreta del blastoporo o el hipostoma de hidras). El sumidero son los mecanismos de degradación del morfógeno que modulan su distribución en el espacio (Tabata and Takei, 2004). La difusión de morfógenos desde su fuente puede dar lugar a un gradiente morfogenético, el cual induce diferentes respuestas celulares dependiendo de la concentración local de morfógeno. La concentración del morfógeno en cada punto está directamente relacionada con la distancia a la fuente y puede entenderse que entrega a las células información posicional (p. ej. el modelo de la bandera francesa de Wolpert, 1969). Así, las células alejadas de la fuente recibirán bajos niveles del morfógeno y activarán solo la expresión de genes diana que tienen un umbral bajo de inducción. Por el contrario, las células próximas a la fuente del morfógeno recibirán altos niveles de éste y expresarán genes diana que tienen un umbral tanto alto como bajo de inducción. De este modo, un embrión o un campo celular puede diversificarse a lo largo de un eje de acuerdo con su posición relativa a la fuente del morfógeno (figura 19) 27 (Rogers and Schier, 2011). En la actualidad hay cierto escepticismo respecto a la presencia de gradientes funcionales que difundan libremente en campos morfogenéticos grandes. (ii) Reacción en cadena de interacciones inductivas entre células y tejidos vecinos a lo largo de una región (fenómeno descrito por Chandebois como “sociología celular”) (Chandebois, 1976). Este modelo básicamente postula que una región o población de células homogéneas puede diversificarse a través de una reacción en cadena inducida por un inductor (célula o estructura capaz de inducir una respuesta en las células adyacentes) a través de inducciones unilaterales o recíprocas entre células vecinas. Esta reacción se propaga de célula a célula, y por tanto es una inducción progresiva que requiere de tiempo (figura 20). El modelo asume que la competencia de las células a responder a una señal inductora decae con el tiempo. Por tanto, cuanto mayor es la distancia entre la célula que responde y el punto de partida de la reacción en cadena, menor es la respuesta de esta célula. El resultado es la formación de un gradiente de “propiedades” o de señalización, y no tiene por qué ser un gradiente de una substancia soluble que difunde desde su fuente y altera el comportamiento de las células a larga distancia (gradiente global). Como Nieuwkoop (Nieuwkoop, 1973) escribió: "... describing biological phenomena in terms of morphogenetic fields or positional information (Wolpert, 1969) does not necessarily have much explanatory value and may, in some cases, simply be a cloak of our ignorance” Figura 19. Formación del patrón por gradientes globales de morfógenos. El modelo de la bandera francesa de Wolpert (1969) postula la adquisición del valor posicional a través de la interpretación del gradiente de concentración del morfógeno. El morfógeno es secretado por una fuente celular (verde) y forma un gradiente en un tejido. Las células expuestas por encima de un umbral alto de concentración del morfógeno responden con el color azul. Las células expuestas a umbrales de concentración del morfógeno intermedios responden con el color blanco, mientras que las que están expuestas por debajo de cierto umbral responden con el color rojo. De Rogers y Schier,2011 28 Introducción Un tercer modelo de formación del patrón - que en cierto modo es una combinación de un mecanismo basado en gradientes y un mecanismo de interacciones entre tejidos vecinos - propone que un tejido o eje es regionalizado por la reacción en cadena de varias reacciones de formación del patrón (reacción y difusión de moléculas activadoras e inhibidoras; apartado 2.1)(Gierer and Meinhardt, 1972; Meinhardt, 1993; Meinhardt, 2008). Cada reacción de formación del patrón forma una estructura (“A”) que induce la estructura adyacente (“B”) pero al mismo tiempo “A” y “B” se excluyen localmente, y así sucesivamente. Esta reacción en cadena es capaz de generar secuencialmente diferentes estructuras a lo largo de un eje al mismo tiempo que el patrón se regula, e involucra la difusión de morfógenos capaces de inducir una respuesta dependiendo de su concentración local. 3.2 Funciones tardías de la vía Wnt en la formación del patrón del eje primario La información relativa a este apartado ha sido extraída principalmente de los siguientes artículos científicos: (Kiecker and Niehrs, 2000; Niehrs, 2004; Petersen and Reddien, 2009) Los modelos de formación del patrón anteriormente presentados se basan en la presencia de un inductor o una fuente que diversifica los territorios a lo largo de un eje o región. En la gran mayoría de eumetazoos, la activación temprana de la vía Wnt/βcatenina en el embrión especifica el endomesodermo e induce y establece un Figura 20 Formación del patrón por una reacción en cadena de interacciones inductivas (Chandebois, 1976). Una población homogénea puede diversificarse a lo largo de un eje por una reacción en cadena de interacciones unilaterales (B,C), o recíprocas (D). (A) Cuando no hay un inductor, la población pasa a través de un periodo de competencia (b,c) y finalmente se diferencia de acuerdo con la tendencia original (d). (B) Un inductor (parte negra) desencadena un cambio en las células vecinas (a,b), y estas a su vez a sus vecinas (c). Cuando la reacción en cadena provocada por el inductor llega a las células más distantes, estas ya no son competentes y se diferencian de acuerdo con la tendencia original (d).(C) El comportamiento de las células inducidas depende de la duración de la influencia de las células vecinas dentro de su tiempo de competencia. (D) Interacciones entre células inducidas y no-inducidas (c) establece nuevas identidades en los límites de la parte inducida (d) 29 Elaboración del patrón AP organizador primario (Martindale and Hejnol, 2009). Un organizador primario es un centro de señalización que tiene la increíble capacidad de organizar la completa formación del patrón corporal, y comúnmente se identifica como la región del organismo capaz de inducir un eje secundario cuando es trasplantado en un organismo huésped. Uno de los organizadores embrionarios más estudiados es el de mencionado Spemann- Mangold de anfibios (Spemann and Mangold, 1924), y algunos de los equivalentes descritos son el escudo embrionario de peces (Kelly et al., 2000), los micrómeros vegetales de equinodermos (Wikramanayake et al., 1998) o el blastoporo de cnidarios (Kraus et al., 2007). Además, durante el desarrollo en espiral de muchos lofotrocozoos se ha adscrito una función organizadora al macrómero 3D y el micrómero 4d descendiente (Lambert, 2010); función que se ha sugerido que puede estar también mediada por la βCATENINA en el gasterópodo Crepidula fornicata (Henry et al., 2010). Entre las diferentes señales que produce el organizador están los ligandos Wnts. Estos se distribuyen a lo largo del eje primario durante la gastrulación y las siguientes etapas embrionarias, excepto en el polo opuesto, el futuro polo aboral de la larva de cnidarios o anterior de bilaterales. En el polo animal, y posteriormente anterior o aboral, encontramos expresados diferentes antagonistas de la vía, secretados o activados por lo que parece ser otro centro de señalización (p.ej. el organizador de cabeza de vertebrados) (figura 9). Esta expresión de múltiples ligandos Wnt de diferentes categorías indica que todos los tipos de vías de señalización mediadas por Wnt están implicadas en la formación del patrón del eje primario. A continuación se describen diferentes estudios de la vía Wnt en estadios tardíos del desarrollo en diversos animales que en general, muestran que la señalización por Wnts dependiente de βcatenina regula diferentes aspectos polarizados a lo largo del eje primario, y la independiente modula la elongación y arquitectura del eje. Desarrollo y crecimiento de la parte posterior en bilaterales Durante la gastrulación y a medida que continúa el desarrollo embrionario, diferentes ligandos Wnt se expresan en la zona de crecimiento posterior en muchos artrópodos (p.ej. (Fu et al., 2012)), anélidos (Cho et al., 2010), vertebrados (Agathon et al., 2003; Takada et al., 1994) y cordados basales como amphioxus (Schubert et al., 2001). La inhibición de la vía Wnt/ßcatenina específicamente durante estos estadios tardíos resulta en defectos en la segmentación del tronco y la cola, y en embriones incompletos en la parte posterior en varios artrópodos (Bolognesi et al., 2008; McGregor et al., 2008; Miyawaki et al., 2004) y vertebrados (Agathon et al., 2003; Aulehla et al., 2008; Takada et al., 1994) (figura 10 y 21). Interesantemente, para la segmentación y crecimiento de la cola de ratón es necesario un gradiente posterio-anterior de bcatenina 30 Introducción en el mesodermo presomítico (Aulehla et al., 2008). Todos estos datos indican que el desarrollo y crecimiento del tronco y la cola de animales bilaterales es una función tardía y ampliamente conservada de la vía Wnt/bßcatenina. Esta función resulta de la activación coordinada de la vía Wnt no canónica en el pez cebra (Marlow et al., 2004), involucrada en la elongación del eje, y de un mecanismo conservado en bilaterales basado en Wnt, caudal, brachyury y varios genes hox posteriores que regionalizan la parte posterior (Martin and Kimelman, 2009). Especificación regional del neuroectodermo y desarrollo de la cabeza en bilaterales (i) Especificación regional del neuroectodermo en deuteróstomos En vertebrados varios estudios funcionales demuestran que la vía Wnt/βcatenina regionaliza el neuroectodermo de la gástrula en prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal. Por ejemplo, la sobre-activación de la β catenina después de la transición de blástula media (TBM) en el pez cebra o en anfibios resulta en un fenotipo de microcefalia que se caracteriza por la pérdida de los ojos y las estructuras más anteriores del cerebro a expensas de una posteriorización o desplazamiento de marcadores posteriores hacia anterior (fenotipo masterblind y headless en el pez cebra tras la pérdida de función de axin1 y tcf3, respectivamente). De manera complementaria, la inhibición de la vía Wnt/βcatenina después de la TBM resulta en la expansión de marcadores anteriores a costa de marcadores posteriores del cerebro (figura 10) (Elkouby and Frank, 2010; Kiecker and Niehrs, 2000; Kiecker and Figura 21. La vía Wnt/βcatenina controla el desarrollo y crecimiento de la parte posterior durante estadios tardíos del desarrollo de bilaterales. (a) La inhibición de la vía Wnt/ βcatenina en Xenopus resulta en la expansión de la cabeza y troncos reducidos; la activación resulta en renacuajos sin cabeza. (b) La inhibición de arm/βcatenina en G. Bimaculatus resulta en embriones severamente truncados por la parte posterior (falta de abdomen, abd-A y segmento torácico T3, aquí no mostrado). La parte anterior se mantiene, aunque anormal. De Kiecker y Niehrs, 2000; (b) Adaptado de Miyawaki y col.,2004   31 Elaboración del patrón AP Niehrs, 2001). De manera importante, Kiecker y Niehrs (2001) muestran en embriones de Xenopus que estos fenotipos dependen de la dosis de activación o inhibición de la vía Wnt/βcatenina, así como la presencia de un gradiente de posterior hacia anterior de actividad de βCATENINA en el neuroectodermo durante la gastrulación. En conjunto, estos datos indican como la combinación de ligandos Wnt y sus antagonistas secretados por derivados del organizador primario (endomesodermo posterior y anterior, respectivamente) regionalizan el neuroectodermo durante la gastrulación de vertebrados a través de establecer un gradiente postero-anterior de señalización Wnt/βcatenina (figura 22a) (Kiecker and Niehrs, 2001). En los últimos años también se ha demostrado que la acción integrada de las tres ramas de la vía Wnt (Wnt/βcatenina, Wnt/JNK y Wnt/Calcio) posterioriza el neuroectodermo - maternalmente especificado a adquirir un carácter anterior - y restringe progresivamente el neuroectodermo anterior al futuro polo anterior en erizos de mar (Angerer et al., 2011; Range et al., 2013; Wei et al., 2009). Estudios comparativos en hemicordados, cefalocordados y vertebrados apuntan que esta función de la red Wnt en la formación del patrón del neuroectodermo está conservada en todos los deuteróstomos (figura 22b) (Range, 2014). (ii) Subregionalización del neuroectodermo anterior y arquitectura de la cabeza en general En estadios aún más tardíos del desarrollo del sistema nervioso central (SNC) de vertebrados, diferentes ligandos Wnt son expresados para refinar y sub-regionalizar aún más el cerebro. Por ejemplo, wnt1 y βcatenina son necesarios para mantener el centro Figura 22. La vía Wnt/βcatenina posterioriza el neuroectodermo durante la gastrulación de deuteróstomos. (a) La combinación de diferentes agonistas y antagonistas de Wnts secretados por el mesodermo (ME) en el polo posterior (P) y anterior (A), respectivamente, establece un gradiente de señalización Wnt/βcatenina que regionaliza el neuroectodermo (NE) a lo largo del eje AP de Xenopus en: prosencéfalo (FB), mesencéfalo (MB), rombencéfalo (RB) y médula espinal (SC). De Kiecker y Niehrs, 2001 (b) La formación del patrón AP del neuroectodermo en erizos de mar requiere la integración de las tres ramas de la vía Wnt (Wnt/βcatenina, Wnt/JNK y Wnt/Calcio) para restringir el neuroectodermo anterior (ANE) al polo anterior. De Range,2014   32 Introducción de señalización del límite entre el mesencéfalo y el rombencéfalo (Organizador del Istmo), zona más anterior del SNC posterior que es crítica para organizar el cerebro en desarrollo. Además, la vía Wnt no canónica juega también un papel clave en el desarrollo de la cabeza en general, modulando por ejemplo, la elongación del endomesodermo axial a lo largo de la línea media. Finalmente, es importante mencionar que la función de la vía Wnt debe coordinarse con el papel desempeñado por muchas otras vías de señalización, como la vía de los FGF (Fibroblast Growth Factor) o la vía del ácido retinoico, durante la especificación regional del SNC a lo largo del eje AP (Elkouby and Frank, 2010) La vía Wnt también juega un papel importante en los estadios tardíos del desarrollo del neuroectodermo de invertebrados. Por ejemplo, en el anélido Platynereis dumerilii la vía Wnt está involucrada en el desarrollo y arquitectura del neuroectodermo (Demilly et al., 2013), y en el neuroectodermo anterior de hemicordados, la vía Wnt/βcatenina especifica un centro señalizador equivalente al Organizador del Istmo de vertebrados (Pani et al., 2012). Además, se ha descrito la expresión de Wnts (entre ellos Wnt1) y βCATENINA nuclear en la cabeza de dos especies de artrópodos (Tribolium castaneum y Gryllus bimaculatus), y se ha propuesto que esta expresión también podría estar marcando un centro de señalización equivalente al Organizador del Istmo de vertebrados (Fu et al., 2012; Miyawaki et al., 2004; Oberhofer et al., 2014). Por tanto, aunque aún es prematuro y faltaría examinar más protóstomos, la vía Wnt podría tener el rol conservado en subregionalizar el neuroectodermo anterior y regular la arquitectura de la cabeza a través de especificar un centro señalización en el límite entre el cerebro medio y posterior en el ancestro común de los bilaterales (figura 23). Figura 23. La vía Wnt/βcatenina y el desarrollo tardío de la cabeza en diversos organismos. (a) La vía Wnt está involucrada en la formación del Organizador del Istmo en vertebrados (IsO). Centros señalizadores equivalentes al IsO en hemicordados (b), y posiblemente en artrópodos (c). (a y b) De Pani y col., 2012; (c) Adaptado de Oberhofer y col., 2014. 33 Elaboración del patrón AP Divisiones asimétricas en C. elegans y Platynereis En el nemátodo C.elegans o el anélido Platynereis dumerili la vía Wnt/βcatenina controla la polaridad AP de las divisiones asimétricas del eje embrionario (figura 9f) (Huang et al., 2007; Schneider and Bowerman, 2007). Además, durante el desarrollo post-embrionario de C.elegans diferentes Wnts se expresan en la parte posterior promoviendo la migración posterior de neuroblastos o el destino posterior de las divisiones asimétricas entre otros aspectos polarizados (figura 10) (Silhankova and Korswagen, 2007). Desarrollo del eje oral-aboral de cnidarios La expresión de varios ligandos Wnt de manera solapante a lo largo del eje primario durante la embriogénesis de N. vectensis es muy sugestivo de una función tardía de la vía Wnt en el desarrollo del eje oral-aboral de cnidarios, y por analogía con el código Hox de bilaterales (revisado en Garcia-Fernandez, 2005), ha sido bautizado como el código Wnt (revisado en Guder et al., 2006a). Sin embargo, no ha sido hasta recientemente cuando se ha demostrado que la inhibición o activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina durante estadios larvales aboraliza u oraliza el patrón del ectodermo de manera dependiente de la dosis (Marlow et al., 2013). Los paralelismos con la especificación regional del neuroectodermo de vertebrados son tentadores. Por lo que respecta al desarrollo post-embrionario de hidra, la vía Wnt/βcatenina establece el organizador de cabeza (apartado 2.3) y este empieza a expresar secuencialmente diferentes ligandos Wnts que bien pueden estar involucrados en desarrollar el patrón del eje, o en mantener el hipostoma (Lengfeld et al., 2009). Hasta donde alcanza mi conocimiento, no hay datos funcionales donde se haya testado específicamente la función tardía de la vía Wnt/βcatenina en la especificación regional del eje primario de hidras, pero interesantemente, el hipostoma expresa diferentes Wnts involucrados en la evaginación de las yemas y los tentáculos durante la regeneración, lo que apunta a una función conservada de la vía Wnt no canónica en la elongación del eje primario (Philipp et al., 2009). 34 Introducción Capítulo 4 Mantenimiento del eje primario: crecimiento y homeostasis El embrión u organismo adulto en proceso de formación o restauración del eje primario (regeneración/reproducción asexual), crece en tamaño al mismo tiempo que se especifican las diferentes regiones y se organizan los tejidos en diferentes órganos a lo largo del eje primario; y sigue creciendo, hasta alcanzar un tamaño fijo (en la gran mayoría de animales) determinado por la genética del organismo y el ambiente. Durante todo este proceso, e independientemente de si el crecimiento es iso- o alométrico, el patrón y la forma general del organismo se escalan en consonancia con el tamaño. Cómo el patrón está coordinado con el crecimiento es una temática fascinante, pero lejos de los objetivos de esta tesis doctoral y no será desarrollada aquí. Solo cabe mencionar que esta regulación del patrón puede explicarse otra vez en términos de gradientes de señalización, ya sean globales o de distintos campos morfogenéticos interrelacionados (Gilbert, 2013; Niehrs, 2010). Una vez alcanzado el tamaño, los diferentes tejidos y órganos deben contrarrestar los efectos del tiempo para mantener la forma y la funcionalidad del organismo adulto. Uno de los mecanismos que mantiene la homeostasis del organismo adulto es el reemplazamiento de las células envejecidas o dañadas por descendientes de células madre somáticas. Por definición, las células madre tienen la capacidad de auto- renovarse y de diferenciarse hacia células más especializadas. De acuerdo con el potencial de diferenciación, éstas pueden ser pluripotentes y dar lugar a cualquier célula presente en los tejidos del organismo adulto (p. ej. las células madre embrionarias), o tener el potencial de diferenciación restringido y ser multi-, oligo- o bipotentes. Normalmente la gran mayoría de las células madre somáticas del organismo adulto 35 tienen el potencial de diferenciación restringido y dan lugar a las células del tejido u órgano en el que se encuentran (p. ej. células madre nerviosas, intestinales, hematopoyéticas, etc.). Las células madre somáticas no solo contribuyen a mantener la homeostasis del organismo adulto, sino también a regenerar los tejidos después de un daño y al crecimiento del organismo. En todos estos contextos, (i) los descendientes de las células madre (embrionarias o adultas) han de integrarse con el patrón pre-existente y coordinarse con la formación (embrión) o restauración del patrón durante regeneración; y (ii) la vía Wnt/βcatenina regula diferentes aspectos de la biología de las células madre, desde la auto-renovación a la diferenciación a diferentes tejidos. Por ello, una función anómala de la vía está involucrada en enfermedades como el cáncer o enfermedades neurodegenerativas (Clevers and Nusse, 2012; Nusse, 2008; Reya and Clevers, 2005; Ring et al., 2014) 36 Introducción Capítulo 5 La planaria como organismo modelo para el estudio del restablecimiento y mantenimiento del eje AP Como he descrito en los capítulos previos, la vía Wnt tiene una función muy conservada en regular la formación del eje primario durante la embriogénesis de los metazoos. Sin embargo, solo se ha visto involucrada en el restablecimiento de del eje primario en diferentes contextos del desarrollo post-embrionario en Hydra, un organismo a la base de los bilaterales. La regeneración, o capacidad de restaurar funcionalmente partes perdidas o dañadas del cuerpo, es un fenómeno ampliamente distribuido a lo largo de la filogenia animal. Esta capacidad puede depender del momento del ciclo vital del organismo (p.ej. decaer con la ontogenia) y ocurrir a diferentes niveles de organización biológica: desde la regeneración celular, tisular o de órganos, hasta la regeneración de estructuras corporales complejas (p.ej. la cola o las extremidades de salamandras). Los metazoos basales como las hidras y muchos filos de lofotrocozoos (p.ej. platelmintos, nemertinos o anélidos) y deuteróstomos (p.ej. equinodermos o ascidias), tienen además la capacidad de regenerar todas las partes del cuerpo a partir de pequeños fragmentos corporales (figura 24) (Bely and Nyberg, 2010). 37 Entre todos los organismos con la capacidad de regenerar todo el cuerpo, las planarias de agua dulce en particular, representan un excelente modelo para estudiar los mecanismos morfogenéticos implicados en la formación del patrón corporal. Cinco motivos principales hacen a la planaria Schmidtea mediterranea un modelo idóneo para estudiar estos mecanismos: (i) como se acaba de comentar, tienen la capacidad de restaurar el patrón corporal a partir de prácticamente cualquier fragmento del cuerpo de un organismo adulto; (ii) las planarias adultas crecen y decrecen en tamaño continuamente dependiendo de las condiciones ambientales y no envejecen, lo que sugiere que hay mecanismos siempre activos para mantener el patrón corporal durante la homeostasis; (iii) son fáciles y económicas de mantenerlas en un laboratorio; (iv) como modelo clásico de restauración del patrón corporal disponemos de una amplia literatura descriptiva al respecto; y, (v) disponemos del genoma secuenciado de S. mediterranea y de una multitud de herramientas moleculares en continuo desarrollo para estudiar la genética de la regeneración en esta especie de planaria, incluyendo la inhibición de la función génica a través de la interferencia del ARN o ARNi, y la descripción de diferentes marcadores celulares específicos que ayudan a caracterizar los fenotipos de perdida de función génica (Newmark and Sanchez Alvarado, 2002; Salo, 2006). Figura 24. Distribución filogenética de la regeneración en los metazoos. La presencia de regeneración indica que al menos existe una referencia para una especie del filo en concreto. La ausencia de regeneración indica la falta de una referencia positiva y la descripción de ausencia de regeneración en al menos una especie del filo. No documentado indica que no hay datos sobre la capacidad regenerativa del filo en concreto. De Belly y Nyberg, 2010 38 Introducción 5.1 Biología de las planarias La información relativa a este apartado proviene principalmente de los siguientes artículos científicos: (Agata and Umesono, 2008; Brøndsted, 1969; Kobayashi et al., 1998; Newmark and Sanchez Alvarado, 2002; Salo, 2006) Los análisis filogenéticos sitúan las planarias en el filo de los platelmintos, dentro del clado de espirales protóstomos (Carranza et al., 1997; Ruiz-Trillo et al., 2002). Las planarias son gusanos planos deprimidos dorsoventralmente. Sin embargo, el termino “planaria” es empleado frecuentemente en la literatura de manera confusa (Egger et al., 2007). Aquí será utilizado para designar a los platelmintos de vida libre que presentan un sistema digestivo ciego dividido en tres ramas principales (Orden Tricladida). Diferentes especies de planarias han sido o son utilizadas actualmente como modelos para estudiar la regeneración. Como ha sido comentado arriba, en esta tesis doctoral se ha utilizado la planaria de agua dulce S. mediterranea, y en concreto, el biotipo asexuado. Morfología general Las planarias son organismos triblásticos, acelomados y no segmentados, aunque algunos de sus sistemas internos, como el nervioso, muestran cierta iteración. Su tamaño varia según las especies, pero en particular, el biotipo asexuado de S. mediterranea puede oscilar entre pocos milímetros hasta tres centímetros (figura 25). No poseen aparato circulatorio, respiratorio ni esquelético, por lo que la distribución de los nutrientes y oxigeno tiene lugar por difusión desde el epitelio corporal y el sistema digestivo. Las funciones de osmorregulación y excreción son llevadas a cabo por una red de células flamígeras. Parte de la función excretora también es realizada por el sistema digestivo, el cual se caracteriza por un intestino ciego que se abre al exterior por una faringe evaginable. La simetría bilateral de estos organismos se ve reflejada a diferentes niveles morfológicos a lo largo del eje AP y DV (figura 25). Aunque planos, estos gusanos presentan ciertas asimetrías a lo largo del eje DV, como una mayor densidad de cilios en la superficie ventral para facilitar la locomoción, una boca ventral, o una pigmentación corporal más intensa en la superficie dorsal. La polaridad del eje AP se manifiesta claramente por la cefalización del sistema nervioso central (SNC), con el cerebro y diferentes estructuras sensoriales concentradas en la cabeza (p.ej. los ojos). Mientras que el sistema digestivo morfológicamente puede dividirse en 3 grandes regiones a lo largo del eje AP: la faringe está localizada en la parte central-posterior del eje (tronco), y de ella se extienden dos ramas digestivas hacia la cola, y una hacia la cabeza. En 39 La planaria como organismo modelo general, el eje AP puede dividirse en al menos 4 regiones: (i) la cabeza con el cerebro, (ii) la región pre-faríngea con una gran densidad de células secretoras de moco, (iii) la faringe o tronco, y (iv) la región post-faríngea o cola que se define por la presencia de tres tiras de células secretoras de moco (figura 25c). El SNC es uno de los sistemas que se ha analizado con más profundidad en los fenotipos obtenidos en esta tesis doctoral, y por ello aquí y en el apartado de regeneración será descrito con más detalle. El SNC esta organizado por un cerebro o ganglio cefálico antero-dorsal y un par de cordones nerviosos ventro-laterales que recorren longitudinalmente el eje AP y convergen en la región caudal. Los cordones nerviosos ventrales están conectados entre si a través de varias comisuras transversales que surgen de pequeños ganglios iterados a lo largo del eje. El cerebro está organizado en un neuropilo central de textura esponjosa y una capa de cuerpos neuronales que lo recubre. Presenta una simetría bilateral, y las dos mitades del cerebro están conectadas por una comisura anterior. Del cerebro salen varias ramas cefálicas que proyectan hacia diversas estructuras sensoriales concentradas a nivel de la cabeza, así como proyecciones axonales hacia un par de ojos localizados en una posición antero-dorsal respecto el cerebro. Cada uno de los ojos del sistema visual consta de células pigmentarias y células fotoreceptoras rabdoméricas. Estas últimas son bipolares, y las dendritas proyectan hacia las células pigmentarias del ojo, y los axones lateralmente y contra-lateralmente (quiasma óptico) hacia la región media de ambos ganglios cefálicos (figura 26) (Cebria, 2008). Aunque a primera vista el SNC de la planaria parece morfológicamente simple, este está compuesto por varios tipos Figura 25. Morfología general de las planarias. (a) Visión dorsal de un individuo del biotipo asexuado de S.mediterranea. El asterisco marca la posición de la faringe, y las flechas los ojos. (b) in situ whole-mount en la planaria Dugesia japonica con PC2 y PN8, marcadores del SNC y de células productoras de moco, respectivamente. (c) Dibujo representativo mostrando que el eje AP puede dividirse en al menos 4 regiones: cabeza, pre-faringe, faringe y cola. En púrpura el SNC, y en naranja el sistema digestivo. Anterior hacia arriba. Barra de escala: a, 0.5mm. (b-c) Adaptado de (Agata et al., 2003)   40 Introducción neuronales y diferentes sub-poblaciones pueden ser detectadas (Cebria, 2008; Cebria et al., 2002a; Cebria et al., 2002b; Marsal et al., 2003; Umesono et al., 2011). Además, el cerebro está organizado en diferentes dominios estructurales y funcionales. Por ejemplo, los genes otx, que en vertebrados definen la parte anterior y media del cerebro, en la planaria Dugesia japonica definen junto con otp tres dominios no solapantes a lo largo del eje medio-lateral del cerebro (Umesono et al., 1997; Umesono et al., 1999); mientras que a lo largo del eje AP del cerebro de D. japonica se ha descrito la expresión complementaria de fzA y wntA (Kobayashi et al., 2007) (figura 26). Reproducción Dependiendo de la especie y biotipo podemos encontrar planarias con una modalidad de reproducción exclusivamente sexual, asexual o mixta. Existen dos biotipos de la especie S. mediterranea, el biotipo sexuado y el biotipo asexuado (Benazzi et al., 1975). El biotipo sexuado tiene la capacidad de reproducirse asexualmente o sexualmente en función de las condiciones ambientales (modalidad mixta). Figura 26. Sistema nervioso de S. mediterranea. Inmunotinción del sistema nervioso con el anticuerpo SYNORF1/3C11 que reconoce la sinapsina. (a) Planaria intacta. (b) Detalle de la comisura anterior del cerebro. (c) Detalle de las ramas cefálicas (puntas de flecha). (d) Detalle de los ganglios de los cordones nerviosos. El SNC conecta con varios plexos nerviosos periféricos (Baguñà and Ballester, 1978): infraepitelial, subepitelial, submuscular (e), intestinal y los plexos interno y externo de la faringe altamente inervada (f). (g) Sistema visual revelado por la superposición de una imagen en campo claro, donde se observan las células pigmentarias (cp), y el marcaje con el anticuerpo VC-1 especifico de las células fotoreceptoras (cf). (h) Dibujo esquemático de los patrones de expresión de los genes homeobox otx y otp de D. japonica en diferentes territorios del eje medio-lateral del cerebro (izquierda), y de wntA y fzA marcando diferentes territorios del eje AP (derecha). Anterior hacia la izquierda en (a), o hacia arriba en (b-h). cg, ganglios cefálicos; vnc, cordones nerviosos ventrales;ph,faringe. Barras de escala: a, 0.5mm; b-e,50µm;f-g100µm. (a-f) De Cebrià, 2008, (g) Imagen cedida por K. Ekelt; (e)Adaptado de Kobayash y col.,2007.   41 La planaria como organismo modelo Frecuentemente la reproducción sexual tiene lugar por la fecundación cruzada de dos individuos hermafroditas y da lugar a huevos encapsulados por una capa quitinosa (coccons) de donde nacerán 4-8 juveniles. Los biotipos asexuados de S. mediterranea se reproducen exclusivamente por fisión transversal y regeneración de las partes faltantes: la cola de la planaria se adhiere fuertemente al sustrato mientras que la parte anterior se estira y la región intermedia (normalmente 2/3 partes del organismo) se estrecha hasta que el organismo se fragmenta en dos. Muchos factores determinan que una planaria se fisione, entre ellos la densidad poblacional, la temperatura o el tamaño del animal (figura 27) (Handberg-Thorsager et al., 2008; Salo, 2006). 5.2 Plasticidad morfológica Las planarias poseen una extraordinaria plasticidad morfológica que se manifiesta por dos fenómenos: (i) son capaces de regenerar un organismo completo y proporcionado a partir de prácticamente cualquier fragmento del organismo adulto y, (ii) pueden crecer y decrecer en tamaño manteniendo la forma y proporciones corporales dependiendo del estatus nutricional. Así, mientras que muchos organismos presentan formas adultas estrictamente fijadas desde el punto de vista del tamaño y patrón, las planarias pueden regenerar y remodelar su cuerpo continuamente (figura 28). Figura 27. Reproducción sexual y asexual de S. mediteranea. El biotipo asexuado se reproduce exclusivamente por fisión transversal de la parte posterior y regeneración de las partes faltantes (círculo exterior azul). El biotipo sexuado puede reproducirse asexualmente (no mostrado) o por la fertilización cruzada de dos individuos, dando lugar a coccons con varios embriones (círculo interior rojo). El biotipo asexuado se distingue fácilmente del sexuado por la translocación cromosómica que muestran las flechas. De Saló, 2006   42 Introducción La primera descripción de las singulares capacidades regenerativas de las planarias data de 1766 (Pallas, 1766). Tras él, muchos científicos se sintieron atraídos a estudiar estos organismos e incluso las planarias fueron consideradas “inmortales bajo el filo de una navaja” (Dalyell; para una revisión histórica véase Brøndsted, 1969). Las planarias pueden regenerar un nuevo organismo completo, aunque más pequeño que el original, a partir de cualquier tipo de amputación (longitudinal, transversal, oblicua, etc.) (figura 28a-c). El potencial regenerativo de estos organismos es tan grande, que hasta un fragmento de una planaria tan pequeño como del tamaño para ser visto por el ojo humano puede regenerar una organismo completo (Randalph, 1897) (figura 28d). TH Morgan luego mostró que el tamaño mínimo capaz de regenerar es 1/279 de una planaria. Solo dos regiones del organismo adulto son incapaces de regenerar: la punta de la cabeza (fragmentos anteriores a los ojos) y la faringe; la incapacidad de regenerar Figura 28. Plasticidad morfológica. Las dibujos ilustran el trabajo original de Randolph (a-d) (Randolph,1987) y Morgan (e) (Morgan, 1898). (a) Corte transversal. (b) Corte longitudinal. (c) Ocho cortes. (d) Un fragmento tan pequeño como para se visible por nuestro ojo; la parte sombreada representa la pigmentación del organismo intacto. Todos estos fragmentos (a-d) pueden regenerar un organismo completo. (e) Restauración de la correcta proporción de los fragmentos regenerantes. (f) Remodelación del patrón durante los procesos de crecimiento y decrecimiento. Anterior hacia arriba.ph, faringe. Barra de escala: 4mm. (a-e) De Newmark y Sanchez Alvarado,2002; (f) De Handberg- Thorsager y col., 2008 43 La planaria como organismo modelo de estas regiones correlaciona con el hecho que están desprovistas de neoblastos (las únicas células mitóticas del organismo adulto; ver más abajo) (Baguñà, 1976). TH Morgan también acuño los términos morfalaxis y epimorfosis para definir los procesos regenerativos que tienen lugar en ausencia o presencia de proliferación en el sitio del corte, respectivamente (Morgan, 1901). Mientras hay organismos como las hidras que principalmente regeneran por medio de la remodelación de las estructuras preexistentes, sin la formación de “material nuevo” en el sitio de amputación (morfalaxis) (Holstein, 1991), otros organismos requieren de proliferación celular en el sitio de la amputación para reconstruir las partes dañadas – epimorfosis - (p.ej. las extremidades de vertebrado) (Brockes, 1997). En este contexto, las planarias siguen un proceso mixto de epimorfosis-morfalaxis (véase apartado 6.2) (Salo and Baguna, 1984). Las planarias no solo requieren de la formación de un blastema de regeneración (tejido despigmentado que se forma por proliferación en el sitio de la amputación), sino también de la remodelación del tejido preexistente para restaurar la forma y el patrón corporal. La línea de arriba de la figura 28e ilustra estos cambios auto-reguladores en el pequeño fragmento triangular que resulta de la amputación de la cabeza. Este fragmento forma un blastema en el sitio de la herida donde principalmente diferenciará una nueva cola, a la par que el tejido preexistente se remodela considerablemente. Al cabo del tiempo, lo que al inicio era solo una cabeza, da lugar a una planaria pequeña perfectamente proporcionada y funcional. Generalmente la diferenciación de las estructuras perdidas transcurre en tan sólo 7-10 días, pero la remodelación de los tejidos preexistentes para restaurar las proporciones adecuadas al nuevo tamaño se prolonga unas semanas más dependiendo del tamaño del tejido de partida. La gran capacidad de remodelación del patrón corporal de las planarias también es patente durante los procesos de crecimiento y decrecimiento en tamaño (figura 28f). Cuando no comen, decrecen en tamaño reduciendo el número total de células y, cuando comen, vuelven a crecer incrementando el número de células (Baguñà and Romero, 1981). Durante este proceso reversible el organismo mantiene las proporciones corporales y no muestra ninguna disfuncionalidad fisiológica. El crecimiento y decrecimiento en tamaño depende de un equilibrio dinámico entre proliferación, autofagia y muerte celular (Baguñà, 1976; Gonzalez-Estevez et al., 2007). Equilibrio que está constantemente regulado para mantener el tamaño y patrón de la planaria cuando esta ha llegado al tamaño máximo especifico de su especie, y que se decanta hacia una perdida neta de células durante el decrecimiento, o hacia la ganancia de células durante el crecimiento o regeneración (Eisenhoffer et al., 2008; Gonzalez-Estevez and Salo, 2010). 44 Introducción Las células madre de la planaria: los neoblastos La gran plasticidad morfológica de las planarias está basada en una población estable de células madre somáticas llamadas neoblastos. Los neoblastos representan un 20-30% del total de las células del parénquima - tejido poco organizado y compacto que rellena el espacio entre los órganos internos y el epitelio externo – (Baguna, 2012; Baguñà et al., 1989a), se caracterizan por ser células morfológicamente indiferenciadas, tener un tamaño pequeño (5-8µm), y poseer un elevado índice núcleo-citoplasma (Dubois, 1949; Handberg-Thorsager et al., 2008; Newmark and Sanchez Alvarado, 2002; Wolff, 1962) (figura 29). Son las únicas células del organismo adulto con capacidad mitótica y que pueden diferenciarse en todos los tipos celulares necesarios durante la regeneración y el recambio celular. La irradiación elimina los neoblastos, impidiendo la regeneración y el recambio celular (Baguñà et al., 1989a; Bardeen and Baetjer, 1904; Dubois, 1949; Eisenhoffer et al., 2008). Aunque la existencia de procesos de desdiferenciación celular aún no puede excluirse definitivamente, la mayoría de datos indican que el papel de este proceso durante la regeneración de planarias seria menor (Salo, 2006). Hasta hace muy poco no sabíamos si la pluripotencia de los neoblastos como población se daba por la existencia de células pluripotentes, o por el contrario, de la suma de diversas subpoblaciones de células madre con linajes restringidos (figura 30a). Repitiendo experimentos clásicos realizados en la segunda mitad del siglo XX (Baguñà et al., 1989a), el grupo liderado por P. Reddien ha demostrado recientemente de manera muy elegante que hay neoblastos individuales pluripotentes: un único neoblasto es capaz de formar colonias de múltiples tipos celulares (neoblastos clonogénicos o cNeoblastos) y rescatar el recambio celular y la capacidad regenerativa en planarias Figura 29. Distribución y morfología de los neoblastos. (a) La inmunotinción en S. mediterranea utilizando el marcador de neoblastos ant-DjPCNA (proliferating cell nuclear antigen) muestra la distribución de estas células madre por todo el parénquima, pero no en la faringe (ph) o delante de los ojos (e). Visión ventral; anterior hacia la izquierda. Barra de escala: 2mm. (b) Imagen de microscopia electrónica de dos neoblastos. Las células miden entre 6 y 10µm y se caracterizan por elevado índice núcleo-citoplasma y la presencia de cuerpos cromatoides (flechas rojas). n,nucleo; c, citoplasma. De Handberg-Thorsager y col., 2008.   45 La planaria como organismo modelo desprovistas de neoblastos (Wagner et al., 2011) (figura 30a). La presencia de neoblastos pluripotentes no excluye la opción que puedan existir subpoblaciones de células madre con el potencial restringido. Aunque históricamente los neoblastos han sido considerados una población homogénea, estudios recientes demuestran que estos pueden ser clasificados en diferentes subpoblaciones en función de su sensibilidad a la irradiación, sus características histológicas, su fase del ciclo celular o la expresión de diversos marcadores moleculares (Cowles et al., 2013; Currie and Pearson, 2013; Lapan and Reddien, 2011; Salvetti et al., 2009; Scimone et al., 2014). Así, los neoblastos se comprometen hacia diferentes linajes celulares mientras ciclan, generando distintas poblaciones de neoblastos especializados (Reddien, 2013; Scimone et al., 2014) (figura 31). Sin embargo, aún no sabemos si las diferentes clases de neoblastos especializados pueden auto-renovarse y ser considerados células madre multi- o oligopotentes, o por lo contrario rápidamente se diferencian (30a y c) Figura 30. Pluripotencia de la población de neoblastos y los cNeoblastos. (a) La pluripotencia de la población de neoblastos puede ser el resultado de un conjunto de diferentes neoblastos con linajes restringidos (izquierda) o de neoblastos individuales pluripotentes (derecha). Recientemente se ha demostrado que neoblastos individuales pueden ser pluripotentes (cNeoblastos), dando lugar a tejidos de las tres capas embrionarias y restaurando las habilidades regenerativas en animales irradiados letalmente. (b) Un cNeoblasto (azul) puede dar lugar a colonias de neoblastos que se diferencian en neuronas, intestino y otros tipos celulares. Las colonias pueden generarse por cNeoblastos que sobreviven bajas dosis de irradiación, o a través de trasplantar un único cNeoblasto en huéspedes irradiados letalmente. (c) En teoría, un cNeoblasto podría dar lugar a células madre con un potencial más restringido (como se muestra), o diferenciarse directamente (como se muestra a la derecha del panel “a”). De Reddien P.,2013.   46 Introducción Figura 31. La especialización de los neoblastos en diferentes linajes después de inducir un daño muestra la heterogeneidad de esta población. Los cNeoblastos dan lugar a neoblastos especializados comprometidos a dar lugar a diferentes tejidos. Tanto los cNeoblastos como los especializados expresan el marcador smedwi-1. Los neoblastos especializados dejan de expresar smedwi-1 durante el proceso de diferenciación. Resumen de todos los factores de transcripción conocidos que se expresan en neoblastos y que se han visto funcionalmente asociados con distintos linajes (fondo blanco). En la parte de abajo (fondo azul) se muestran los factores de transcripción expresados en neoblastos y tejidos específicos, pero que no se ha demostrado su implicación funcional en la especificación de los neoblastos. De Scimone y col., 2014   47 La planaria como organismo modelo Capítulo 6 La regeneración en planarias Los primeros eventos que transcurren tras cualquier tipo de amputación tienen como objetivo minimizar la superficie de la herida y la pérdida de tejido. Tras la amputación de una planaria, la herida se cierra rápidamente por una fuerte contracción y posterior relajación de la musculatura de la pared corporal adyacente. En consecuencia, la epidermis dorsal y ventral entran en contacto, se estira con la relajación muscular, y forma una capa muy fina de células epidérmicas que cubren la herida y el tejido parenquimático subyacente (Baguña et al., 1994; Chandebois, 1980). La formación de un epitelio que cubra la herida transcurre en tan solo 30 minutos. Durante las siguientes horas de regeneración, los neoblastos proliferan rápidamente y se acumulan por debajo del plano de amputación, el postblastema. La progenie de los neoblastos que han salido del ciclo migran desde el postblastema hacia el epitelio de cicatrización y dan lugar a una masa de células indiferenciadas o blastema regenerativo, donde se restaurarán las estructuras perdidas (o parte de ellas según la envergadura del daño). Al mismo tiempo que se forma y crece el blastema, se determinan los diferentes territorios de las estructuras a diferenciar, así como el tejido preexistente se remodela para adaptarse al nuevo tamaño y patrón, y tienen lugar los procesos de diferenciación (figura 32) (Baguña et al., 1994; Salo, 2006). Aunque muchos de estos eventos ocurren al mismo tiempo durante la regeneración, por motivos prácticos se desarrollarán por separado en los siguientes sub-apartados: (i) respuesta a la herida y estímulos de la regeneración, (ii) restauración del patrón corporal, (iii) dinámicas de proliferación y muerte celular Figura 32. Regeneración anterior en S. mediterranea. Tras la decapitación (0d), la epitelización transcurre en 30 minutos. La proliferación de los neoblastos promueve la formación del blastema regenerativo (tejido despigmentado), ya visible después de un día, donde gradualmente se diferenciarán las estructuras perdidas de la cabeza. d, días transcurridos tras la amputación; barra de escala: 1mm. La imagen de 30min corresponde a una sección sagital de parafina. Punta de flecha, epitelio de la herida; flechas, epidermis; barra de escala: 0,2mm. Adaptado de Saló, 2006. 49 6.1 Respuesta a la herida y estímulos de la regeneración El estímulo que desencadena el proceso de regeneración es la herida, sin embargo, aún se desconoce la naturaleza molecular de las señales que transmite para promover la formación del blastema de regeneración y el restablecimiento del patrón corporal en planarias. A pesar de ello, se ha sugerido cuales podrían ser las fuentes desencadenantes de la regeneración, así como se han descrito varias sustancias o señales que estimulan la regeneración y que podrían representar uno de los primeros estímulos en respuesta a la herida en planarias: • Contacto epitelio-mesénquima. Por analogía al proceso de regeneración de ciertas estructuras de vertebrados (Brockes and Kumar, 2008), se ha sugerido que el contacto directo del epitelio de la herida con el parénquima subyacente podría ser una de las fuentes estimulantes de la regeneración (figura 32) (Baguña et al., 1994; Chandebois, 1980; Kato et al., 2001). • Discontinuidad axial. Se ha propuesto que la confrontación de los epitelios ventral y dorsal podría integrar la respuesta regenerativa (Kato et al., 2001; Schilt, 1970). No obstante, no todos los procesos regenerativos en planarias requieren interacciones DV (p.ej. regeneración intercalar) y en todo caso, cualquier discontinuidad axial podría estimular la regeneración (Saló and Baguñà, 1985). • Señales bioeléctricas en respuesta a la herida. Estudios en vertebrados muestran que la herida genera señales bioeléctricas que pueden modular la capacidad regenerativa (Adams et al., 2007; Brockes and Kumar, 2008; Stewart et al., 2007). En planarias, se ha visto que justo después de amputar la aplicación de campos magnéticos débiles, que modulan los niveles de calcio intracelular, acelera la regeneración a través de incrementar el índice mitótico y la tasa de crecimiento del blastema (Rogdestvenskaya et al., 2001). Además, la aplicación de campos eléctricos externos durante la regeneración bipolar de planarias afecta la polaridad regenerativa, dando lugar a planarias con dos cabezas, o con la polaridad invertida, dependiendo de la intensidad y orientación de la corriente aplicada (Marsh and Beams, 1952) (siguiente apartado). • Sustancias relacionadas con el sistema nervioso. Diferentes sustancias como neuropéptidos y factores de crecimiento pueden estimular la regeneración y la actividad mitótica en planarias (Cebria, 2008; Reuter and Kreshchenko, 2004). Entre los neuropéptidos, encontramos la sustancia P y sustancia K (Baguñà et al., 1989b), y el neuropéptido Y (Hori, 1997). Entre los factores de crecimiento que se 50 Introducción han visto que actúan como potentes mitogénicos en neoblastos, encontramos las hormonas de crecimiento de mamífero EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor) y el factor liberador de hormona de crecimiento. Estos y otros datos, sugieren que al igual que se ha descrito en muchos contextos de la regeneración de vertebrados (Brockes and Kumar, 2008), la regeneración en planarias puede depender del sistema nervioso (Cebria, 2008). 6.2 Restauración del patrón corporal La restauración del patrón corporal empieza muy pronto, justo después de cerrarse la herida. Mediante experimentos de trasplantes, E. Saló en su tesis doctoral (1984) mostró que la determinación de las estructuras a regenerar ocurre muy rápidamente y en sentido distoproximal (Salo, 2006). Estos experimentos – que se basan en el hecho que la cabeza y la faringe una vez determinadas tienen la habilidad de inhibir la formación de otra cabeza y faringe, respectivamente - mostraron que la determinación de la cabeza ocurre antes que la determinación de la faringe, así como que esta ocurre más rápidamente en fragmentos anteriores (p.ej. pre-faringe) que en fragmentos posteriores (p.ej. post-faringe) de la planaria. En concreto, la determinación de la cabeza ocurre entre 6-24 horas dependiendo del nivel AP de amputación (ver concepto de “head frequency” más adelante), y la de la faringe entre 12-36h; en ambos casos, el tiempo calculado es a 17˚C de temperatura. Esta rápida determinación de territorios fue la que sugirió el modelo morfaláctico-epimórfico de regeneración en planarias (Salo and Baguna, 1984), en el que primero se da un proceso de morfalaxis que se traduce en una determinación de un pre-patrón en una área muy estrecha de blastema y post-blastema, que después se amplifica y refina por proliferación (epimorfosis) (figura 33a). La fase morfaláctica (independiente de proliferación) es respaldada por los experimentos de irradiación a dosis letales, donde las planarias restauran el patrón y forman un pequeño blastema en ausencia de proliferación (Baguñà et al., 1989a; Salo, 2006; Saló, 1978 - Tesis Doctoral). Finalmente, mediante una nueva fase morfaláctica, el tejido antiguo remodela gradualmente el patrón preexistente para ajustar las proporciones corporales al nuevo tamaño. Durante esta segunda fase morfaláctica, la progenie de las células madre se diferencia de acuerdo con el nuevo patrón determinado. El grupo de K. Agata ha reinterpretado los procesos regenerativos clásicamente clasificados en epimorfosis y morfaláxis y ha propuesto renombrar el modelo de restauración del patrón en planarias como distalización e intercalación (Agata, 2003; 51 La regeneración en planarias Agata et al., 2007). Según este modelo, tras amputar transversalmente una planaria a lo largo del eje AP la región que se forma primero tiene la información posicional más distal del eje (A o P) y corresponde al epitelio de cicatrización y al blastema. La discontinuidad en la información posicional que se crea entre la zona distal y el postblastema del tejido preexistente promueve la intercalación de valores posicionales y la restauración del patrón de las estructuras perdidas. Asimismo, este modelo propone que la zona distal (epitelio de cicatrización y blastema) actúa como un organizador que instruye la remodelación del patrón preexistente. No obstante, se han descrito fenotipos que no forman un blastema de regeneración pero que diferencian la cabeza en el tejido pre-existente (Marsal, 2005 - Tesis Doctoral); (Gonzalez-Estevez et al., 2012; Salo, 2006). Los modelos morfaláctico-epimórfico y distalización-intercalación no son excluyentes, más bien son complementarios, ya que el primero incluye el origen celular y el segundo se centra solo en la información posicional. Ambos coinciden en que la determinación de los territorios es muy rápida y distoproximal, y están respaldados por: (i) la expresión temprana durante la regeneración anterior de varios marcadores de células diferenciadas y genes neurales como los otx y otp (Cebria et al., 2002b; Umesono et al., 1999); y (ii) la rápida reorganización de los patrones de expresión de los genes Hox a lo largo del eje AP durante la regeneración (Bayascas et al., 1998; Orii et al., 1999; Salo and Baguna, 2002). No obstante, hasta el momento el mecanismo responsable de restablecer el patrón durante la regeneración es desconocido y podría implicar la intercalación de valores posicionales mediante la reacción en cadena de interacciones inductivas entre células vecinas, un gradiente distoproximal de señales que difunden desde la región más distal, o una combinación de ambos mecanismos (apartado 3.1). Figura 33. Restauración del patrón corporal. (a) Modelo epimórfico-morfaláctico. (b) Modelo de distalización-intercalación de valores posicionales. Los colores o números representan diferentes regiones del eje AP. (a) De Saló, 2006. (b) De Agata y col.,2007. Detalles en el texto principal 52 Introducción Restablecimiento de la polaridad AP Los modelos epimórfico-morfaláctico o de distalización-intercalación de restauración del patrón corporal no abordan cuáles son los primeros eventos que determinan que un blastema regenere una cabeza o una cola, es decir, cómo se restablece la polaridad regenerativa. Los estudios clásicos sugieren que la polaridad regenerativa depende de un gradiente de señalización a lo largo del eje AP. Esta hipótesis está basada por un lado en la observación de heteromorfos con dos cabezas (“Janus-heads”) o con dos colas (“Janus-tails”) en fragmentos muy delgados obtenidos tras amputar transversalmente una planaria; y por el otro, en la reducción gradual a lo largo del eje AP de la capacidad de regenerar una cabeza observada en ciertas especies de planarias. Esta última observación es lo que se conoce como “head frequency” en la literatura de planarias, y correlaciona con el hecho de que cuanto más anterior es el fragmento regenerante, más rápido se regenera la cabeza (Sivickis, 1931) (figura 34). No obstante, la naturaleza molecular de dicho gradiente (o gradientes) de señalización se desconoce. T. H. Morgan postuló un gradiente estructural a lo largo del eje AP o de substancias producidas por la cabeza (Morgan, 1905), mientras que C. M. Child defendió la idea de uno o varios gradientes fisiológicos dinámicos a lo largo del eje (Child, 1911). Más tarde T. Lender sugirió un gradiente antero-posterior de una sustancia inhibidora del cerebro (BI, brain inhibitor) que es producida por la cabeza y difunde hacia posterior (Lender, 1956; Lender, 1960), y E. Wolff propuso que un gradiente de sustancias activadoras e inhibidoras controlarían la polaridad regenerativa (Brøndsted, 1954). Es interesante, que la magnitud de la respuesta mitótica es mayor y más rápida cuanto más anterior es el sitio de la amputación, lo cual se atribuye a la distribución anatómica del CNS a lo largo del eje AP (gradiente decreciente en la densidad de tejido nervioso) (Baguñà, 1976). No obstante, hay discrepancias sobre si existe o no un gradiente mitótico preexistente en organismos intactos (Baguñà, 1976; Oviedo and Levin, 2007). Según el modelo matemático de Gierer-Meinhardt (1972) (apartado 3.3), el restablecimiento de la polaridad original durante la regeneración depende de un gradiente de competencia que es establecido en el organismo adulto por la acción antagónica de dos organizadores localizados en polos opuestos (Meinhardt, 2008) 53 La regeneración en planarias Por otro lado, Marsh y Beams (1952) demuestran que campos eléctricos externos pueden revertir la polaridad regenerativa en la planaria D. tigrina (figura 35). En base a todos los datos acumulados, Lange y Steele (1978) postularon un modelo bioeléctrico- electroforético que controla la polaridad regenerativa en planarias. Brevemente, este modelo postula que el hipotético BI es una sustancia electronegativa que forma un gradiente dinámico por la acción de un campo bioeléctrico relacionado con el SNC. Es decir, el BI es producido por la cabeza pero migra hacia el polo posterior - con una carga eléctrica biológicamente más positiva que el polo anterior – e inhibe la regeneración del cerebro, y en su lugar se regenera la cola Figura 34. Head frequency en S. mediterranea. Este fenómeno se correlaciona con el hecho de que cuanto más anterior es el fragmento regenerante, más rápido se regenera la cabeza. La gráfica muestra la tasa regenerativa dependiendo del nivel del corte a lo largo AP (A-E) y del tamaño de partida de las planarias amputadas. Tasa regenerativa expresada en 1/t x 1000 , donde t es el número de horas transcurridas antes de que el 50% de la población analizada muestre ambos ojos a un aumento de 25x. Figura de Baguñà, 1976.   Figura 35. Modelo bioeléctrico- electroforético y el control de la polaridad regenerativa por campos eléctricos externos (experimento de Marsh y Beams, 1952). (a) Regeneración normal cuando no se exponen las planarias regenerantes a un campo eléctrico externo (EEF). La sustancia inhibidora de cerebro (bis) es producida por el cerebro (b) y migra hacia el polo posterior (relativamente más positivo que el polo anterior) por la acción de un campo bioeléctrico generado por el SNC (bf). (b) La aplicación de una corriente externa de 1.6- 24.4µA/mm2 con el ánodo en heridas anteriores, no tiene ningún efecto en la polaridad regenerativa. c) Heteromorfo two- headed cuando se aplica una corriente externa de 18-20µA/mm2 con el cátodo en heridas anteriores. d) Polaridad de regeneración invertida cuando se aplica una corriente externa de 21-22µA/mm2 con el cátodo en heridas anteriores. El tiempo transcurrido entre la amputación y la exposición a las corrientes externas es de 0.5-26horas. La corriente ha sido aplicada durante una media (AVE) de 5.1 días. Figura extraída de Lange y Steele,1978   54 Introducción Aparte de la implicación de gradientes de señalización, también se ha sugerido que la polaridad regenerativa podría estar relacionada con diferentes dinámicas de epitelización en las heridas anteriores y posteriores. Esta idea se basa en las observación que el epitelio dorsal se expande más hacia ventral en heridas anteriores, mientras que en heridas posteriores el epitelio ventral se expande más hacia dorsal (figura 36a) (Chandebois, 1980). Además, se ha descrito que las dinámicas de diferenciación y/o contracción muscular de la pared corporal dorsal y ventral también difieren durante la regeneración anterior (Cebria and Romero, 2001). Por otro lado, los experimentos de trasplantes que implican una confrontación de las superficies dorsales y ventrales promueve en ocasiones el establecimiento de nuevos ejes corporales (figura 36b) (Kato et al., 2001; Schilt, 1970). Finalmente, la información posicional, y con ello el establecimiento de la polaridad regenerativa, reside en las células diferenciadas del organismo, y no en los neoblastos (Kato et al., 2001; Saló and Baguñà, 1985) 6.3 Dinámicas de proliferación y muerte celular Durante la regeneración, el equilibrio dinámico de proliferación, muerte celular y autofagia del organismo adulto es alterado con el fin de restaurar y remodelar el tejido preexistente a nivel celular. Las tasas de proliferación y muerte celular se disparan siguiendo unas dinámicas espacio-temporales bimodales bien descritas (figura 37): Figura 36. Posible papel de las confrontaciones dorso-ventrales en el establecimiento de la polaridad. (a) La pared corporal dorsal se expande más hacia ventral en heridas anteriores, mientras que en heridas posteriores es la pared corporal ventral la que se expande más hacia dorsal. Figura de Chandebois,1980. (b) Arriba, el trasplante de un fragmento corporal en la misma posición y con la misma polaridad que la original no induce la formación de ejes ectópicos. Abajo, al invertir el fragmento trasplantado 180º respecto al eje DV se induce la formación de nuevos ejes corporales a lo largo de la frontera anterior y posterior del trasplante. Figura de Ogawa y col.,2002. 55 La regeneración en planarias (i) Fase temprana ante cualquier tipo de daño Tras la formación de un epitelio que cubre la herida, las tasas apoptótica y mitótica aumentan gradualmente hasta alcanzar su máximo aproximadamente a las 4 y 6 horas, respectivamente. Mientras que la apoptosis aumenta de manera localizada en las células diferenciadas del post-blastema, la respuesta mitótica a la herida es sistémica, empezando cerca de la herida y propagándose rápidamente a todo el cuerpo (Pellettieri and Sanchez Alvarado, 2007; Salo and Baguna, 1984; Wenemoser and Reddien, 2010). De manera importante, esta respuesta temprana se desencadena ante cualquier tipo de daño, tanto si este comporta la pérdida de tejido o es solo una incisión (Wenemoser and Reddien, 2010). En conjunto, estos datos indican que la herida es la fuente de una señal mitogénica que se transmite al resto del cuerpo. Sin embargo, hacen falta más datos para determinar si esta onda proliferativa es inducida por las células apoptóticas que mueren previamente en el lugar de la herida (Wenemoser and Reddien, 2010). (ii) Fase de transición Durante esta fase de transición hay una disminución progresiva de las tasas apoptótica y mitótica, la última alcanzando un mínimo aproximadamente a las 18 horas después de amputar. Si la lesión causada a la planaria conlleva la perdida de tejido, una señal desconocida recluta los neoblastos en el post-blastema, posiblemente a través de inducir su migración (Baguñà et al., 1989a; Wenemoser and Reddien, 2010) (iii) Fase tardía, dependiente de la magnitud del daño y tejido a remodelar Aproximadamente 2 y 3 días después de amputar, las tasas mitóticas y apoptóticas alcanzan su segundo máximo, respectivamente. De manera complementaria a la distribución espacial durante la fase temprana, el segundo pico mitótico se concentra preferentemente en la región del post-blastema, mientras que el segundo máximo apoptótico es sistémico, abarcando incluso el blastema (Pellettieri et al., 2010; Salo and Baguna, 1984; Wenemoser and Reddien, 2010). Interesantemente, esta fase depende de la magnitud del daño y tejido a remodelar: solo se desencadena el segundo pico mitótico si el daño causado a la planaria conlleva perdida de tejido, y la magnitud de la tasa apoptótica correlaciona con la remodelación que deben sufrir los fragmentos a regenerar (p.ej. es mayor en fragmentos pequeños) (Pellettieri et al., 2010; Wenemoser and Reddien, 2010). Durante esta fase el blastema crece exponencialmente por proliferación y diferenciación de los neoblastos en el post- blastema. 56 Introducción Tras esta respuesta bimodal a la falta de tejido, el máximo de la tasa mitótica se mantiene durante aproximadamente 8 días y las mitosis gradualmente se redistribuyen por toda la planaria (Wenemoser and Reddien, 2010). Por otro lado, la tasa apoptótica disminuye gradualmente para recuperar los niveles basales aproximadamente a los 14 días después de infligir el daño (Pellettieri et al., 2010). Esta apoptosis generalizada en el resto del organismo es fundamental para adaptar el organismo regenerante a las nuevas proporciones (Almuedo-Castillo et al., 2014). Figura 37. Dinámicas de proliferación y apoptosis durante la regeneración. (a) Magnitud y distribución espacio-temporal de la respuesta mitótica, primero sistémica (6h) y luego localizada en el post-blastema (48h) durante la regeneración anterior o posterior. La densidad mitótica es significativamente mayor a 48h con respecto al mínimo de 18h. *=p-value <0.05; *=p-value <0.01 (test de t-student). El panel de abajo muestra la inmunotinción contra la histona 3 fosforilada. De Wenemoser y Reddien, 2010. (b) Respuesta apoptótica bimodal, primero local (4h) y luego sistémica (3 días) cuya magnitud varía en función del fragmento analizado. *=p-value <0.01; **=p- value<1x10-10 (test de t-student comparando con controles intactos). El panel de abajo muestra la tinción contra las células apoptóticas por la técnica de TUNEL. Barra de escala: 100 µm. De Pellettieri y col.,2010 57 La regeneración en planarias Capítulo 7 Regeneración del Sistema Nervioso Central anterior Como se ha comentado, uno de los sistemas que se ha analizado en más detalle en esta tesis es el SNC, y en particular la regeneración del cerebro. Así pues, esta descripción pretende ser de ayuda para entender los resultados obtenidos. En base a diversos estudios funcionales y de expresión de genes neurales específicos se ha postulado que la regeneración anterior del sistema nervioso central (SNC) puede dividirse en al menos 3 estadios (figura 38) (Agata and Umesono, 2008; Cebria, 2008; Cebria et al., 2002a; Cebria et al., 2002b). (i) Estadio temprano Este estadio se caracteriza por la diferenciación del primordio del cerebro en el blastema anterior, y la regionalización de éste por la expresión de los genes wntA/fzA (eje AP) y otx/otp (eje medio-lateral). En D. japonica transcurre entre las 24-36h después de amputar la cabeza, pero esta estimación puede variar por ejemplo, en función de la especie de planaria, o el nivel de amputación a lo largo del eje AP (concepto del head frequency). El primordio del cerebro aparece como dos agrupaciones bilaterales de células neuronales que probablemente tienen su origen en la proliferación de los neoblastos en el sitio de la herida y posterior migración dentro del blastema. Algunos estudios sugieren que el primordio del cerebro se forma a partir de las extensiones neuronales que emergen de los cordones nerviosos en el sitio de la herida (Reuter et al., 1996); otros, apuntan a que se forma independientemente del crecimiento de los cordones nerviosos preexistentes(Cebria, 2008; Cebria et al., 2002a; Cebria et al., 2002b)En cualquier caso, al inicio de esta tesis doctoral no se había descrito ningún gen responsable de la determinación del primordio del cerebro y solo se ha sugerido que la vía FGF podría tener un papel clave (Agata and Umesono, 2008; Kobayashi et al., 2007). Esta hipótesis se basa en el descubrimiento en planarias del 59 Figura 38. Regeneración anterior del SNC. (a) Estadios propuestos durante la regeneración anterior del SNC (detalles en el texto principal). b) Patrón de expresión con el marcador neuronal especifico H.10.2f durante la regeneración anterior de S. mediterranea. Con este marcador se puede detectar el primordio de cerebro en el blastema anterior a los 2 días de regeneración (puntas de flecha). Las flechas marcan las ramas cefálicas. pr, fotoreceptores. Anterior a la izquierda. Adaptado de Cebrià,2007) gen nou-darake (ndk), un tipo de receptor de FGF. ndk es uno de los primeros genes en expresarse en el blastema anterior, incluyendo el primordio del cerebro, y está involucrado en restringir la diferenciación de cerebro en la cabeza a través de modular la vía FGF (Cebria et al., 2002a; Cebria et al., 2002b). (ii) Estadio intermedio Durante este estadio (aproximadamente entre 2-3 días) el primordio del cerebro crece al mismo tiempo que restablece las conexiones entre los dos hemisferios y con los cordones nerviosos que están creciendo en el blastema. Este proceso esta mediado por genes involucrados en la orientación axonal (robo, slit), la adhesión neuronal (NCAM, DSCAM) o la extensión de neuritas y supervivencia neuronal (CHC) (iii) Estadio tardío Durante los estadios previos, el SNC restaura la estructura original, pero el cerebro regenerado no es del todo funcional. Algunos genes neurales (p.ej. eye53) se expresan a partir del 4-5 día de regeneración y son necesarios para restaurar la función del sistema visual 60 Introducción Capítulo 8 La vía Wnt en planarias El estudio de la vía Wnt durante la regeneración muestra que tiene un papel relevante en restaurar el eje primario de hidras y/o modular la capacidad regenerativa en diversos organismos. Por ejemplo, la vía Wnt - junto con la BMP - es necesaria para la epitelización de la herida durante la regeneración de las extremidades o la cola en el pez cebra, Xenopus y ajolote, y la reducción de la señales Wnt y BMP inhibe la proliferación de las células progenitoras, la formación del blastema regenerativo y la capacidad de regeneración en estos organismos (Kawakami et al., 2006; Poss, 2010). Incluso, la activación ectópica de la vía Wnt/ßcatenina es capaz de promover la regeneración de las extremidades en renacuajos de Xenopus que han perdido la capacidad regenerativa después de la metamorfosis (Kawakami et al., 2006). Como se ha descrito, la vía Wnt/ßcatenina es necesaria para restablecer el organizador de cabeza durante la regeneración de hidras. Pero interesantemente, la expresión temprana de dkk1/2/4, wnt3 y tcf que se desencadena en el sitio de la herida correlaciona con la capacidad regenerativa al estar tremendamente reducida en cepas de hidra con una capacidad regenerativa deficiente (reg-16) (Guder et al., 2006b; Hobmayer et al., 2000). Al inicio de esta tesis doctoral, el conocimiento sobre el papel de la vía Wnt en la regeneración de las planarias se restringía a los trabajos realizados por M. Marsal en su tesis doctoral (2005) y la descripción o caracterización funcional de varios elementos de la vía Wnt en S. mediterranea y otras especies de planarias. En la tabla 1 se muestra la diversidad de elementos de la vía Wnt descritos en planarias a principios de 2008 (en la discusión se mostrarán los elementos descritos durante el transcurso de esta tesis doctoral. 61 M. Marsal (Marsal, 2005 - Tesis Doctoral) en Girardia tigrina primero, y luego T. Adell y colaboradores en S. mediterranea (2008), caracterizaron la función de las GSK3 en planarias mediante el uso de drogas como la azenkenpaulona o alsterpaulona. M. Marsal describe diferentes fenotipos de afectación de la regeneración tras inhibir esta kinasa, que entre otros sustratos regula negativamente la ßCATENINA. El fenotipo fuerte inhibe totalmente la capacidad regenerativa, tanto en heridas anteriores como en posteriores; mientras que el fenotipo “cabeza sin blastema” afecta la formación de un blastema anterior pero se diferencia una cerebro morfológicamente anormal en el postblastema. Los defectos en la formación del blastema están acompañados por una disminución de las mitosis a 3 días después de amputar. En conjunto, estos datos llevaron a la conclusión que la GSK3 controla la formación del blastema y la determinación de la región cefálica durante los estadios iniciales de la regeneración anterior de la planaria G. tigrina. De manera interesante, M. Marsal propone separar los procesos de proliferación de los de determinación de cabeza durante las primeras 12h de regeneración: primero es necesario la GSK3, y posiblemente la vía Wnt/ßcatenina inhibida, para promover la regeneración; luego que la actividad de la GSK3 se mantenga, y quizás la inhibición de la ßCATENINA, para determinar la región cefálica (Marsal, 2005 - Tesis Doctoral). Los estudios realizados en S. mediterranea corroboran que el tratamiento con drogas contra la GSK3 afecta la morfogénesis del SNC, sin embargo, no describen que afecte la capacidad regenerativa en esta especie (figura 39) (Adell et al., 2008). Wnt Component Planarian Species References Gtwnt5 Girardia tigrina (Marsal et al., 2003) DjwntA Dugesia japonica (Kobayashi et al., 2007) Smed-GSK3-1; DjGSK3 Schmidtea mediterranea; Dugesia japonica (Adell et al., 2008; Kobayashi et al., 2007) Smed-GSK3-2 Schmidtea mediterranea (Adell et al., 2008) Smed-GSK3-3; GtGSK3-3 Schmidtea mediterranea; Girardia tigrina (Adell et al., 2008; Marsal, 2005 - Tesis Doctoral) DjfzA Dugesia japonica (Kobayashi et al., 2007) DjbcateninA Dugesia japonica (Kobayashi et al., 2007) DjTCF DjDshA Dugesia japonica Dugesia japonica (Kobayashi et al., 2007) (Kobayashi et al., 2007) Tabla 1 Componentes de la vía Wnt descritos en planarias hasta principios de 2008 62 Introducción Finalmente, el estudio de la función de DjwntA en D. japonica también respalda el papel de la vía Wnt en la morfogénesis del SNC. En este caso, la inhibición de wntA resulta en la expansión del cerebro hacia regiones posteriores de manera similar a lo descrito tras inhibir ndk. No obstante, hay ciertas características que no comparten ambos fenotipos y los autores sugieren que la vía Wnt y la de ndk/FGFR regulan la morfogénesis del SNC, hasta cierto punto, de manera independiente (figura 40). La vía de ndk/FGFR estaría más relacionada en promover la diferenciación de tejido cerebral, y la vía Wnt en la posteriorización del cerebro y/o manteniendo el límite posterior del cerebro (de manera similar al límite mesencéfalo-rombencéfalo de vertebrados) (Kobayashi et al., 2007). Figura 39. La inhibición de las GSK3s durante la regeneración bipolar afecta la morfogénesis del SNC de S. mediterranea. Las planarias tratadas diferencian una cabeza más pequeña que un control y con una muesca en la punta anterior. El cerebro diferenciado también es más pequeño y presenta los dos hemisferios desconectados o con la comisura claramente más delgada. (a-d) Vision dorsal de organismos vivos. (e-f) Inmunotinción del sistema nervioso con 3C11 (anti- synapsin). (g-j) Magnificaciones de la zona anterior afectada de inmunotinciones del SNC con 3C11 y tubulina. Azk, 1-azakenpaullone (inhibidor de la GSK3). Barra de escala: 0,7 mm en (a-f) y 0,2 mm en (g-j). De Adell y col. 2008 63 La vía Wnt en planarias Figura 40. La vía Wnt y la de ndk/FGFR regulan la morfogénesis del SNC en D. japonica. La inhibición de wntA o de ndk resulta en diferentes grados de diferenciación de tejido cerebral fuera de la región de la cabeza. La inhibición de ndk resulta en la diferenciación de ramas cefálicas de forma iterada a lo largo de todo el eje AP, mientras que la inhibición de wntA resulta en la expansión del cerebro hacia posterior, hasta cierto limite. (a-d) Inmunotinción de las ramas cefálicas con el anticuerpo anti-2381HH. (e-g) in situ whole-mount contra 821_HN, marcador de la región cabeza (puntas de flecha) y de las ramas cefálicas. (h-j) in situ whole-mount contra 517_HH, marcador del SNC. Las flechas indican la diferenciación de ojos ectópicos. De Kobayashi y col.,2007   64 Introducción OBJETIVOS La presente tesis tiene como finalidad caracterizar el rol de la vía de señalización Wnt/ßcatenina en el reestablecimiento y mantenimiento del eje antero-posterior (AP) durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea. Para tal fin, los objetivos concretos planteados en este trabajo fueron los siguientes: 1) Identificar y caracterizar los homólogos de ßcatenina y axina en S. mediterranea. 2) Caracterizar la pérdida y ganancia de función de la vía Wnt/ßcatenina en S. mediterranea mediante la interferencia del ARN (ARNi) de los genes ßcatenina y axina, respectivamente. 67 Objetivos RESULTADOS Informe de los directores sobre la participación de la doctoranda y el índice de impacto de las publicaciones La memoria de la tesis doctoral presentada por Marta Iglesias Garcia, titulada “Caracterización funcional de la vía Wnt/βcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje anteroposterior durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea”, de la que somos codirectores, incluye tres artículos, dos de ellos en el apartado de “Resultados” y uno en el apartado de “Anexos”. Todos los artículos han sido publicados en revistas internacionales que constan en el PubMed, la base de datos más importante de ciencias biomédicas. También están incluidas en la ISI Web of Science y en todos los casos se trata de publicaciones que han pasado por el filtro de evaluadores anónimos designados por los editores. A continuación se detallan para cada uno de los artículos los índices de impacto y la posición en el listado ordenado de especialidades correspondientes (datos del ISI Web of Science). Apartado “Resultados”: La doctoranda ha sido la principal responsable de la ejecución y el análisis de los resultados de los artículos contenidos en este apartado. La doctoranda ha participado activamente en el diseño experimental de los trabajos realizados, en la discusión y obtención de conclusiones y en la redacción de los manuscritos. 71 Resultados Artículo 1 Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development 135, 1215-1221(2008). Marta Iglesias, Jose Luis Gomez-Skarmeta, Emili Saló y Teresa Adell. Teresa Adell ha identificado las dos ßcateninas de planaria (Smed-ßcatenin1 y Smed-ßcatenin2), analizado sus secuencias genómicas, y preparado las construcciones para sobreexpresar su ARN mensajero en embriones de Xenopus. Bajo la supervisión de los Doctores Teresa Adell y Emili Saló, la doctoranda Marta Iglesias ha caracterizado el patrón de expresión de estos genes y realizado la caracterización funcional de Smed-ßcatenin1 en planaria (experimentos de pérdida de función por ARN de interferencia y análisis de los fenotipos generados con diferentes marcadores específicos). Jose Luis Gomez-Skarmeta ha realizado los experimentos de sobreexpresión de Smed-ßcatenin1 y Smed-ßcatenin2 en embriones de Xenopus. La escritura del manuscrito así como el diseño y la producción de las figuras se han realizado principalmente entre Marta Iglesias y Teresa Adell. Factor de Impacto: 6,812 Posición en el área: 5/38 (Q1, área Developmental Biology) Artículo 2 Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/β-catenin pathway. Developmental Biology 358 (2011) 68-78. Marta Iglesias, Maria Almuedo-Castillo, A. Aziz Aboobaker, Emili Saló. La doctoranda Marta Iglesias ha diseñado y realizado la gran mayoría del trabajo experimental presentado en este manuscrito bajo la supervisión del Doctor Emili Saló. Maria Almuedo-Castillo, junto con la doctoranda, ha realizado los experimentos relacionados con el gen nou-darake. La escritura del manuscrito y la producción de las figuras se ha realizado principalmente entre Marta Iglesias y María Almuedo- Castillo. Todos los autores han participado en la discusión de los resultados. Este artículo está incluido en el apartado de anexos en la tesis doctoral de María Almuedo-Castillo (2014) Factor de Impacto: 4,069 Posición en el área: 7/40 (Q1, área Developmental Biology) 72 Resultados Apartado “Anexos”: La participación de la doctoranda en el artículo incluido en este apartado se limita a los datos relativos a la vía de señalización de Wnt/βcatenin, pues se trata de una revisión sobre el trabajo realizado durante los últimos veinte años en el grupo donde se ha llevado a cabo esta tesis doctoral. Artículo 3 Planarian regeneration: achievements and future directions after 20 years of research. International Journal of Developmental Biology, 53:1317-1327 (2009). Saló E, Abril JF, Adell T, Cebrià F, Eckelt K, Fernandez-Taboada E, Handberg- Thorsager M, Iglesias M, Molina MD, Rodríguez-Esteban G. Este artículo se ha realizado en colaboración con diversos miembros del grupo de investigación donde se ha llevado a cabo esta tesis doctoral, por lo que está incluido también en las tesis doctorales de Mette Handber-Thorsager (2008), Enrique Fenrández (2008), Kay Eckelt (2011) y Ma Dolores Molina (2011). Factor de Impacto: 2,162 Posición en el área: 27/36 (Q4, área Developmental Biology) Los directores, Dr. Emili Saló i Boix Dra. Teresa Adell Creixell Barcelona, 30 de Octubre de 2015 73 Resultados Artículo 1 Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial- like hypercephalized planarians Marta Iglesias, Jose Luis Gomez-Skarmeta, Emili Saló y Teresa Adell Development 135, 1215-1221 (2008) Factor de Impacto (2008): 6,812 Resultados Resumen en castellano: Durante el desarrollo embrionario de la gran mayoría de animales, así como durante el desarrollo post-embrionario de Hydra, la vía Wnt/βcatenina establece el eje primario del cuerpo - el eje antero-posterior (AP) de organismos bilaterales y el oral-aboral de cnidarios. Sin embargo, la implicación de esta vía en el restablecimiento y mantenimiento del eje AP durante el desarrollo post-embrionario de bilaterales se desconoce. La planarias poseen una extraordinaria plasticidad morfológica y representan un excelente organismo modelo para estudiar si la vía Wnt/βcatenina también está regulando la formación del eje AP durante la regeneración y homeostasis de bilaterales. En este primer artículo se caracterizan dos parálogos de la βcatenina en la planaria Schmidtea mediterranea (Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2). La βCATENINA es una proteína típicamente bifuncional implicada en transducir la señal Wnt al núcleo y en mediar las uniones adherentes a la membrana celular. Sin embargo, el análisis de las secuencias aminoacídicas de Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2, junto con los experimentos de ARNi en planarias y de sobreexpresión heteróloga en embriones de Xenopus, sugieren que los dos parálogos de S. mediterranea se han subfuncionalizado en dos proteínas monofuncionales que retienen solo una de estas dos funciones características. Notablemente, la Smed-βcatenina-1, pero no la Smed- βcatenina-2, tiene conservada la función de transducir la señal Wnt. La pérdida de función de Smed- βcatenina-1 en planarias resulta en la regeneración de una cabeza en lugar de una cola (fenotipo two-headed), y en una anteriorización progresiva de los organismos tratados (regenerantes y no-regenerantes), hacia planarias totalmente cefalizadas (fenotipo radial-like hypercephalized). El análisis de estos fenotipos con diversos marcadores regionales muestran que esta anteriorización está acompañada por la pérdida de estructuras posteriores y del eje AP, mientras que el eje dorso-ventral no se ve afectado por la inhibición de Smed-βcatenina-1. En conjunto, los datos aportados en este artículo demuestran por primera vez* en bilaterales, que la vía Wnt/βcatenina tiene una función conservada en el restablecimiento y mantenimiento del eje AP en un contexto post- embrionario. * Durante el proceso de publicación del manuscrito aparecieron dos artículos en Science que respaldan estos datos (Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008). 77 Resultados 1215RESEARCH REPORT INTRODUCTION Planarians show a striking morphological plasticity that becomes evident during regeneration and normal tissue homeostasis. They are able to regenerate a whole organism from a piece of almost any part of their body, and, furthermore, they have the ability to grow and degrow according to culture conditions (Morgan, 1898; Saló, 2006). These properties rely on the neoblasts, multipotent stem cells present in adult organisms that are able to differentiate into any planarian cell type (Saló, 2006). The canonical Wnt signalling pathway has a common role in establishing the anteroposterior (AP) axis during development in several species, including mouse (Marikawa, 2006), chick (Nordstrom et al., 2002), zebrafish (Schier and Talbot, 2005), Xenopus (Kiecker and Niehrs, 2001), amphioxus (Holland, 2002), C. elegans (Huang et al., 2007) and Platynereis (Schneider and Bowerman, 2007). In early vertebrate embryos it is also required for dorsoventral (DV) polarity (De Robertis and Kuroda, 2004). In cnidarians, it specifies the oral-aboral embryonic axis, and it also has a reported role in axial patterning during regeneration (Lee et al., 2006). However, in classical models of regeneration, such as fish or amphibians, canonical Wnt signalling has only been demonstrated to be involved in the regenerative capacity (Kawakami et al., 2006; Yokoyama et al., 2007). -Catenin is the key intracellular effector of the canonical Wnt signalling pathway, although it is a bi-functional protein that also regulates cell adhesion as a component of adherens junctions (Schneider et al., 2003). Here, we report the characterization of two -catenin homologs in the planarian species Schmidtea mediterranea (Smed-catenin1 and Smed-catenin2). Silencing of Smed-catenin1 in regenerating and intact planarians induces a gradual anteriorization of the animals that finally leads to a radial-like hypercephalized phenotype, demonstrating the requirement for Smed-catenin1 in AP axis re- establishment and maintenance. Analysis of the protein domains of the S. mediterranea-catenins, and functional assays using Xenopus embryos, demonstrate the involvement of Smed-catenin1 but not Smed-catenin2 in Wnt signalling, suggesting a functional specialization of S. mediterranea -catenins. MATERIALS AND METHODS Organisms The planarians used belong to an asexual race of S. mediterranea collected from Montjuïc, Barcelona, Spain, and maintained as described elsewhere (Molina et al., 2007). Identification and cloning of S. mediterranea genes Fragments of Smed-catenin1 and Smed-catenin2 were identified from the S. mediterranea genomic database through a BLAST search. The corresponding full-length transcripts were amplified by rapid amplification of cDNA ends (RACE) using the Invitrogen GeneRacer Kit (Invitrogen). Smed-HoxD, Smed-AbdBa and Smed-TCEN49 were identified from the S. mediterranea genomic database using homologs from other planarian species (Orii et al., 1999; Garcia-Fernandez et al., 1993; Nogi and Watanabe, 2001; Bueno et al., 1996). Specific primers were designed to isolate the corresponding full-length cDNA sequences. Accession numbers Smed-TCEN49, EU082822; Smed-AbdBa, EU082823; Smed-HoxD, EU082824; Smed-βcatenin1, EU082826; Smed-βcatenin2, EU082825. RNAi silencing RNAi analyses were performed by feeding planarians with bacteria expressing double-stranded RNA (dsRNA) or by dsRNA microinjection, as described by Newmark et al. (Newmark et al., 2003) and Sánchez Alvarado Silencing of Smed-catenin1 generates radial-like hypercephalized planarians Marta Iglesias1, Jose Luis Gomez-Skarmeta2, Emili Saló1 and Teresa Adell1,* Little is known about the molecular mechanisms responsible for axis establishment during non-embryonic processes such as regeneration and homeostasis. To address this issue, we set out to analyze the role of the canonical Wnt pathway in planarians, flatworms renowned for their extraordinary morphological plasticity. Canonical Wnt signalling is an evolutionarily conserved mechanism to confer polarity during embryonic development, specifying the anteroposterior (AP) axis in most bilaterians and the dorsoventral (DV) axis in early vertebrate embryos. -Catenin is a key element in this pathway, although it is a bifunctional protein that is also involved in cell-cell adhesion. Here, we report the characterization of two -catenin homologs from Schmidtea mediterranea (Smed-catenin1/2). Loss of function of Smed-catenin1, but not Smed-catenin2, in both regenerating and intact planarians, generates radial-like hypercephalized planarians in which the AP axis disappears but the DV axis remains unaffected, representing a unique example of a striking body symmetry transformation. The radial-like hypercephalized phenotype demonstrates the requirement for Smed-catenin1 in AP axis re-establishment and maintenance, and supports a conserved role for canonical Wnt signalling in AP axis specification, whereas the role of -catenin in DV axis establishment would be a vertebrate innovation. When considered alongside the protein domains present in each S. mediterranea -catenin and the results of functional assays in Xenopus embryos demonstrating nuclear accumulation and axis induction with Smed-catenin1, but not Smed-catenin2, these data suggest that S. mediterranea -catenins could be functionally specialized and that only Smed-catenin1 is involved in Wnt signalling. KEY WORDS: -catenin, Planarians, Anteroposterior axis, Regeneration Development 135, 1215-1221 (2008) doi:10.1242/dev.020289 1Departament de Genètica, Universitat de Barcelona, 08028 Barcelona, Spain. 2Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide-CSIC, 41013 Sevilla, Spain. *Author for correspondence (e-mail: tadellc@ub.edu) Accepted 4 February 2008 D E V E LO P M E N T 79 1216 and Newmark (Sánchez Alvarado and Newmark, 1999), respectively. The corresponding cDNA for Smed-catenin1 and Smed-catenin2 subcloned into the pPR242 vector was used for feeding. Control animals were fed bacteria containing the vector alone. When dsRNA microinjection was used, Smed-catenin1 and Smed-catenin2 dsRNA was synthesized by in vitro transcription (Roche). Control animals were injected with water. For regeneration experiments, treated planarians were amputated pre- and postpharyngeally, and the trunk pieces allowed to regenerate. Planarians were processed for whole-mount in situ hybridization or whole-mount immunostaining between 3 and 30 days after amputation or last injection (intact animals). Whole-mount in situ hybridization Whole-mount in situ hybridization was carried out essentially as described previously (Nogi and Levin, 2005; Umesono et al., 1999). Digoxigenin- labelled riboprobes for Smed-catenin1, Smed-catenin2, Smed-HoxD, Smed-AbdBa, Smed-TCEN49, Smed-Opsin (K. Eckelt), H.10.2f (Sánchez Alvarado et al., 2002), cintillo (Oviedo et al., 2003), Smed-GluR (F. Cebrià and P. Newmark), septin (Zayas et al., 2005) and eye53 (Zayas et al., 2005; Molina et al., 2007) were synthesized using an in vitro transcription kit (Roche). Whole-mount immunostaining Immunostaining was carried out essentially as described previously (Cebrià and Newmark, 2005; Sánchez Alvarado and Newmark, 1999). The following monoclonal antibodies were used: anti-arrestin (VC-1) (Sakai et al., 2000) at a 1:15,000 dilution; anti-synapsin (anti-SYNORF1, Developmental Studies Hybridoma Bank) at 1:25; and P-Tyr-100 (Cell Signalling Technology) at 1:500. Highly cross-absorbed Alexa Fluor 488- conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody (Molecular Probes) was used at a 1:400 dilution. Xenopus microinjection of mRNA and in situ hybridization The entire coding regions from S. mediterranea -catenins genes were amplified by PCR and inserted into pCS2+ (Turner and Weintraub, 1994). To generate GFP-tagged constructs, a DNA fragment from the 5 region of each cDNA, which includes unique sites within the open reading frame, was PCR-amplified. The 5 primers contained an EcoRI site to clone the fragments in frame within the pCS2-GFP plasmid. The PCR fragments were cloned in pGEM-T Easy vector and sequenced prior to fusion with their corresponding cDNA. For mRNA preparation, the DNAs were linearized and transcribed with SP6 RNA polymerases as described (Harland and Weintraub, 1985), with GTP cap analog (New England Biolabs). Xenopus embryos were injected at the two-cell stage, into one blastomere at the prospective ventral marginal region, with 500-1000 pg of each mRNA, and fixed at the tailbud stage. Antisense RNA probes were prepared from Otx2, Krox20 and Cad3 cDNAs and labelled with digoxigenin (Roche). Xenopus specimens were hybridized as described (Harland, 1991). Antibody staining was performed as described (Gómez-Skarmeta et al., 2001), using the monoclonal antibody 12/101 (Developmental Studies Hybridoma Bank, developed by J. P. Brockes) and rabbit anti-GFP (Molecular Probes). RESULTS AND DISCUSSION Smed-catenin1 inhibition induces a gradual anteriorization of regenerating planarians A search for -catenin homologs in the S. mediterranea genome database yielded two genes, which we called Smed-catenin1 and Smed-catenin2. In situ hybridization experiments revealed different expression patterns for the S. mediterranea -catenins: Smed-catenin1 was expressed ubiquitously but more strongly in the central nervous system (CNS), whereas Smed-catenin2 mRNA was mostly located in the digestive system (see Fig. S1 in the supplementary material). During the process of regeneration, expression of both S. mediterranea -catenin genes was detected in anterior and posterior blastemas (see Fig. S2 in the supplementary material). To assess their potential role in axis re-establishment during regeneration, we carried out RNAi experiments. In situ hybridization for each gene demonstrated that RNAi effectively silenced its expression (see Fig. S3 in the supplementary material). Following Smed-catenin1 silencing, 100% of the regenerating trunk pieces exhibited AP polarity defects, although with varying degrees of transformation: tailless planarians; two-headed planarians (Fig. 1A); two-headed planarians with ectopic eyes next to the normal anterior eyes (Fig. 1B); two-headed planarians with ectopic eyes next to the anterior and posterior ones (Fig. 1C); and, the most severe phenotype, animals displaying apparently radial symmetry with eyes all around the periphery of their body (Fig. 1D; see also Movie 1 in the supplementary material). This last phenotype was referred to as radial-like hypercephalized planarians. The different phenotypes obtained correspond to the degree of severity of the transformation, which was dependent on the time of regeneration and also on the dose of inhibition (Fig. 1I). After Smed-catenin2 silencing, regenerating planarians did not show morphological defects or altered expression of tissue markers (data not shown). Several markers were used to characterize Smed-catenin1- silenced animals. The planarian CNS is composed of two anterior cephalic ganglia (CG) located at one end of two ventral nerve cords (VNCs), which extend along the body and converge in the tail (Fig. 1Q) (Agata et al., 1998). From the two dorsally located eyes, visual projections extend to the CG (Okamoto et al., 2005). During the first regeneration stages (3-7 days) after Smed-catenin1 silencing, in situ hybridization for opsin and cintillo revealed the ectopic differentiation of photoreceptors and mechanoreceptors, respectively, in the posterior blastema (Fig. 1F,J). Analysis of the pan-neuronal marker H.10.2f revealed differentiation of ectopic CG in the posterior blastema (Fig. 1N). Analysis of radial-like hypercephalized planarians (after 20-30 days of regeneration) showed that ectopic photoreceptors and mechanoreceptors expanded from both ends of the regenerating animal to surround the planarian body (Fig. 1H,L). Synapsin immunostaining, which labels neuronal synapses, and in situ hybridization for H.10.2f and Smed-GluR (which is specifically expressed in the lateral branches of the brain), revealed that the CNS of radial-like hypercephalized planarians appears as a thick ring from which cephalic branches ectopically differentiate all around (Fig. 1P,T,V). Note that all photoreceptor cells appeared to be connected through their visual axonal projections to the circular brain, as seen with an anti-arrestin antibody (Fig. 1R). The digestive system of planarians is composed of a pharynx located in the middle of the trunk, from which one anterior and two posterior branches extend (Saló, 2006). The pharynx evaginates through the mouth, which is located ventrally in the middle part of the planarian body. Staining with an anti-P-Tyr antibody revealed that the two posterior branches converge to form a single branch in Smed-catenin1-silenced planarians (Fig. 1E). Use of the same marker also showed that secretory cells located in the prepharyngeal mesenchyme of the wild-type planarian were ectopically differentiated in the posterior part of Smed-catenin1- silenced planarians (Fig. 1G). Altogether, these results show that both neural and non-neural structures acquire anterior identity throughout the body of Smed- catenin1-silenced animals, demonstrating a role for Smed- catenin1 in AP axis re-establishment during planarian regeneration. Trunk and tail identities are lost in Smed- catenin1-silenced planarians To assess whether the differentiation of anterior tissues in central and posterior regions was accompanied by the loss of trunk and tail identities, we analyzed central and posterior markers in Smed- catenin1-silenced planarians. Smed-HoxD and Smed-AbdbA, RESEARCH REPORT Development 135 (7) D E V E LO P M E N T 1217RESEARCH REPORTSmed-catenin1 silencing in planarians Fig. 1. Smed-catenin1 silencing induces a gradual anteriorization of regenerating planarians. (A-E) Stereomicroscope views of regenerating trunk pieces showing the different phenotypes. (F-W,A-H) Several markers were used at different regeneration stages to characterize the phenotype. Analysis of opsin (F-I), cintillo (J-M) and H.10.2f (N-Q) revealed the differentiation of ectopic anterior structures in the posterior blastema, which subsequently expanded throughout the periphery of the planarian body. Anti-arrestin immunostaining (R,S) showed that, in radial-like hypercephalized planarians, all photoreceptors were connected through ectopic visual axons. Synapsin immunostaining (T,U) and in situ hybridization for GluR (V,W) and H.10.2f (P,Q) demonstrated that the cephalic ganglia (cg) and ventral nerve cords (vnc) are transformed into a thick ring from which cephalic branches ectopically differentiate all around the body of radial-like hypercephalized planarians. (A-H) Defects in the pattering of gut and secretory cells were visualized with anti-P-Tyr (green) and anti-arrestin (pink pseudocolour) antibodies. A control planarian viewed at the level of the gut has one anterior and two posterior gut branches (gb; B,F), along with more dorsal secretory cells (sc) in the pre- pharyngeal but not the post-pharyngeal region (D,H). The two posterior gut branches converge into one in Smed-bcatenin1-silenced planarians (E), and secretory cells ectopically differentiate in the post-pharyngeal region (G). (I) The dose dependence of the phenotype and a quantification of the different degrees of anteriorization (1, 2 or 3d x 3inj/d indicates that planarians were injected three times during 1, 2 or 3 consecutive days, respectively). Anterior is shown to the left in those cases where an anteroposterior axis is present. (R-U,A-H) Confocal z-projections. Yellow asterisk indicates the pharynx. Yellow/black arrows and red arrows indicate the differentiation of anterior structures in normal and ectopic positions, respectively. d, days after wounding; a, anterior; p, posterior. Scale bar in A: 270 m in A-C,E,F,N; 180 m in D; 250 m in H,L,P,R,T,W; 395 m in J; 437 m in K; 300 m in all other images. D E V E LO P M E N T 1218 central-posterior and posterior Hox genes, respectively, were not expressed at 3 days of regeneration, the earliest stage at which they are detected in wild-type animals (Fig. 2A,E). Smed-HoxD continued not to be expressed throughout regeneration (Fig. 2C). Note that the absence of this marker indicated the disappearance of the mouth. Expression of Smed-TCEN49, a central marker associated with the pharynx, had almost disappeared at the latest stage (Fig. 2G), and disappearance of the pharynx was also evident when analyzed with other markers (Fig. 1T,V and Fig. 2I,M). These results demonstrate that the anteriorization of Smed-catenin1- silenced planarians is accompanied by the disappearance of trunk and tail identities. A possible role for Hox genes as targets of Smed- catenin1 needs further investigation. The DV axis is unaffected in Smed-catenin1- silenced planarians As the AP axis is extensively transformed, we analyzed whether the DV axis was affected after Smed-catenin1 inhibition. Analysis of septin and eye53 expression (dorsal and ventral markers, respectively) revealed that the DV axis of radial-like hypercephalized planarians was not affected (Fig. 2I-P). Taken together, these results demonstrate that in regenerating Smed-catenin1-silenced animals the posterior blastema acquires anterior identity and the trunk region is anteriorized, ultimately generating radial-like hypercephalized animals in which the AP axis is lost but the DV axis remains unaffected. Although the canonical Wnt signalling pathway has a common role in establishing the AP axis during development in several species, from cnidarians to vertebrates (Holland, 2002; Kiecker and Niehrs, 2001; Nordstrom et al., 2002; Schneider and Bowerman, 2007), in vertebrates, at earlier developmental stages, nuclear accumulation of -catenin leads to dorsalization of the embryo (De Robertis and Kuroda, 2004). Our results support a conserved role for the canonical Wnt signal in AP axis specification throughout evolution, and provide further confirmation that its role in DV axis establishment is a vertebrate innovation. In vertebrate models of regeneration, the Wnt pathway has a reported role in cell proliferation and regenerative outgrowth, but not in axis re-establishment (Kawakami et al., 2006; Yokoyama et al., 2007). Cnidarians are the only species in which this pathway has a demonstrated axial patterning role during regeneration (Lee et al., 2006), although a direct functional study of cnidarian -catenin has not been reported. Our results, together with two recent reports also in planarians (Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008), are the first direct demonstration of the requirement of -catenin in AP patterning during the process of regeneration. In contrast to other models, such as Xenopus and mouse, in which the inhibition of - catenin during development produces complex defects and non- viable embryos due to the inhibition of organizer formation and the impairment of gastrulation (Heasman et al., 2000; Huelsken et al., 2000), the planarian model allows in vivo analysis of mutant phenotypes for essential developmental genes. Smed-catenin1 is required for AP axis maintenance during homeostasis To address whether Smed-catenin1 activity could also be required for maintenance of the AP axis, we silenced Smed-catenin1 in intact planarians. At 10-17 days after Smed-catenin1 silencing, ectopic eyes began to differentiate first in the tail region and afterwards anteriorly, adjacent to the original eyes (Fig. 3A,D). Ectopic mechanoreceptor cells appeared in the tail and lateral regions (Fig. 3G), and ectopic brain differentiated along the length of the VNCs (Fig. 3J,M). Around 30 days after Smed-catenin1 silencing, radial-like hypercephalized organisms that were indistinguishable from Smed-catenin1-silenced regenerating animals were observed. These animals showed ectopic eyes (Fig. 3B,E) that were all connected to the brain by their visual axons, ectopic mechanoreceptor cells all around the periphery of the body (Fig. 3H), and ectopic branching of the CNS all around the body (Fig. 3K,N). Analysis of central and posterior markers revealed the disappearance of trunk and tail identities (Fig. 3P,R). These data demonstrate that Smed-catenin1 activity is required not only RESEARCH REPORT Development 135 (7) Fig. 2. Trunk and tail identities are lost in Smed-bcatenin1-silenced planarians, whereas the dorsoventral axis remains unaffected. (A-F) Analysis of Smed-HoxD (A-D) and Smed-AbdBa (E,F) reveals the disappearance of tail and trunk identities, including the mouth (m). (G,H) Expression of Smed-TCEN49 almost disappears in radial-like hypercephalized planarians. (I-P) Analysis of Septin (I-L) and Eye53 (M-P) expression demonstrates that the dorsoventral axis is not affected. Eye53 is also expressed in the eyes (black arrowheads in the control, N), revealing the ectopic eyes around the treated animal (M). Anterior is shown to the left in those cases where an anteroposterior axis is present. Yellow/black asterisks indicate the pharynx. d, dorsal view; v, ventral view. Scale bar in A: 270 m in A,E; 250 m in C,G,I,K,M,O; 300 m in all other images. D E V E LO P M E N T during regeneration, but also during normal tissue homeostasis to maintain AP axis polarity in planarians. Interestingly, our data show that the anteriorization process in intact animals follows the same pattern as in regenerating trunks: it starts mainly in the tail region and later expands to the rest of the body (see Fig. 3T for quantification). Further studies are required to elucidate whether this is a direct consequence of the suppression of Smed-catenin1 activity or an indirect effect due to, for example, a higher rate of cell turnover in the tail. The extreme radial-like phenotype obtained after Smed-catenin1 inhibition suggests that, in adult planarians, Smed-catenin1 activity is required to confer posterior identity, and its inhibition is required to acquire head fate. The differential Smed-catenin1 activity along the AP axis in planarians could be a response to a morphogenetic Wnt gradient, as has been described for the patterning of the CNS in Xenopus embryos (Kiecker and Niehrs, 2001). Accordingly, during 1219RESEARCH REPORTSmed-catenin1 silencing in planarians Fig. 3. Smed-catenin1-silenced intact planarians transform to radial-like hypercephalized planarians. (A-C) Stereomicroscope views showing two different stages. (D-S) Several markers were used at different days after Smed-catenin1 silencing to characterize the phenotype. Anti-arrestin (D-F), cintillo (G-I), H.10.2f (J-L), synapsin (M- O), Smed-TCEN49 (P,Q) and Smed-HoxD (R,S). (T) Quantification of the different phenotypes observed after Smed-bcatenin1 silencing, showing that the anteriorization started in most of the animals in the posterior region. Anterior is to the left in those cases where an anteroposterior axis is present. Confocal z-projections (D-F,M-O). Yellow asterisks indicate the pharynx. Yellow/black arrows and red arrows indicate the differentiation of anterior structures in normal and ectopic positions, respectively. d, days after silencing. Scale bar in A: 200 m in B,E,H,K,N,P,R; 300 m in all other images. Fig. 4. mRNA injection of Smed-catenin1 but not Smed- catenin2 induces a secondary axis in Xenopus embryos. (A,B) Xenopus embryos injected with Smed-catenin1 (A) or Smed- cat2 RNA (B), showing Otx2 (forebrain, red arrow), Krox20 (rhombomeres 3 and 5, green arrows) and Cad3 (spinal cord, white arrows) expression, along with muscle staining with the antibody 12/101 (brown signal). A schematic representation of the structure of each -catenin is shown under the corresponding image. GSK3-binding domain and adhesion domains are shown with red and blue boxes, respectively. (C-H) Neurula (C-F) and tailbud (G,H) stage embryos injected with GFP-tagged constructs for both Schmidtea mediterranea -catenins. (I,J) Smed-catenin1 but not Smed-catenin2 is found preferentially in the cell nucleus. (K) Quantification of the secondary axis obtained after each Smed-catenin injection (Xenopus -catenin was used as a control). D E V E LO P M E N T 1220 Xenopus development, repression of Wnt signalling is a characteristic of the head organizer (Niehrs, 1999; Niehrs, 2004). However, the effect could also be explained by a mechanism in which -catenin regulates sister-cell asymmetry following cell division, as occurs along the animal-vegetal axis during Platynereis and C. elegans embryogenesis (Schneider and Bowerman, 2007; Kaletta et al., 1997; Lin et al., 1998). The classical janus-headed phenotype (Morgan, 1898), in which two-headed planarians are produced after cutting extremely thin fragments, is a well-known model that supports the gradient hypothesis (Child, 1911), because the phenotype may be explained by the inability of such a small field to support a Smed- catenin1 activity gradient. The analysis of Smed-catenin1 activity, by analysis of its subcellular localization, for instance, will help to resolve this question. Functional characterization of S. mediterranea - catenins in Xenopus embryos Sequence analysis of S. mediterranea -catenins demonstrated that the GSK3-binding domain, required for -catenin degradation during Wnt signalling, is present in Smed-catenin1 but not in Smed-catenin2. By contrast, residues involved in cell-cell adhesion were conserved in Smed-catenin2 but not in Smed-catenin1 (for details, see Fig. S4 in the supplementary material). To test whether S. mediterranea -catenins could have undergone a functional specialization, we assayed their ability to induce a secondary axis in Xenopus embryos (McMahon and Moon, 1989). A secondary axis was induced after Smed-catenin1 injection but not after Smed- catenin2 injection (Fig. 4A,B,K). A GFP-tagged construct of each S. mediterranea -catenin was injected to quantify the amount of translated protein in each embryo, demonstrating that even when twice the amount of Smed-catenin2 was present, it could never induce a secondary axis (Fig. 4C-H). Moreover, anti-GFP staining demonstrated that Smed-catenin1, but not Smed-catenin2, accumulates in the nucleus (Fig. 4I,J). Altogether, these results demonstrate the functional conservation of Smed-catenin1 in Wnt signalling, and point to a functional specialization of S. mediterranea -catenins, such that Smed-catenin1 would be involved in signalling and Smed- bcatenin2 would be involved in the membrane cell-cell contacts. All metazoans studied to date have a single -catenin gene encoding a protein containing both kinds of functional domains, involved in signaling and in cell-cell adhesion (Schneider et al., 2003), with the exception of C. elegans, which is the only species in which -catenin gene duplication and functional specialization have been reported (Korswagen et al., 2000). A phylogenetic analysis using -catenin homologs from several species demonstrates that the duplication in S. mediterranea occurred independently from the one in C. elegans (see Fig. S5 in the supplementary material). Molecular studies of other species belonging to different phyla will clarify the significance of these duplications. We thank F. Cebrià, P. Martinez, J. Garcia-Fernandez, M. Irimia, J. Baguñà and members of the laboratory for discussion and suggestions; F. Cebrià and P. Newmark for providing H.10.2f, cintillo, Smed-GluR, septin and Eye53 clones; K. Eckelt for the Smed-opsin clone; H. Orii and K. Watanabe for providing anti- VC-1; M. Andreazzoli, A. Fainsod, N. Papalopulu and D. Turner for reagents; and I. Patten for editorial advice. This work was supported by grants from the Ministerio de Educación y Ciencia, Spain, from AGAUR (Generalitat de Catalunya, Spain), and from La Junta de Andalucía, Spain. Supplementary material Supplementary material for this article is available at http://dev.biologists.org/cgi/content/full/135/7/1215/DC1 References Agata, K., Soejima, Y., Kato, K., Kobayashi, C., Umesono Y. and Watanabe, K. (1998). Structure of the planarian nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zool. Sci. 15, 433-440. Bueno, D., Baguna, J. and Romero, R. (1996). A central body region defined by a position-specific molecule in the planarian Dugesia (Girardia) tigrina: spatial and temporal variations during regeneration. Dev. Biol. 178, 446-458. Cebrià, F. and Newmark, P. A. (2005). Planarian homologs of netrin and netrin receptorare required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development 132, 3691- 3703. Child, C. M. (1911). Studies on the dynamics of morphogenesis and inheritance in experimental reproduction. I. The axial gradient in planaria dorotocephala as a limiting factor in regulation. J. Exp. Zool. 10, 265-320. De Robertis, E. M. and Kuroda, H. (2004). Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 285-308. Garcia-Fernandez, J., Baguna, J. and Salo, E. (1993). Genomic organization and expression of the planarian homeobox genes Dth-1 and Dth-2. Development 118, 241-253. Gómez-Skarmeta, J. L., de la Calle-Mustienes, E. and Modolell, J. (2001). The Wnt-activated Xiro1 gene encodes a repressor that is essential for neural development and downregulates BMP4. Development 128, 551-560. Gurley, K. A., Rink, J. C. and Sánchez Alvarado, A. (2008). Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science 319, 323-327. Harland, R. (1991). In situ hybridization: an improved whole mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695. Harland, R. and Weintraub, H. (1985). Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA. J. Cell Biol. 101, 1094-1099. Heasman, J., Kofron, M. and Wylie, C. (2000). Beta-catenin signalling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev. Biol. 222, 124-134. Holland, L. Z. (2002). Heads or tails? Amphioxus and the evolution of anterior- posterior patterning in deuterostomes. Dev. Biol. 24, 209-228. Huang, S., Shetty, P., Robertson, S. M. and Lin, R. (2007). Binary cell fate specification during C. elegans embryogenesis driven by reiterated reciprocal asymmetry of TCF POP-1 and its coactivator -catenin SYS-1. Development 134, 2685-2695. Huelsken, J., Vogel, R., Brinkmann, V., Erdmann, B., Birchmeier, C. and Birchmeier, W. (2000). Requirement for beta-catenin in anterior-posterior axis formation in mice. J. Cell Biol. 148, 567-578. Kaletta, T., Schnabel, H. and Schnabel, R. (1997). Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature 390, 294-298. Kawakami, Y., Rodriguez Esteban, C., Raya, M., Kawakami, H., Marti, M., Dubova, I. and Izpisua Belmonte, J. C. (2006). Wnt/beta-catenin signalling regulates vertebrate limb regeneration. Genes Dev. 20, 3232-3237. Kiecker, C. and Niehrs, C. (2001). A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. Development 128, 4189-4201 Korswagen, H. C., Herman, M. A. and Clevers, H. C. (2000). Distinct beta- catenins mediate adhesion and signalling functions in C. elegans. Nature 406, 527-532. Lee, P. N., Pang, K., Matus, D. Q. and Martindale, M. Q. (2006). A WNT of things to come: evolution of Wnt signalling and polarity in cnidarians. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 157-167. Lin, R., Hill, R. J. and Priess, J. R. (1998). POP-1 and anterior-posterior fate decisions in C. elegans embryos. Cell 92, 229-239. Marikawa, Y. (2006). Wnt/beta-catenin signalling and body plan formation in mouse embryos. Semin. Cell Dev. Biol. 172,175-184. McMahon, A. P. and Moon, R. T. (1989). Ectopic expression of the proto- oncogene int-1 in Xenopus embryos leads to duplication of the embryonic axis. Cell 58, 1075-1084. Molina, M. D., Saló, E. and Cebrià, F. (2007). The BMP pathway is essential for re-specification and maintenance of the dorsoventral axis in regenerating and intact planarians. Dev. Biol. 311, 79-94. Morgan, T. H. (1898). Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. and Sanchez Alvarado, A. (2003). Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 Suppl. 1, 11861- 11865. Niehrs, C. (1999). Head in the WNT: the molecular nature of Spemann’s head organizer. Trends Genet. 15, 314-319. Niehrs, C. (2004). Regionally specific induction by the Spemann-Mangold organizer. Nat. Rev. Genet. 5, 425-434. Nogi, N. and Levin, M. (2005). Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev. Biol. 287, 314-335. RESEARCH REPORT Development 135 (7) D E V E LO P M E N T Nogi, T. and Watanabe, K. (2001). Position-specific and non-colinear expression of the planarian posterior (Abdominal-B-like) gene. Dev. Growth Differ. 43, 177- 184. Nordstrom, U., Jessell, T. M. and Edlund, T. (2002). Progressive induction of caudal neural character by graded Wnt signalling. Nat. Neurosci. 5, 525-532. Okamoto, K., Takeuchi, K. and Agata, K. (2005). Neural projections in planarian brain revealed by fluorescent dye tracing. Zoolog. Sci. 22, 535-546. Orii, H., Kato, K., Umesono, Y., Sakurai, T., Agata, K. and Watanabe, K. (1999). The planarian HOM/HOX homeobox genes (Plox) expressed along the anteroposterior axis. Dev. Biol. 210, 456-468. Oviedo, N. J., Newmark, P. A. and Sanchez Alvarado, A. (2003). Allometric scaling and proportion regulation in the freshwater planarian Schmidtea mediterranea. Dev. Dyn. 226, 326-333. Petersen, C. P. and Reddien, P. W. (2008). Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science 319, 327- 330. Sakai, F., Agata, K., Orii, H. and Watanabe, K. (2000). Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians – eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zool. Sci. 17, 375-381. Saló, E. (2006). The power of regeneration and the stem-cell kingdom: freshwater planarians (Platyhelminthes). BioEssays 28, 546-559. Sánchez Alvarado, A. and Newmark, P. (1999). Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5049-5054. Sánchez Alvarado, A., Newmark, P. A., Robb, S. M. C. and Juste, R. (2002). The Schmidtea mediterranea database as a molecular resource for studying platyhelminthes, stem cells and regeneration. Development 129, 5659-5665. Schier, A. F. and Talbot, W. S. (2005). Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu. Rev. Genet. 39, 561-613. Schneider, S. Q. and Bowerman, B. (2007). beta-Catenin asymmetries after all animal/vegetal-oriented cell divisions in Platynereis dumerilii embryos mediate binary cell-fate specification. Dev. Cell 13, 73-86. Schneider, S. Q., Finnerty, J. R. and Martindale, M. Q. (2003). Protein evolution: structure-function relationships of the oncogene beta-catenin in the evolution of multicellular animals. J. Exp. Zoolog. B Mol. Dev. Evol. 295, 25-44. Turner, D. L. and Weintraub, H. (1994). Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 12, 1434-1447. Umesono, Y., Watanabe, K. and Agata, K. (1999). Distinct structural domains in the planarian brain defined by the expression of evolutionarily conserved homeobox genes. Dev. Genes Evol. 209, 31-39. Yokoyama, H., Ogino, H., Stoick-Cooper, C. L., Grainger, R. M. and Moon, R. T. (2007). Wnt/beta-catenin signalling has an essential role in the initiation of limb regeneration. Dev. Biol. 306,170-178. Zayas, R. M., Hernandez, A., Habermann, B., Wang, Y., Stary, J. M. and Newmark, P. A. (2005). The planarian Schmidtea mediterranea as a model for epigenetic germ cell specification: analysis of ESTs from the hermaphroditic strain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 18491-18496. 1221RESEARCH REPORTSmed-catenin1 silencing in planarians D E V E LO P M E N T Fig. S1. Expression pattern of Smed-βcatenin1 and Smed-βcatenin2 by whole- mount in situ hybridization. (A) Smed-βcatenin1 mRNA shows a ubiquitous expression with high levels in the central nervous system (cephalic ganglia and ventral nerve cords) and in the pharynx. (B) Smed-βcatenin2 mRNA is detected in the digestive system and in the periphery of the cephalic ganglia. Anterior is to the left. Asterisks indicate the pharynx. agb, anterior gut branch; cg, cephalic ganglia; pgb, posterior gut branch; vnc, ventral nerve cords. Scale bar: 300 µm. Fig. S2. Expression pattern of Smed-βcatenin1 and Smed-βcatenin2 during regeneration. Whole-mount in situ hybridization of Smed-βcatenin1 (A-D) and Smed- βcatenin2 (E-H) at different stages of regeneration. Both Schmidtea mediterranea β- catenins are expressed in both blastemas during regeneration (A-C,E-G). Smed- βcatenin1 is also detected in sensory cells in the head periphery (arrowheads in C). Smed-βcatenin2 expression in the digestive system appears first as two spots in the posterior blastema (arrowheads in F). Smed-βcatenin2 is also detected in some cells around the cephalic ganglia (arrowheads in G). The dotted lines indicate the blastema edges. Anterior is to the left. dR, days of regeneration; b, blastema; pb, postblastema. Scale bar: 300 µm. Fig. S3. Efficiency of Smed-βcatenin1 and Smed-βcatenin2 silencing after dsRNA injection.Smed-βcatenin1 (A) and Smed-βcatenin2 (C) are expressed in both the anterior and posterior blastemas in trunk pieces after 3 days of regeneration. After Smed-βcatenin1 dsRNA (B) and Smed-βcatenin2 dsRNA (D) injections, Smed-βcatenin1 and Smed-βcatenin2 expression is not detected in regenerating trunk pieces. Anterior is to the left. Scale bar: 300 µm. Fig. S4. Protein alignment showing the conservation of functional domains between Smed-βcatenin1, Smed-βcatenin2 and β-catenins from other species. The domains involved in Wnt-signaling and in adhesion are marked in red and blue, respectively. The GSK3-binding domain contains the residues phosphorylated by CKI (Ser45) and GSK3 (Ser33, Ser37, Thr41), which are indicated by arrows. Sequential phosphorylation of β-catenin by CKI and GSK3 target it for ubiquitination and proteolytic degradation. The domain is conserved in Smed-βcatenin1 but not in Smed-βcatenin2. Two domains implicated in α -catenin binding are located N-terminal to the Armadillo repeats. The distance between them (21 aa) is also a conserved feature. These domains are conserved in Smed-βcatenin2 but not Smed-βcatenin1. A PDZ-like target sequence at the most C-terminal end is also conserved in β-catenins from all species. This domain has been linked to E-cadherin binding and is conserved in Smed-βcatenin2 but not Smed-βcatenin1. The C-terminal region of β -catenin functions in transactivation and contains strong activation domains that bind to chromatin-remodeling subunits. This region is marked with a dashed red line. Y142 (marked with a black diamond) is a conserved residue located just before the first Armadillo repeat. The phosphorylation state of this residue modulates the switch between adhesion and transcription. Its phosphorylation induces BCL9/legless binding and inhibits the α-catenin interaction. It is conserved in Smed-βcatenin1 but not Smed-βcatenin2. The 12 Armadillo repeats are underlined (R1-R12). Note that the domains conserved in Smed-βcatenin1 and Smed- βcatenin2 correspond to the same conserved regions in Ce-BAR1 (with a signaling function) and Ce-HMP2 (with an adhesion function), respectively. Accurate multiple 87 Resultados amino-acid sequence alignments of β -catenin proteins were obtained using MAFFT version 5.8 (http://timpani.genome.ad.jp/%7Emafft/server/) and edited using the BioEdit Sequence Alignment Editor. Hs, Homo sapiens; Bf, Branchiostoma floridae; Lv, Litechinus variegatus; Hv, Hydra vulgaris; Dm, Drosophila melanogaster; Ce, Caenorhabditis elegans. Fig. S5. Phylogenetic analysis of β -catenin homologs from different species. Phylogenetic analysis demonstrates that the Schmidtea mediterranea β-catenin duplication is independent of C. elegans β-catenin duplication. The two S. mediterranea β-catenins are shown in bold and red. The three homologs of C. elegans are in blue. Plakoglobin (shown in green), which is a vertebrate-specific β -catenin duplication, has also been included in the phylogenetic study. Accurate multiple amino-acid sequence alignments of β -catenin and plakoglobin proteins were obtained using MAFFT version 5.8 (http://timpani.genome.ad.jp/%7Emafft/server/), and, to infer the phylogenetic tree from the amino-acid alignment, we used the neighbor-joining method with a JTT matrix using the MEGA software version 3.1. For the neighbor joining, a bootstrap analysis (500 replicates) was also done. Full-length amino-acid sequences were used for all proteins. Accession numbers are: Bf-bcat, AAY34439; Ce-BAR-1, AAC17424; Ce-HMP-2, AAB94552; Ce-wrm-1, AAC47748; Ci-bcat, BAA92185; Cv-bcat, AAL49497; Dd- Aardvark, AAG17931; Dj-bcat, BAD93243; Dm-armadillo, P18824; Dr-plakoglobin, AAH58305; Hs-bcat, P35222; Hs-plakoglobin, CAA92522; Hv-bcat, AAQ02885; Lv-bcat, AAC06340; Mm-plakoglobin, AAH40757; Pp-bcat, AAX47336; Sp-bcat, NP_001027543; Tg-bcatg, P35223; Tt-bcat, BAD90106; Uc-bcat, P35224. Bf, Branchiostoma floridae; Ce, Caenorhabditis elegans; Ci, Ciona intestinalis; Cv, Chaetopterus variopedatus; Dd, Dictyostelium discoideum; Dj, Dugesia japonica; Dm, Drosophila melanogaster; Dr, Danio rerio; Hs, Homo sapiens; Hv, Hydra vulgaris; Lv, Lytechinus variegatus; Mm, Mus musculus; Pp, Pristionchus pacificus; Sp, Strongylocentrotus purpuratus; Tg, Tripneustes gratilla; Tt, Tubifex tubifex; Uc, Urechis caupo. 88 Suplementary Figure 1                               Suplementary Figure 2                               Suplementary Figure 3                                   89 Resultados Suplementary Figure 4                                                                                                 90   Suplementary Figure 5                                                                                               91 Resultados     Artículo 2 Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/β- catenin pathway. Marta Iglesias, Maria Almuedo-Castillo, A. Aziz Aboobaker, Emili Saló. Developmental Biology 358 (2011) 68-78 Factor de Impacto (2011): 4,069 93 Resultados Resumen en castellano: En el segundo artículo se estudia las consecuencias de una sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina en planarias. Con tal fin se caracterizan dos parálogos de la Axina en Schmidtea mediterranea (Smed-axinA y Smed-axinB), puesto que este componente de la vía Wnt es un regulador negativo intracelular muy conservado a lo largo de la filogenia animal. Experimentos de ARNi simple o conjunto, sugieren que Smed-axinA y Smed- axinB actúan de manera sinérgica en planarias regulando negativamente Smed- βcatenina-1. Así, la pérdida de función de ambas axinas resulta en un fenotipo two- tailed - fenotipo descrito previamente tras inhibir Smed-APC-1, otro regulador negativo de la vía Wnt - ; mientras que el triple ARNi contra las axinas y Smed-βcatenina-1 da lugar a planarias two-headed (fenotipo de Smed-βcatenina-1 ARNi). De manera destacable, la sobre-activación de la vía Wnt/bcatenina no inhibe la regeneración inicial del cerebro en las heridas anteriores de los heteromorfos two-tailed obtenidos tras inhibir Smed-axins o Smed-APC-1. Es más, el primordio del cerebro se mantiene con el transcurso del tiempo y muchas planarias two-tailed diferencian otro primordio del cerebro justo al lado de la faringe normal. Estos primordios del cerebro, aunque se mantienen en el tiempo, no se desarrollan en este fondo ARNi de Smed-axins o Smed- APC-1. En conjunto, estos datos demuestran por primera vez en planarias que la vía Wnt/βcatenina regula diferentes procesos del desarrollo del cerebro/cabeza y sugiere que los mecanismos que determinan la formación del primordio del cerebro pueden ser desacoplados de la polaridad AP que otorga la vía Wnt/βcatenina. Finalmente, en este artículo se intenta abordar la relación entre el restablecimiento de la polaridad regenerativa y la correcta morfogénesis del cerebro. Para ello, se realizan experimentos de inhibición conjunta de Smed-APC-1 y Smed-ndk, un tipo de receptor de FGF que restringe la diferenciación del cerebro a la cabeza. Mostramos que la inhibición de Smed-APC-1 en un fondo ndk ARNi acentúa la expansión del cerebro hacia posterior característica de ndk, lo que indica una relación indirecta entre la vía FGFR/ndk y la vía Wnt/βcatenina en el establecimiento de los límites posteriores del cerebro en planarias. 95 Resultados Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/β-catenin pathway Marta Iglesias a,⁎, Maria Almuedo-Castillo a, A. Aziz Aboobaker b, Emili Saló a,⁎ a Department of Genetics and Institute of Biomedicine, University of Barcelona, Av. Diagonal 645, E-08028 Barcelona, Catalonia, Spain b Centre for Genetics and Genomics, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, Nottingham, NG7 2UH, UK a b s t r a c ta r t i c l e i n f o Article history: Received for publication 24 December 2010 Revised 9 June 2011 Accepted 8 July 2011 Available online 20 July 2011 Keywords: Regeneration Planarian AP polarity Brain Wnt/β-catenin signaling Axin Analysis of anteroposterior (AP) axis specification in regenerating planarian flatworms has shown that Wnt/β-catenin signaling is required for posterior specification and that the FGF-like receptor molecule nou- darake (ndk) may be involved in restricting brain regeneration to anterior regions. The relationship between re-establishment of AP identity and correct morphogenesis of the brain is, however, still poorly understood. Here we report the characterization of two axin paralogs in the planarian Schmidtea mediterranea. Although Axins are well known negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, no role in AP specification has previously been reported for axin genes in planarians. We show that silencing of Smed-axin genes by RNA interference (RNAi) results in two-tailed planarians, a phenotype previously reported after silencing of Smed-APC-1, another β-catenin inhibitor. More strikingly, we show for the first time that while early brain formation at anterior wounds remains unaffected, subsequent development of the brain is blocked in the two- tailed planarians generated after silencing of Smed-axin genes and Smed-APC-1. These findings suggest that the mechanisms underlying early brain formation can be uncoupled from the specification of AP identity by the Wnt/β-catenin pathway. Finally, the posterior expansion of the brain observed following Smed-ndk RNAi is enhanced by silencing Smed-APC-1, revealing an indirect relationship between the FGFR/Ndk andWnt/β-catenin signaling systems in establishing the posterior limits of brain differentiation. © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. Introduction The ability of adult animals to functionally restore missing structures varies in degree across the animal kingdom. One of the most striking examples of regenerative capacity is found in planarian flatworms, which are capable of regenerating a whole organism from a small piece of almost any part of their body. After amputation, planarian neoblasts (adult stem cells) proliferate to give rise to a mass of unpigmented tissue called the blastema, where the missing parts will differentiate. In addition, remodeling of pre-existing tissues (a phenomenon termed morphallaxis, Morgan, 1901) is required to integrate the new and old tissues thereby properly restoring the new body proportions (for reviews see Agata, 2003; Cebrià et al., 2002a; Newmark and Sanchez Alvarado, 2002; Reddien and Sanchez Alvarado, 2004; Saló, 2006; Sanchez Alvarado, 2006). Since TH Morgan's classical works at the beginning of the 20th century, many scientists have sought to understand how the anterior–posterior (AP) axis is re-established during planarian regeneration. After amputation of the head and tail of a planarian, the remaining tissue is able to register which tissue is missing and activate mechanisms to re-establish axial polarity and differentiate head and tail structures at the anterior and posterior wounds respectively. The canonical Wnt signaling pathway is an evolutionarily conservedmechanism generally used duringmetazoan development to promote posterior polarized features of the AP axis (Petersen and Reddien, 2009a). Its main function at the level of signal transduction is to regulate the stability of the transcriptional coactivatorβ-catenin, the key downstream effector. In the absence of Wnt ligand stimulation, cytoplasmic β-catenin is constitutively targeted for degradation by the action of a multiprotein destruction complex containing the scaffolding protein Axin, Adenomatous Polyposis Coli (APC), Glycogen Synthase Kinase 3 and Casein Kinase 1. Wnt ligand inactivation of the β-catenin destruction complex stabilizes β-catenin, which accumulates and translocates to the nucleus where, together with T-cell factor/Lymphoid enhancer factor proteins, it activates target gene transcription (Logan and Nusse, 2004). In planarians, it has been widely demonstrated that the Wnt/β-catenin signaling pathway is required for posterior specification during regeneration and homeo- stasis (Adell et al., 2009; Gurley et al., 2008; Iglesias et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008, 2009b, 2011). Whereas Smed-β- catenin1 silencing by RNA interference (RNAi) induces a gradual anteriorization of regenerating planarians that ranges from two- Developmental Biology 358 (2011) 68–78 ⁎ Corresponding authors. E-mail addresses: esalo@ub.edu (E. Saló), martigles@gmail.com (M. Iglesias). 0012-1606/$ – see front matter © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.ydbio.2011.07.013 Contents lists available at ScienceDirect Developmental Biology j ourna l homepage: www.e lsev ie r.com/deve lopmenta lb io logy 97 headed to hypercephalized planarians (Iglesias et al., 2008), RNAi for Smed-APC-1 results in planarians that regenerate a tail instead of a head (Gurley et al., 2008). Furthermore, loss of function of Wnt11-6 (formerly known as WntA [Gurley et al., 2010]) results in the expansion of the brain towards more posterior regions with- out further disturbing head-trunk identities (Adell et al., 2009; Kobayashi et al., 2007), a phenotypic trait also observed after silencing of the FGFR-related gene nou-darake (ndk) (Cebrià et al., 2002a; Felix and Aboobaker, 2010). The relationship between the re- establishment of AP identity and correct morphogenesis of the central nervous system, however, remains poorly understood. Here we report the characterization of two axin paralogs from Schmidtea mediterranea (Smed-axinA and Smed-axinB). We show that while both Smed-axin genes are required for the re-establishment of AP polarity during planarian regeneration, their effect on blastema polarity does not influence early brain differentiation. However, Smed-axinA/Smed-axinB double RNAi (abbreviated as Smed-axins RNAi) does prevent the development of a fully formed brain. Remarkably, loss of function of another β-catenin inhibitor, Smed- APC-1, phenocopies Smed-axins RNAi. Furthermore, we provide evidence of an indirect relationship between the Wnt/β-catenin and FGFR/ndk signaling systems in the control of the posterior limits of brain differentiation. These findings provide clear evidence of independent mechanisms controlling early brain differentiation and subsequent development and provide important insights into the relationship between the specification of AP identity and organogen- esis during regeneration. Material and methods Organisms The planarians used in these experiments belong to an asexual biotype of S. mediterranea collected from an artificial spring in Montjuïc, Barcelona, Spain. The animals were maintained at 20 °C in a 1:1 (v/v) mixture of distilled water and tap water treated with AquaSafe (TetraAqua, Melle, Germany). Animals were fed with homogenized organic veal liver and starved for at least a week before the experiments. Planarians 2 to 6 mm in length were used for all experiments. Isolation of S. mediterranea genes The S. mediterranea genome is in the process of being sequenced and assembled (Washington University, St. Louis, USA). Fragments of Smed-axinA and Smed-axinB were identified from the S. mediterranea genomic contigs through a BLAST search with axin sequences from other species. The corresponding full-length transcripts were ampli- fied by rapid amplification of cDNA ends (RACE) using the Invitrogen GeneRacer Kit (Invitrogen). The identity of Smed-axinA and Smed- axinB cDNAs was confirmed by sequencing (ABI Prism 3730 Applied Biosystems/Hitachi, Foster City, USA) and BLASTX analysis. Smed-Gpas (G protein α-subunit) was identified from the S. mediterranea genomic database using the Dj-1791hh homolog from Dugesia japonica (Cebrià et al., 2002b). Specific primers were designed to partially isolate the corresponding cDNA sequence. RNAi analysis Double-stranded RNAs (dsRNAs) were synthesized by in vitro transcription (Roche) as described previously (Boutros et al., 2004; Sanchez Alvarado and Newmark, 1999). dsRNA microinjections were performed as described elsewhere (Sanchez Alvarado and Newmark, 1999) following the standard protocol of a 32 nl injection of dsRNA on three consecutive days before amputation (one round of injection). Control animals were injected with water or a dsRNA corresponding to the GFP sequence. For combinatorial RNAi experiments, the concentration of dsRNA for each target gene was maintained at the same dose as for single RNAi after mixing. For experiments involving low doses of Smed-β-catenin1 and Smed-APC-1 RNAi, animals were injected just one day before amputation. In double Smed-ndk(−)/ Smed-APC-1(−) experiments, animals were injected with two consecutive rounds of Smed-APC-1 dsRNAi with amputation just after the first round, followed by a third round of Smed-ndk RNAi injection. The respective Smed-APC-1(−) and Smed-ndk(−) controls were injected with GFP when appropriate to follow the same protocol of injection and amputation. The following pairs of specific primers were used to generate each dsRNA target gene: dsRNA against Smed-axinA 5′-AGAGATGTCGATTGTTCTCATGTG-3′; 5′-TTGTGAATAAGGAGGTCTATTGTGC-3′ dsRNA against Smed-axinB 5′-CGAGTAACTTTGATTCAGGAGTCAG-3′; 5′-TAAGGAACAGGGTCATTTCCTATATAG-3′ dsRNA against Smed-β-catenin1 5′-TCAGGGATTGCAGATTCTCATTCG-3′; 5′-GGCTAATGATCAATTCCAGTCC-3′ dsRNA against Smed-APC-1 5′-TCTACGGGATCTGCTGCTAC-3′; 5′-CTATCATAGTCATCAGGATACG-3′ Quantitative real-time PCR Total RNAwas extracted fromapool of threeheador trunk fragments of RNAi-treated planarians using TRIzol® reagent (invitrogen). RNA samples were DNAse-treated using DNase I (Roche), and cDNA was synthesized using a First-Strand Synthesis System kit from Invitrogen. Real-timePCRwasperformedusingSYBRGreen (Applied Biosystems) in an ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Three samples for each condition were run in parallel. Data were normalized to the expression of the internal control UDP. Statistical analyses were performed with SPSS software. The following sets of specific primers were used: Smed-axinA mRNA 5′-GTCGGCGAAATAGGAGTG-3′; 5′-CTGAGGCCTGACTTTTACC-3′ Smed-axinB mRNA 5′-ATATTACGCTTGGGCAATTC-3′; 5′-ACTACTCCACAGTCGAATTC- 3′ Smed-β-catenin1 mRNA 5′-ATTCTGTCGAATTTGACTTGC-3′; 5′-CTAAATTCCACTCGA- TAGTCC-3′ Smed-udp mRNA was detected with primers described previously (Molina et al., 2011). Irradiation Intact planarians were γ-irradiated at 10 krad as described previously (Handberg-Thorsager and Saló, 2007) and fixed for in situ hybridization at 3 and 7 days post-irradiation. Whole-mount in situ hybridization Planarians were fixed and then processed in an In situ Pro hybridization robot (Abimed/Intavis) as previously described (Molina et al., 2007; Umesono et al., 1997). Hybridizations were carried out at 56 °C for 16 h. The following digoxigenin-labeled riboprobes were synthesized using an in vitro transcription kit (Roche): Smed-axinA, Smed-axinB and Smed-Gpas (novel); Smed-otxA and Smed-otxB 69M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 (Almuedo-Castillo et al., 2011); Smed-otp (kindly provided by M. Handberg-Thorsager); Smed-FzA (kindly provided by M. Sureda- Gómez); Smed-Wnt11-6 (Adell et al., 2009); Smed-HoxD and Smed-β-catenin1 (Iglesias et al., 2008); Smed-septin (Zayas et al., 2005); Smed-eye53 (Collins et al., 2010); Smed-sFRP-1 (Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008); Smedwi-2 (Reddien et al., 2005); and cintillo (Oviedo et al., 2003). Samples were observed through Leica MZ16F and Zeiss Stemi SV6 stereomicroscopes and a Zeiss Axiophot microscope; images were captured with a Nikon Coolpix E995 or Leica DFC300FX camera. Whole-mount immunostaining Immunostaining was carried out essentially as described previ- ously (Cebrià and Newmark, 2005; Sanchez Alvarado and Newmark, 1999). The following antibodies were used: anti-synapsin (anti- SYNORF1, Developmental Studies Hybridoma Bank) at a 1:50 dilution and anti-Smed-β-catenin2 (Chai et al., 2010) at 1:1000. Highly cross- absorbed Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG or Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibodies (Molecular Probes) were used at dilutions of 1:400 and 1:1000, respectively. Confocal laser scanning microscopy was performed with a Leica TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) adapted for an inverted microscope (Leitz DMIRB). Results and discussion Graded expression of Smed-axins in differentiated cells and neoblasts Two axin genes were identified and full-length transcripts isolated from the planarian S. mediterranea genome sequences (available in NCBI). The predicted Smed-axin proteins contain the two main conserved domains that characterize axins: the RGS (Regulator of G protein signaling) domain near the NH2 terminus and the C-terminal DIX (Dishevelled/Axin homologous) domain, which is necessary for homodimerization (Fig. S1) (Zeng et al., 1997). Phylogenetic analyses of axin homologs from different species showed that the two planarian axins arise from a lineage-specific duplication.We therefore named them Smed-axinA and Smed-axinB to avoid confusion with the already described vertebrate orthologous genes axin1 and axin2 (also axil/conductin) (Fig. 1A). In situ hybridization experiments revealed similar expression patterns for the Smed-axins. In adult animals, both transcripts were detected in the central nervous system, the pharynx, and in both differentiated cells and neoblasts in the parenchyma (Figs. 1B and S2). Notably, when in situs were developed for a shorter time, a posterior to anterior gradient of expression was observed for both genes. Both Smed-axins were expressed in the anterior and posterior blastemas early during bipolar regeneration (trunk fragments regenerating a new head and tail), but the timing differed according to the paralog Fig. 1. Expression pattern of Smed-axin paralogs. (A) Phylogenetic tree of Schmidtea mediterranea Axin proteins showing that the two planarian Smed-axins represent a lineage- specific duplication. Nv: Nematostella vectensis; MMus: Mus musculus; Gg: Gallus gallus; Dre: Danio rerio; Lv: Lytechinus variegatus; Ce: Caenorhabditis elegans; DM: Drosophila melanogaster; Smed: Schmidtea mediterranea. (B) Expression pattern of Smed-axinA and Smed-axinB in adult and (C) regenerating trunks revealed by whole-mount in situ hybridization. Anterior is shown to the left in (B) and to the top in (C); yellow asterisk indicates the pharynx; d, days after amputation; vnc, ventral nerve cords. Scale bars, 500 μm in (B) and 200 μm in (C). 70 M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 analyzed. Smed-axinA was expressed in both blastemas at day 3 of regeneration. As regeneration proceeded, Smed-axinA expression decreased and eventually the adult expression pattern was restored (Fig. 1C). In contrast, Smed-axinB expression was detected in both blastemas as early as 1 day after amputation. At day 3 of regeneration, Smed-axinB expression at anterior blastemas began to decrease and it had disappeared by day 6 after amputation. As regeneration proceeded, the Smed-axinB expression pattern observed in adult animals was restored (Fig. 1C). These expression data during regeneration and, in particular, in intact animals suggest that Smed-axinsmight have a role in AP polarity. Ectopic Wnt/β-catenin pathway activation by Smed-axins RNAi results in two-tailed planarians To explore the role of Smed-axins in AP polarity, we performed RNAi experiments. Planarians were amputated pre- and post-pharyngeally and the resulting fragments were allowed to regenerate. Ten days after cutting, control trunks differentiated a pair of new eyes within the anterior blastema (unpigmented new tissue). In contrast, following Smed-axinA/Smed-axinB double knockdown (abbreviated as Smed-axins RNAi), regenerating trunks did not develop eyes (Fig. 2A). As regeneration proceeded, most Smed-axins RNAi planarians had an unpigmented bulge between the old and new anterior tissue (Fig. 2A, red arrowhead at 24 days) that corresponded to an ectopic pharynx with a reversed orientation (Fig. 2A, red asterisk at 40 days; see also Fig. 2B). Smed-axinsRNAi-regenerated trunks exhibited tailmorphology at their anterior wounds, resulting in animals with tails and pharynges at both body ends. We refer to this as a two-tailed phenotype (Fig. 2A). No clear APdefectwas detected in regenerating trunks after Smed-axinA or Smed-axinB single RNAi (Fig. S3A), although the efficiency of RNAi experiments was confirmed by quantitative PCR (Fig. S4). Interestingly, most of the Smed-axinB RNAi regenerating tails exhibited a poster- iorized phenotype (Fig. S3B), suggesting that Smed-axin genesmay have undergone some degree of sub-functionalization (see also note in Fig. S6). However, the two paralogs act synergistically to control AP polarity decisions during regeneration since both genes must be knocked down before clear defects in regenerating trunks and two-tailed planarians are observed.We therefore decided to characterize Smed-axinA/Smed-axinB double knockdowns in greater detail. To assess whether these external morphological changes were accompaniedbya fate switch in anterior blastemas,weused Smed-HoxD and Smed-sFRP-1 as markers of central-posterior and anterior identity, respectively. From early stages of regeneration, Smed-axins RNAi regenerating trunks expressed Smed-HoxD at both ends, whereas Smed-sFRP-1 expression was absent. This pattern remained constant throughout the regeneration process (Fig. 2B). Moreover, analyses with these and other markers (see below) revealed that most regenerated trunks from Smed-axins RNAi animals developed a new ectopic mouth and a pharynx with an opposing polarity in relation to the existing pharynx. As observed in Smed-β-catenin1 RNAi (Iglesias et al., 2008), analysis of Smed-axins knockdowns with markers of dorsal and ventral structures suggests that the dorsoventral (DV) axis was not affected (Fig. S5). Axins are well known negative regulators of the Wnt/β-catenin signaling pathway (Zeng et al., 1997), acting as scaffold proteins for β-catenin degradation in the absence ofWnt signaling. To test whether the Smed-axins RNAi phenotype depends on Smed-β-catenin1 function, Fig. 2. Ectopic Wnt/β-catenin pathway activation by Smed-axins RNAi results in two-tailed regenerated planarians. (A) Smed-axins RNAi during trunk regeneration. While control planarians regenerate a head at anterior wounds, Smed-axins RNAi animals regenerate a tail and pharynx with opposite polarity. (B) Posteriorization is accompanied by loss of anterior identity in Smed-axins-silenced planarians. Analysis with the central-posterior Smed-HoxD marker and the anterior Smed-sFRP-1 marker, which is expressed at the most anterior tip (yellow arrow) and the pharynx, reveals that Smed-axins RNAi-treated planarians lose anterior and acquire central-posterior identity during regeneration. Note the differentiation of an ectopic mouth (m) following Smed-axins RNAi. (C) Triple RNAi for Smed-β-catenin1 and Smed-axins demonstrates that the posteriorized phenotype after Smed- axins RNAi requires the Smed-β-catenin1 gene. All control planarians regenerate normally; Smed-axins RNAi animals exhibit a two-tailed phenotype (penetrance=47/49 [96%]); Smed-β-catenin1 RNAi results in a two-headed phenotype (penetrance=39/39 [100%]); and Smed-axins plus Smed-β-catenin1 RNAi leads to a two-headed phenotype similar to that seen with Smed-β-catenin1 RNAi alone (penetrance=62/65 [95%]; 5 independent experiments). All images correspond to regenerating trunks fixed at different time points after amputation. Anterior is shown to the left. Yellow/red arrowheads indicate the differentiation of eyes in normal and ectopic positions, respectively. Yellow/red asterisks indicate the normal and ectopic pharynx, respectively. d: days after amputation. Scale bars, 500 μm. 71M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 we performed combinatorial RNAi experiments. The efficiency of the RNAi experiments was confirmed by quantitative PCR for each gene after RNAi (Fig. S6). Triple RNAi knockdowns for Smed-axins and Smed-β-catenin1 resulted in two-headed planarians identical to those of the single Smed-β-catenin1 RNAi phenotype (Fig. 2C). This finding suggests that the two-tailed phenotype observed in Smed-axins RNAi planarians requires the Smed-β-catenin1 gene. Although no role in AP axis specification has previously been reported for axin genes in planarians (Gurley et al., 2008), the data presented here demonstrate that Smed-axins are conserved negative regulators of the Wnt/β-catenin pathway and are required for correct AP polarity re-establishment during planarian regeneration. Loss of function of these genes during regeneration results in the loss of anterior identity and acquisition of a central-posterior identity, resulting in animals with two tails and pharynges at both body ends. In agreement with our observations, the two-tailed phenotype has been also reported in planarians after promoting either the Hedgehog pathway or the Wnt/β-catenin pathway itself by knocking down other negative regulators of the canonicalWnt pathway (Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2011; Rink et al., 2009; Yazawa et al., 2009). Notably, Hedgehog signaling influences posterior specifi- cation by regulating Wnt/β-catenin signaling (Rink et al., 2009; Yazawa et al., 2009). Brain differentiation occurs in two-tailed planarians after silencing of either Smed-axins or Smed-APC-1 To address whether the AP polarity of specific organs is affected by Smed-axins RNAi, we analyzed the regeneration of the digestive and nervous systems. The planarian digestive system is composed of a pharynx located in the middle of the trunk, from which one anterior and two posterior gut branches extend (Fig. 3A) (Saló, 2006). The central nervous system consists of two anterior cephalic ganglia (brain) situated above two ventral nerve cords (VNCs), which extend along the body and converge in the tail (Fig. 3B) (Agata et al., 1998; Cebrià et al., 2002b). Smed-β-catenin2 immunostaining (which strongly labels the gut and pharynx) showed that trunks from Smed-axins RNAi-treated animals regenerated two posterior gut branches at each end of the animal (Fig. 3A). Moreover, most of them differentiated an ectopic pharynx with opposite polarity at their anterior wounds (white/red asterisks in Fig. 3 and Table S1). Surprisingly, however, analyses with the pan-neuronal marker synapsin revealed that, along with two VNCs in the ectopic “anterior” tail, Smed-axins RNAi animals differentiated two clusters of cells with brain-like characteristics next to the ectopic pharynx (red arrowheads in Fig. 3B). The brain identity of these cell clusters was further confirmed by analysis of the expression of Smed-Gpas, a brain-specific marker that also labels the pharynx (Fig. 3B). Remarkably, 100% of trunks analyzed between 24 and 30 days after amputation differen- tiated brain tissue in the ectopic “anterior” tail (Table S1). Together with the previous section, these results show that while posterior identity of anterior blastemas is accompanied by the differentiation of a posterior digestive system after Smed-axins RNAi, the differentiation of brain tissue is not completely abolished. Previous studies did not report discernible brain tissue after directly or indirectly promoting the Wnt/β-catenin pathway (Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2011; Rink et al., 2009; Yazawa et al., 2009). To test the possibility that a hypomorphic phenotype occurs as a result of Smed-axins RNAi, we performed RNAi-dosage experi- ments. When the dsRNA dose was increased (two rounds of Smed- axins dsRNA injections), we observed that brain tissue still differen- tiated at anterior wounds and its size was the same as that observed after only one round of injections (Fig. S7). This suggests that the appearance of brain tissue after Smed-axins RNAi is not an effect of Axin protein persistence. Moreover, the finding that loss of function of another negative regulator of theWnt/β-catenin pathway, Smed-APC-1, phenocopies Smed-axins RNAi at both themorphological andmolecular level ruled out a pleiotropic effect of Smed-axins in brain differentiation (Fig. S8 and Fig. 4). Overall, these findings show that brain differentiation occurs in two-tailed planarians generated by silencing Smed-axins and Smed- APC-1. Our data thus supports the idea that the mechanisms that control brain differentiation can be uncoupled from those driven by Wnt/β-catenin that determine AP body polarity (Adell et al., 2010). These findings are consistent with the results obtained after silencing Wnt11-6 and ndk genes, which led to the differentiation of ectopic brain tissues along the planarian body without further disturbing AP identities (Adell et al., 2009; Cebrià et al., 2002a; Kobayashi et al., 2007). Early brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by Wnt/β-catenin pathway To investigate the nature of this brain tissue differentiation after ectopic activation ofWnt/β-catenin pathway, we studied the process of planarian brain regeneration in more detail. A working model for planarian central nervous system regeneration has been suggested (Agata and Umesono, 2008; Cebrià et al., 2002b). Based on this model, the initial stage of brain regeneration is characterized by the formation and subsequent patterning of the brain primordia within the anterior blastema. These brain primordia then grow and re-establish proper connections with the regenerating VNCs in the blastema. Finally, the regenerated central nervous system recovers its functionality. Regeneration time-course experiments in control animals with the early brain-specificmarker Smed-Gpas showed that brain primordia in the form of two small cell clusters can be detected as early as 2 days after amputation (Fig. 4A). Smed-axins and Smed-APC-1 RNAi animals Fig. 3. Nervous and digestive systems in regenerated trunks after Smed-axins RNAi. (A) Analysis of the digestive system with anti-Smed-β-catenin2 antibody reveals the differentiation of two posterior gut branches (gb) at each edge of Smed-axins RNAi- treated worms. Note also the differentiation of an ectopic pharynx with opposite polarity at their anteriorwounds (white asterisk). (B) Analyses of the central nervous systemwith the pan-neural marker Synapsin and the marker Smed-Gpas, which is specifically expressed in the cephalic branches and the pharynx, reveal that, along with two ventral nerve cords in the anterior tail, Smed-axins RNAi-treated animals differentiate brain-like tissues (red arrowheads). All images correspond to 22 to 26-day regenerating trunks. Anterior is shown to the left. Yellow and white/red asterisks indicate the normal and ectopic pharynx, respectively. Synapsin and anti-Smed-β-catenin2 images correspond to confocal z-projections. cg, cephalic ganglia; vnc, ventral nerve cords. Scale bars, 500 μm. 72 M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 also differentiated brain primordia at anterior wounds, but these primordia either never developed into normal brains or disappeared as regeneration proceeded (Fig. 4B). Interestingly, a detailed view of anterior wounds following Smed-axins RNAi revealed that the brain primordia differentiated within tissue with a central-posterior identity (indicated by Smed-HoxD expression) but in a more posterior/proximal region as compared to control animals. Whereas the brain primordia differentiated distally within the anterior blastema 2 days after cutting in control animals, they differentiated close to the blastema/post- blastema (old tissue) boundary in Smed-axins RNAi planarians (Fig. 4A). To ascertain whether brain patterning was affected we analyzed the expression of otd/Otx family genes (OtxA and OtxB) and the homeobox-containing gene ortopedia (Otp) (Umesono et al., 1997, 1999). As in the control animals, Smed-OtxA, Smed-OtxB and Smed-Otp are expressed sequentially along the medio-lateral axis of the brain in both Smed-axins and Smed-APC-1 RNAi planarians (Fig. 5). With respect to patterning along the AP axis, it has been shown that a Frizzled homolog appears to be mainly expressed in the anterior part of the brain, whereas a Wnt11 homolog is restricted to the most posterior part and along the VNCs (Kobayashi et al., 2007). Consequently, we studied the expression of these two markers in RNAi-treated animals. Smed-Wnt11-6 and Smed-FzA were expressed in the brain primordia of Smed-axins and Smed-APC-1 knockdowns (Fig. 6). However, as at early stages of brain regeneration in control planarians, the compartments defined by these genes in the brain primordia that differentiated after Smed-axins or Smed-APC-1 were less well delimited than for the Otx/otp genes since there appears to be overlapping expression in some regions of the brain (Fig. 6 at 3 days). This made it more difficult to unambiguously detect any defect in the specification of Smed-Wnt11-6 and Smed-FzA territories. Based on the currently available markers, our results show that the silencing of Smed-axins or Smed-APC-1 leads to the differentiation of a small round brain primordia that fails to develop into a well-formed brain but appears to be quite well patterned. In summary, our data show that the silencing of either Smed-axins or Smed-APC-1 results in the transformation of anterior blastemas into posterior ones (Fig. 2 and Fig. S8). In contrast, a posterior to anterior identity switch is observed in the blastemas of Smed-β-catenin1 RNAi animals (Gurley et al., 2008; Iglesias et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008). Since the posteriorized phenotype observed after Smed-axins or Smed-APC-1 RNAi requires the Smed-β-catenin1 gene (Fig. 2 and Gurley et al., 2008), blastema identity appears to be controlled by β-catenin activity in planarians (even though no data on the exact localization of β-catenin activation has yet been reported); basically, low levels of β-catenin activity would define anterior identity whereas high levels would induce aposterior one. Surprisingly, brain primordia differentiate Fig. 5. Medio-lateral patterning of brain primordia is not affected in Smed-axins or Smed- APC-1 RNAi-treated animals. (A) Expression analysis of Smed-OtxA, Smed-OtxB and Smed- Otp. As in control animals, in Smed-axins and Smed-APC-1 RNAi-treated animals, Smed- OtxA, Smed-OtxB and Smed-Otp are expressed in distinct non-overlapping domains along themedio-lateral axisof thebrain.All images correspond tohighmagnificationsof anterior regions of 12-day regenerating trunks. Anterior is shown to the top; red asterisk indicates ectopic pharynx. Scale bars, 200 μm. (B) Schematic representation of brain patterning in the different phenotypes described in (A). Fig. 4. Early brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/β-catenin pathway. (A) Analysis of regenerating Smed-axins RNAi trunk fragments with Smed-Gpas and Smed-HoxD 2 days after cutting. As occurs in control animals, Smed-axins RNAi planarians regenerate brain primordia (bp) at anterior wounds soon after amputation (black arrowheads). However, after Smed-axins RNAi, the brain primordia differentiate within tissue with a central-posterior identity and in a more posterior region than in control animals. High magnification views of Smed-HoxD expression in the anterior blastema (dotted box) are shown to the right. (B) Expression analysis of Smed-Gpas during early stages of regeneration. In control animals, brain primordia grow and develop into a well formed brain as regeneration proceeds. By contrast, following Smed-axins or Smed-APC-1 RNAi these primordia (black arrow- heads) either fail to develop or disappear as regeneration proceeds. Anterior is shown to the left. d, days after amputation; red arrowhead, ectopic pharynx primordia; yellow asterisk indicates the normal pharynx. Scale bars, 300 μm in high magnification and 500 μm in all other images. 73M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 at the interface of the posterior-fated blastemas and anterior wounds of Smed-APC-1 or Smed-axins RNAi animals (Fig. 4). This suggests that the mechanisms controlling early brain regeneration can be uncoupled from those involved in providing blastema polarity mediated by the Wnt/β- catenin pathway. An important point is that these brain primordia display an overall proper pattern, but do not grow and develop into a fully formed brain within those posterior blastemas. Considering that those blastemas should display a high level of β-catenin activity, the fact that brain primordia do not further develop within them may suggest that low levels of β-catenin activity are required at late stages of brain regeneration for proper brain development. Consistent with this possibility, lower doses of dsRNA against Smed-APC-1 allow brain primordia to grow to a certain extent (Fig. S9). However, further investigation is needed to ascertain whether the Wnt/β-catenin pathway affects brain development directly or indirectly by promoting posterior identity in regenerating blastemas. We are currently unable to explain why brain primordia differentiate upon amputation after silencing of Smed-APC-1 or Smed-axins. However, our results suggest that an unknown mecha- nism is underlying early brain regeneration at anterior wounds despite the silencing of Smed-axins or Smed-APC-1. Two main scenarios can be considered. One recently proposed hypothesis is that the anterior wound goes through a transitory stage characterized by a low level of β-catenin activity that allows the initial development of brain primordia (Adell et al., 2010). This can also be extrapolated from the findings of Yazawa et al. (2009). The gradual increase in the level of β-catenin activity as a consequence of the silencing of Smed- APC-1 or Smed-axins subsequently blocks further development of a fully formed brain in these, otherwise, posterior blastemas. This scenario implies that brain differentiation is incompatible with high β-catenin activity and that the aforementioned unknown mechanism may operate temporarily at anterior wounds to overcome the effect of Smed-axins or Smed-APC-1 RNAi on β-catenin activity and conse- quently commit early brain primordia. Consistent with this hypoth- esis, the silencing of Smed-β-catenin1 not only induces early regeneration of anterior/brain structures at any wound but also a gradual cephalization/anteriorization of RNAi-treated planarians and eventually a hypercephalized phenotype (Iglesias et al., 2008). An alternative, and less parsimonious, scenario would be that early brain regeneration is compatible with high levels of β-catenin activity whereas subsequent development of the brain is not. Further experiments are needed to clarify how the different levels of β-catenin activity influence not only blastema polarity but also brain differenti- ation within them. Relationship between the FGFR/ndk and Wnt/β-catenin signaling pathways in planarian brain regeneration The existence in planarians of a brain-inducing circuit based on an FGF signaling pathway has been proposed. This hypothesis is based on the study of the ndk RNAi phenotype in planarians (which is characterized by the expansion of the brain outside the head region) and the fact that ndk is a FGFR-related gene that negatively regulates FGF signaling in Xenopus embryos (Cebrià et al., 2002a). Of particular interest in the observation of the ndk RNAi phenotype is that ectopic brain tissues also differentiated de novo at posterior wounds close to the blastema/post-blastema boundary (see Fig. S10), but these posterior brain tissues never expanded towards pre-existing tissues or posterior blastemas. This phenotypic trait is strikingly similar to the brain primordia observed at “anterior” wounds in the two-tailed planarians generated after ectopic Wnt/β-catenin activation because, in both cases it takes place at the interface of posterior-fated blastemas and pre-existing tissues. Thus, we reasoned that the FGF/ ndk signaling system could be one of the mechanisms postulated above that can overcome the Smed-axins/Smed-APC-1 RNAi effect at anterior wounds and promote brain primordia differentiation despite the posteriorization of the blastema. The ideal way to test this possibility would be to inhibit the brain-inducing signals modulated by ndk at anterior wounds, but no FGF-like ligands (called brain activator/s in the planarian literature) or FGFR-like receptors responsible for anterior brain regeneration in planarians have yet been identified (Agata and Umesono, 2008). Alternatively, by performing combinatorial RNAi experiments, we sought to determine whether silencing Smed-APC-1 would allow neoblast response to the brain-inducing signals modulated by Smed-ndk in pre-existing tissues. In order to ensure the effectiveness of these RNAi experiments we chose Smed-APC-1 instead of Smed-axins since we reasoned that silencing two genes in combination would be easier. Moreover, we carried out two rounds of Smed-APC-1 RNAi and amputation followed by a third round of Smed-ndk RNAi and amputation to properly down- regulate Smed-APC-1 in pre-existing tissues. As reported above, following Smed-ndk RNAi, not only did the regenerating brain expand towards more posterior regions without further disturbing AP identities, but ectopic brain tissues also differentiated de novo at posterior wounds (Figs. 7 and S10). As in Smed-APC-1 RNAi, double Smed-ndk/Smed-APC-1 RNAi planarians did not develop well-formed brains at anterior wounds, and similarly to Smed-ndk RNAi differen- tiated brain tissues to more posterior regions. Thus, the silencing of Smed-APC-1 does not impair the response of neoblast to the brain- Fig. 6. Smed-FzA and Smed-Wnt11-6 are expressed in brain primordia after Smed-axins or Smed-APC-1 loss of function. In control animals, Smed-FzA and Smed-Wnt11-6 are expressed in the brain at early stages of regeneration (3 d) but their expression only becomes segregated along the anteroposterior axis when the brain primordia grow (12 d). Similarly, Smed- FzA and Smed-Wnt11-6 are also expressed in the small round brain primordia following Smed-axins or Smed-APC-1 RNAi. However, since the growth of these brain primordia is arrested in RNAi-treated animals, it is difficult to unambiguously detect any defect along the anteroposterior axis of the brain. All images correspond to high magnifications of anterior regions. Anterior is shown to the left. d, days after amputation; red asterisk indicates ectopic pharynx. Scale bars, 200 μm. 74 M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 inducing signals modulated by Smed-ndk in pre-existing tissues. Notably, we observed broader posterior expansion of brain tissues in double Smed-ndk/Smed-APC-1 RNAi planarians than in Smed-ndk RNAi planarians (Fig. 7). This unexpected finding revealed that the FGFR/ ndk and Wnt/β-catenin signaling systems interact indirectly to establish the posterior limits of brain differentiation. Perhaps a feedback-loop between these two signaling systems is operating during planarian brain regeneration since cross-talk between FGF and Wnt signaling has been reported in many tissues and organisms and, depending on the developmental context, this can trigger synergistic or antagonistic effects (Kim et al., 2006). Remarkably, it has been shown that FGF signaling can specifically inhibit Wnt/β-catenin signaling downstream of the β-catenin destruction complex in which Axin and APC operate (Ambrosetti et al., 2008) and that Wnt signaling can regulate the expression of different FGF ligands during development (Matsunaga et al., 2002). However, further studies are needed to better characterize the FGF/ndk system and determine exactly how these pathways interact during planarian brain regeneration. Brain tissues form close to the pharynx at late stages of regeneration in two-tailed planarians Surprisingly, during late stages of regeneration we observed a second mode of brain tissue differentiation after Wnt/β-catenin ectopic activation. In 44% of Smed-axins RNAi animals analyzed, one or two additional clusters of cells resembling brain primordia (named brain primordia-like) appeared next to the original pharynx between 18 and 25 days after amputation, probably as a remodeling response. Like the early brain primordia described above, these brain primordia- like structures did not develop into fully formed brains but were homeostatically maintained. The phenotypes observed in regenerated Smed-axins RNAi trunks displayed a temporal progression (Table S1). Likewise, Smed-APC-1 RNAi trunk fragments differentiated brain primordia and brain primordia-like structures at anterior wounds and next to the original pharynx, respectively (Fig. 8). Noteworthy, Fig. 8. Brain primordia-like structures differentiate close to the original pharynx at late stages of regeneration in Smed-axins and Smed-APC-1 RNAi-treated animals. Analysis of Smed-Gpas expression showing the dynamics of brain tissue differentiation in trunk fragments. Two successive modes of brain tissue differentiation are observed following Smed-axins and Smed-APC-1 RNAi. Firstly, like control animals, RNAi-treated animals regenerate brain primordia (bp) at anterior wounds (see also Fig. 4). Secondly, at late stages of regeneration, brain primordia-like (bp-like) structures differentiate next to the original pharynx. Anterior is shown to the left. d, days after amputation; yellow and red asterisks indicate normal and ectopic pharynx, respectively. Scale bars, 500 μm. Fig. 7. Relationship between Wnt/β-catenin and Ndk/FGFR pathways in planarian brain regeneration. Smed-Gpas expression analyses show expected phenotypes after Smed-APC-1 and Smed-ndk RNAi. By contrast, double Smed-ndk/Smed-APC-1 knockdown results in broader posterior expansion of brain tissues than single Smed-ndk knockdown. In addition, note the different morphology of the brain primordia in these double Smed-ndk/Smed-APC-1 knockdowns (red arrowheads). Smed-HoxD analyses confirm posteriorization after Smed- ndk/Smed-APC-1 and Smed-APC-1 silencing, while anteroposterior identity is not affected in Smed-ndk RNAi planarians. All images correspond to 12-day regenerating trunks. Anterior is shown to the left. Yellow asterisk indicates the normal pharynx. Scale bars, 500 μm. 75M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 brain primordia-like structures also differentiated next to the newly formed pharynx in regenerating head fragments after both Smed- axins RNAi (Fig. S11 and Table S2) and Smed-APC-1 RNAi (data not shown). The penetrance of this phenotype was directly proportional to the dose of dsRNA injected (Table S3). Together with previous sections, these results show that, upon amputation, two successive modes of brain tissue differentiation are observed after ectopic activation of the Wnt/β-catenin pathway. The first of these was an initial “default” response, in which brain primordia differentiated early during regeneration at anterior wounds independently of blastema polarity and dose of dsRNA injected (Fig. 4 and Fig. S7). In the second mode, differentiation of brain primordia- like structures occurred close to the original pharynx. This latter effect depended on the time of regeneration and the dose of dsRNA injected (Tables S1 and S3). Thus, the different phenotypes observed after ectopic Wnt/β-catenin pathway activation appear to correspond to different degrees of remodeling of pre-existing tissues (or pharynx) to integrate them into the new body polarity. The differentiation of brain tissues next to both the ectopic and the original pharynxwas themost severe phenotype observed (Fig. 8 at 25 days). Thus, it is tempting to speculate that during regeneration the presence of two opposite posterior blastemas leads to organize two opposed body axes composed of tail, pharynx and brain primordium tissues (the most severe phenotype). This is consistent with the idea that canonicalWnt pathway specifies a posterior organizer, which in turns patterns the AP axis during planarian regeneration (Adell et al., 2010; Meinhardt, 2009a, 2009b). Such a mechanism for axial patterning has not only been shown to operate during hydra regeneration, but has also been proposed to represent an ancestral system for patterning the eumetazoan embryonic primary axis (Bode, 2009; Holland, 2002; Kusserow et al., 2005; Lee et al., 2006). Our results have also uncovered a striking relationship between the pharynx and brain tissues,which always appear close to each other after over-activation of theWnt/β-catenin pathway. Interestingly, low doses of Smed-β-catenin1 RNAi result in two-headed planarians with two pharynges located close to each other but with opposite polarities, and the differentiation of brain primordia-like structures is also observed (Fig. S12). Therefore, the appearance of these brain primordia-like structures close to the pharynx is not merely a consequence of the presence of two opposite posterior blastemas. Perhaps, a common feature of perturbing the Wnt/β-catenin pathway would be the remodeling response of the pharynx to two confronting body axes. If so, the data would suggest that the pharynx somehow instructs the position at which brain primordia-like structures will differentiate. Further studies will be necessary to elucidate the role of the pharynx during planarian regeneration. In particular, it would be interesting to ascertain whether the region where the pharynx joins the anterior gut branch (the esophagus) Fig. 9. The effect of Smed-axins RNAi on regeneration depends on the level of amputation along the anteroposterior (AP) axis. (A) Schematic representation of transverse amputations at different positions along the AP axis of Smed-axins RNAi-treated planarians. The two-tailed phenotype was scored on the basis of morphology whereas the other phenotypic traits were analyzedwith themarker Smed-Gpas. The resulting bipolar fragments frommore anterior locations weremore likely to develop the two-tailed phenotype and ectopically differentiate a pharynx and brain primordia-like structures adjacent to the normal/original pharynx. Data show means for at least four experiments (see Table S4) analyzed at late stages of regeneration; bars are standard deviation. Statistically significant differences were observed between the different fragments for the two-tailed, ectopic pharynx and brain primordia-like phenotypic traits when analyzed by Chi square test at a significance level of 0.05. However, the differences between the fragments for the brain primordia phenotypic trait were not statistically significant. (B) Representative Smed-axins RNAi phenotypes along the AP axis analyzed with Smed-Gpas. All images correspond to 12-day regenerating fragments. Anterior is shown to the left. bp: brain primordia; bp-like: brain primordia-like; Scale bar, 300 μm. 76 M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 functions as a signaling center since this is a region in which many signaling factors are expressed (Fraguas et al., 2011; Gurley et al., 2010; Molina et al., 2007; Rink et al., 2009). The Smed-axins RNAi phenotype depends on the level of amputation along the AP axis Recently, a gradient of Smed-β-catenin1 activity originating from a posterior organizer has been proposed to underlie positional identity along the AP axis (Adell et al., 2009, 2010; Iglesias et al., 2008;Meinhardt, 2009b). The severity of the phenotype after ectopic Wnt/β-catenin pathway activation could therefore be dependent on a pre-existing morphogenetic gradient along the AP axis of the regenerating animal. To assess this possibility, planarians were amputated at four levels along the AP axis and the regeneration of the resulting bipolar pre-pharynx, pharynx, and post-pharynx fragments were analyzed after silencing Smed-axins (Fig. 9). All control bipolar regenerating fragments developed normal anterior blastemas in which a normal brain developed irrespective of the level of amputation. In contrast, after Smed-axins RNAi, the penetrance of the two-tailed phenotype gradually increased as the level of amputation was moved towards the anterior end. The highest penetrance was observed in pre-pharynx fragments, which were posteriorized in 94% of cases. In addition, analyses of two-tailed fragments with the marker Smed-Gpas also revealed varying penetrance in the differentiation of brain primordia-like structures and ectopic pharynges according to the AP level from which the regenerating fragment originated (Fig. 9 and Fig. S13). Three observations are particularly noteworthy. First, all bipolar regener- ating fragments differentiated brain primordia at anterior wounds. Second, differentiation of one or two brain primordia-like structures was observed next to the normal/original pharynx as a remodeling response in 44% and 4% of pre-pharynx and pharynx fragments, respectively (Table S4). Third, the susceptibility of bipolar regener- ating fragments to ectopically differentiate a pharynx with opposite polarity increased in more anterior fragments such that the pre- pharynx fragments were most susceptible (76%). Overall, these data suggest that early brain regeneration at anterior wounds occurs independently of any pre-existing AP morphogenetic gradient controlled by the Wnt/β-catenin pathway. In contrast, the likelihood of developing the most severe Smed-axins RNAi phenotype is a function of the position along the AP axis, withmore anterior areas being more susceptible. This supports the existence of a Smed-β- catenin activity gradient originating from posterior blastemas since this susceptibility to develop the most severe phenotype could reflect relative differences of Smed-β-catenin1 activity levels between the newly formed posterior blastema (high levels) and the pre-existing AP gradient of the regenerating fragment. However, further analyses will be required to determine whether a posterior organizer established by the Wnt/β-catenin pathway specifies the planarian AP axis through a gradient of Smed-β-catenin1 activity. Conclusions Our data demonstrate that Smed-axins are conserved negative regulators of the Wnt/β-catenin pathway required for the re- establishment of AP polarity during planarian regeneration. Further- more, we have shown that the mechanisms controlling early brain differentiation at anterior wounds are independent of those that control blastema polarity via the Wnt/β-catenin pathway. In contrast, however, ectopicWnt/β-catenin activation by silencing Smed-axins or Smed-APC-1 prevents the development of a fully formed brain, an indication that distinct mechanisms control early and late brain development. It remains to be determined whether β-catenin activity allows only early brain development or whether, upon amputation, unknown mechanisms operate at anterior wounds to overcome temporarily the effect of Smed-axins or Smed-APC-1 RNAi on β-catenin activity and consequently commit early brain primordia. Further- more, we provide evidence of an indirect relationship between the Wnt/β-catenin and FGFR/ndk signaling systems in the control of the posterior limits of brain differentiation. Future studieswill address the possibility that a feedback-loop between Wnt/β-catenin and the FGFR/ndk signaling systems controls AP patterning of the nervous system via effects on β-catenin activity. Supplementarymaterials related to this article can be found online at doi:10.1016/j.ydbio.2011.07.013. Acknowledgments The authors would like to thank F. Cebrià, J.M. Martín-Durán and I. Maeso for critically reading a version of the manuscript and all members of the E. Saló and F. Cebrià groups for helpful discussions. We also thank the anonymous reviewers for their valuable comments and suggestions for improving the manuscript; M.D. Molina and J.M. Martín-Durán for helpingwith quantitative real-time PCR; F. Cebrià, P. Newmark, H. Orii, K. Watanabe, T. Adell, M. Handberg-Thorsager and M. Sureda-Gómez for providing clones and reagents; I. Patten and A. King for editorial advice. M.I is especially grateful to F. Cebrià for his support and advice during her doctoral training. The monoclonal antibody anti-SYNORF1 was obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank. This work was supported by grant BFU2008-01544 from the Ministerio de Educación y Ciencia (MEC), Spain, and grant 2009SGR1018 (AGAUR) to E.S.; M. A. C. received an FPI fellowship from the MEC; M.I. received a fellowship from the University of Barcelona. References Adell, T., Salo, E., Boutros, M., Bartscherer, K., 2009. Smed-Evi/Wntless is required for beta-catenin-dependent and -independent processes during planarian regenera- tion. Development 136, 905–910. Adell, T., Cebria, F., Salo, E., 2010. Gradients in planarian regeneration and homeostasis. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000505. Agata, K., 2003. Regeneration and gene regulation in planarians. Curr. Opin. Genet. Dev. 13, 492–496. Agata, K., Umesono, Y., 2008. Brain regeneration from pluripotent stem cells in planarian. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363, 2071–2078. Agata, K., Soejima, Y., Kato, K., Kobayashi, C., Umesono, Y., Watanabe, K., 1998. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zool. Sci. 15, 433–440. Almuedo-Castillo, M., Salo, E., Adell, T., 2011. Dishevelled is essential for neural connectivity and planar cell polarity in planarians. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 2813–2818. Ambrosetti, D., Holmes, G., Mansukhani, A., Basilico, C., 2008. Fibroblast growth factor signaling uses multiple mechanisms to inhibit Wnt-induced transcription in osteoblasts. Mol. Cell. Biol. 28, 4759–4771. Bode, H.R., 2009. Axial patterning in hydra. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 1, a000463. Boutros, M., Kiger, A.A., Armknecht, S., Kerr, K., Hild, M., Koch, B., Haas, S.A., Paro, R., Perrimon, N., 2004. Genome-wide RNAi analysis of growth and viability in Drosophila cells. Science 303, 832–835. Cebrià, F., Newmark, P.A., 2005. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development 132, 3691–3703. Cebrià, F., Kobayashi, C., Umesono, Y., Nakazawa, M., Mineta, K., Ikeo, K., Gojobori, T., Itoh, M., Taira, M., Sanchez Alvarado, A., Agata, K., 2002a. FGFR-related gene nou- darake restricts brain tissues to the head region of planarians. Nature 419, 620–624. Cebrià, F., Nakazawa, M., Mineta, K., Ikeo, K., Gojobori, T., Agata, K., 2002b. Dissecting planarian central nervous system regeneration by the expression of neural-specific genes. Dev. Growth Differ. 44, 135–146. Chai, G., Ma, C., Bao, K., Zheng, L., Wang, X., Sun, Z., Salo, E., Adell, T., Wu, W., 2010. Complete functional segregation of planarian beta-catenin-1 and -2 in mediating Wnt signaling and cell adhesion. J. Biol. Chem. 285, 24120–24130. Collins III, J.J., Hou, X., Romanova, E.V., Lambrus, B.G., Miller, C.M., Saberi, A., Sweedler, J.V., Newmark, P.A., 2010. Genome-wide analyses reveal a role for peptide hormones in planarian germline development. PLoS Biol. 8, e1000509. Felix, D.A., Aboobaker, A.A., 2010. The TALE class homeobox gene Smed-prep defines the anterior compartment for head regeneration. PLoS Genet. 6, e1000915. Fraguas, S., Barberan, S., Cebria, F., 2011. EGFR signaling regulates cell proliferation, differentiation andmorphogenesis during planarian regeneration and homeostasis. Dev. Biol. 354, 87–101. Gurley, K.A., Rink, J.C., Sanchez Alvarado, A., 2008. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science 319, 323–327. 77M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 Gurley, K.A., Elliott, S.A., Simakov, O., Schmidt, H.A., Holstein, T.W., Sanchez Alvarado, A., 2010. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24–39. Handberg-Thorsager, M., Saló, E., 2007. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Dev. Genes Evol. 217, 403–411. Holland, L.Z., 2002. Heads or tails? Amphioxus and the evolution of anterior–posterior patterning in deuterostomes. Dev. Biol. 241, 209–228. Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J.L., Salo, E., Adell, T., 2008. Silencing of Smed- betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development 135, 1215–1221. Kim, Y., Kobayashi, A., Sekido, R., DiNapoli, L., Brennan, J., Chaboissier, M.C., Poulat, F., Behringer, R.R., Lovell-Badge, R., Capel, B., 2006. Fgf9 and Wnt4 act as antagonistic signals to regulate mammalian sex determination. PLoS Biol. 4, e187. Kobayashi, C., Saito, Y., Ogawa, K., Agata, K., 2007. Wnt signaling is required for antero- posterior patterning of the planarian brain. Dev. Biol. 306, 714–724. Kusserow, A., Pang, K., Sturm, C., Hrouda, M., Lentfer, J., Schmidt, H.A., Technau, U., von Haeseler, A., Hobmayer, B., Martindale, M.Q., Holstein, T.W., 2005. Unexpected complexity of the Wnt gene family in a sea anemone. Nature 433, 156–160. Lee, P.N., Pang, K., Matus, D.Q., Martindale,M.Q., 2006. AWNT of things to come: evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 157–167. Logan, C.Y., Nusse, R., 2004. The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 781–810. Matsunaga, E., Katahira, T., Nakamura, H., 2002. Role of Lmx1b and Wnt1 in mesencephalon and metencephalon development. Development 129, 5269–5277. Meinhardt, H., 2009a. Beta-catenin and axis formation in planarians. Bioessays 31, 5–9. Meinhardt, H., 2009b. Models for the generation and interpretation of gradients. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 1, a001362. Molina, M.D., Salo, E., Cebria, F., 2007. The BMP pathway is essential for re-specification and maintenance of the dorsoventral axis in regenerating and intact planarians. Dev. Biol. 311, 79–94. Molina, M.D., Neto, A., Maeso, I., Gomez-Skarmeta, J.L., Salo, E., Cebria, F., 2011. Noggin and noggin-like genes control dorsoventral axis regeneration in planarians. Curr. Biol. 21, 300–305. Morgan, T.H., 1901. Regeneration. Macmillan, New York. 316 pp. Newmark, P.A., Sanchez Alvarado, A., 2002. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210–219. Oviedo, N.J., Newmark, P.A., Sanchez Alvarado, A., 2003. Allometric scaling and proportion regulation in the freshwater planarian Schmidtea mediterranea. Dev. Dyn. 226, 326–333. Petersen, C.P., Reddien, P.W., 2008. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science 319, 327–330. Petersen, C.P., Reddien, P.W., 2009a. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell 139, 1056–1068. Petersen, C.P., Reddien, P.W., 2009b. A wound-inducedWnt expression program controls planarian regeneration polarity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 17061–17066. Petersen, C.P., Reddien, P.W., 2011. Polarized notum activation at wounds inhibits Wnt function to promote planarian head regeneration. Science 332, 852–855. Reddien, P.W., Sanchez Alvarado, A., 2004. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725–757. Reddien, P.W., Oviedo, N.J., Jennings, J.R., Jenkin, J.C., Sanchez Alvarado, A., 2005. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science 310, 1327–1330. Rink, J.C., Gurley, K.A., Elliott, S.A., Sanchez Alvarado, A., 2009. Planarian Hh signaling regulates regeneration polarity and links Hh pathway evolution to cilia. Science 326, 1406–1410. Saló, E., 2006. The power of regeneration and the stem-cell kingdom: freshwater planarians (Platyhelminthes). Bioessays 28, 546–559. Sanchez Alvarado, A., 2006. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell 124, 241–245. Sanchez Alvarado, A., Newmark, P.A., 1999. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5049–5054. Umesono, Y., Watanabe, K., Agata, K., 1997. A planarian orthopedia homolog is specifically expressed in the branch region of both the mature and regenerating brain. Dev. Growth Differ. 39, 723–727. Umesono, Y., Watanabe, K., Agata, K., 1999. Distinct structural domains in the planarian brain defined by the expression of evolutionarily conserved homeobox genes. Dev. Genes Evol. 209, 31–39. Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K., 2009. Planarian Hedgehog/ Patched establishes anterior–posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 22329–22334. Zayas, R.M., Hernandez, A., Habermann, B., Wang, Y., Stary, J.M., Newmark, P.A., 2005. The planarian Schmidtea mediterranea as a model for epigenetic germ cell specification: analysis of ESTs from the hermaphroditic strain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 18491–18496. Zeng, L., Fagotto, F., Zhang, T., Hsu, W., Vasicek, T.J., Perry III, W.L., Lee, J.J., Tilghman, S.M., Gumbiner, B.M., Costantini, F., 1997. The mouse Fused locus encodes Axin, an inhibitor of the Wnt signaling pathway that regulates embryonic axis formation. Cell 90, 181–192. 78 M. Iglesias et al. / Developmental Biology 358 (2011) 68–78 Supplementary data Fig. S1: Sequence analyses of both Smed-axins paralogs showing the conservation of the two conserved domains that characterize Axins: the RGS domain (Regulator of G protein signalling) near the NH2 terminus and the C-terminal DIX domain (Dishevelled/Axin homologous), which is necessary for homodimerization. Fig. S2: Effects of γ-irradiation on Smed-axins and Smed-β-catenin1 expression in intact planarians. In situ hybridization for Smed-axinA, Smed-axinB and Smed-β-catenin1 3 and 7 days after γ-irradiation reveals specific expression in both differentiated cells and neoblasts. Smedwi-2 is a neoblast gene used as a control positive for genes affected by γ-irradiation (Reddien et al., 2005). Three days after γ-irradiation, expression of Smed-axinA, Smed- axinB, Smed-β-catenin1, and Smed-piwi-2 is hardly detected in the mesenchyme. Also, no recovery of their expression is observed 7 days after γ-irradiation, suggesting that their expression is neoblasts or the progeny of newly divided cells (Eisenhoffer et al., 2008). Smed-axinA and Smed-β-catenin1 expression in differentiated cells, such as the pharynx and cephalic ganglia, remains unaffected. Anterior is shown to the left. Yellow asterisk, pharynx; cg, cephalic ganglia; d, days after amputation. Scale bars, 500 µm. Fig. S3: Smed-axinA and Smed-axinB RNAi during regeneration (A) Morphology of live animals and synapsin immunostaining show no clear anteroposterior defects in regenerating trunks after Smed-axinA or Smed-axinB single RNAi. Whereas posterior Smed-HoxD and anterior Smed-sFRP1 expression is maintained after Smed-axinA or Smed-axinB single RNAi, expression of cintillo, which labels anterior chemoreceptors, disappears. All images correspond to regenerating trunk fragments. (B) Regenerating tails in Smed-axinB but not Smed-axinA RNAi-treated animals exhibit a posteriorized phenotype. Anterior is shown to the left. d, days after amputation. Scale bars, 300 µm. 109 Resultados Fig. S4: Quantitative Real-Time PCR analysis after RNAi experiments. Graphical representation of the relative quantitative expression of Smed-axinA, Smed-axinB and Smed-β-catenin1 in control (injected with GFP) and RNAi-treated animals after 3 days of regeneration. Whereas Smed-β-catenin1 expression is not significantly affected, Smed- axinA and Smed-axinB are specifically and efficiently downregulated after single and double Smed-axinA Smed-axinB RNAi experiments. Values show means of three biological replicates; error bars are standard deviation. Statistical analyses with Student’s t-test. *** P < 0.001; n.s, non-significant differences. Fig. S5: The dorso-ventral (DV) axis is properly established after Smed-axins RNAi. Dorsal expression of Smed-septin and ventral expression of Smed-eye53 are maintained in Smed-axins RNAi trunks after 11 days of regeneration. Anterior is shown to the left. D, dorsal side; V, ventral side. Scale bars, 500 µm. Fig. S6: Quantitative Real-Time PCR analysis after combinatorial RNAi experiments. Graphical representation of the relative quantitative expression of Smed- axinA, Smed-axinB and Smed-β-catenin1 in control (injected with GFP) and RNAi-treated animals after 6 days of regeneration. Smed-axinA, Smed-axinB and Smed-β-catenin1 are efficiently downregulated after single (Smed-axinA, Smed-axinB, or Smed-β-catenin1), double (Smed-axinASmed-axinB) and triple (Smed-axinASmed-axinBSmed-β-catenin1) RNAi experiments. Interestingly, however, Smed-axinB is upregulated after Smed-axinA RNAi and downregulated after Smed-β-catenin1. These findings suggest that Smed-axinB expression could be under Smed-β-catenin1 control and may participate in a negative feedback loop; this has been shown to be the case for axin2 in vertebrates (Logan and Nusse, 2004). Note that Smed-β-catenin1 is also upregulated after Smed-axinB RNAi, an effect that may reflect the complex feedback loops regulating the Wnt/β-catenin pathway. Despite Smed-β-catenin mRNA levels, β-catenin activity depends on protein stability regulated by the destruction complex in which axins operate. Values show means of three biological replicates; error bars are standard deviation. Statistical analyses with Student’s t-test. *** P < 0.001; ** P < 0.005; * P < 0.05; n.s, non-significant differences. 110 Fig. S7: Brain tissue differentiation after ectopic activation of the Wnt/β-catenin pathway is not a consequence of Axin protein persistence. Smed-Gpas expression shows that after two rounds of Smed-axins RNAi injection and amputation, brain primordia still differentiate in anterior wounds (red arrowheads). Images correspond to 12-day regenerating trunks (after the second amputation). Anterior is shown to the left. Scale bar, 500 µm. Fig. S8: Smed-APC RNAi phenocopies Smed-axins RNAi. Analyses of Smed-APC-1 RNAi with the same axial markers as Smed-axins RNAi (see Fig. 2). Expression of Smed-HoxD in anterior blastemas is accompanied by loss of anterior Smed-sFRP1 expression, indicating that regenerating trunks are posteriorized in Smed-APC RNAi-treated animals. Images correspond to 3-day regenerating trunks. Anterior is shown to the left. Scale bar, 300 µm. Fig. S9: Effect of lowering the dose of the Smed-APC-1 dsRNA injection in brain development. Stereomicroscope views of the Smed-APC-1 RNAi phenotype accompanied by Smed-Gpas marker analyses. When the dose of Smed-APC dsRNA was reduced to 1 instead of 3 standard injections, each brain primordium developed into a small brain able to differentiate eyes (red arrowheads). All images correspond to 12-day regenerating trunks. Anterior is shown to the left in live animals and to the top in all other images. 1 or 3d x 3 inj/d indicates that planarians were injected three times on 1 or 3 consecutive days, respectively; red asterisk indicates ectopic pharynx. Scale bars, 500 µm for live images and 200 µm for the rest. Fig. S10: Analysis of the Smed-ndk phenotype Ectopic expansion of the brain revealed by Smed-Gpas expression occurs after Smed-ndk RNAi without disturbing posterior Smed-HoxD and anterior Smed-sFRP1 expression. Note the differentiation of brain tissues at posterior wounds close to the blastema/post- blastema boundary (red arrowheads). Images correspond to 3-day regenerating trunks. Anterior is shown to the left. Scale bar, 300 µm. 111 Resultados Fig. S11: Smed-axins RNAi regenerating head fragments show differentiation of brain primordia-like structures close to the pharynx. Smed-Gpas expression shows differentiation of brain primordia-like structures (red arrowheads) as a late response to amputation in the regenerating head fragments in which pharynxes are located at a distance from the pre-existing brain (see also Table S2). Anterior expression of Smed- sFRP1 disappears, indicating that, although brain structures remain, a posteriorization event may have occurred in the regenerating head fragments. Anterior is shown to the left. d, days after amputation. Scale bars, 300 µm. Fig.S12: Low doses of Smed-β-catenin1 dsRNA injection also lead to the differentiation of two brain primordia-like structures close to the pharynx. Smed- Gpas expression shows that, besides the differentiation of the anterior and posterior brains, two brain primordia-like structures appear close to the pharynx (red arrowheads) after silencing of Smed-β-catenin1(see Materials and Methods). Images correspond to 26- day regenerating trunks. Anterior is shown to the left. Scale bar, 500 µm. Fig. S13: Smed-Gpas expression during early regeneration of anteroposterior fragments. Smed-Gpas expression at 3 days post-amputation reveals differentiation of brain primordia at anterior wounds in all anteroposterior regenerating fragments, but not differentiation of brain primordia-like structures at this time. Brain primordia-like structures appear later (between 11-23 days after regeneration) as a remodeling response (see Fig. 9). Anterior is shown to the left. Scale bars, 300 µm. Table S1: Quantification of the different phenotypes observed after Smed-axins RNAi at early and late stages of regeneration. n indicates the number of samples analyzed with Smed-Gpas; exp, number of different experiments; d, days after amputation. Table S2: Summary of the phenotypes obtained in relation to the differentiation of brain primordia- like structures in regenerating head fragments. n indicates the number of samples 112 analyzed with Smed-Gpas; exp, number of different experiments; d, days after amputation. Table S3: Dependence of differentiation of brain primordia-like structures on the injected dose of dsRNA. Quantification of 12-day regenerating heads with brain primordia-like structures after different doses of dsRNA injection. 1 or 3d x 3inj/d indicates that planarians were injected 3 times on 1 or 3 consecutive days, respectively; n indicates the number of samples analyzed with Smed-Gpas; exp, the number of different experiments. Table S4: Quantification of the temporal progression of the different phenotypes obtained in regenerating fragments from different anteroposterior levels. n indicates the number of samples analyzed with Smed-Gpas; d, days after amputation; Bp: brain primordia; Ectopic Ph, ectopic pharynx; Bp-l, brain primordium like. References Eisenhoffer, G. T., Kang, H., and Sanchez Alvarado, A. (2008). Molecular analysis of stem cells and their descendants during cell turnover and regeneration in the planarian Schmidtea mediterranea. Cell Stem Cell 3, 327-39. Logan, C. Y., and Nusse, R. (2004). The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 781-810. Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., and Sanchez Alvarado, A. (2005). SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science 310, 1327-30. 113 Resultados Suplementary Figure 1 115 Resultados Suplementary Figure 2 116 Suplementary Figure 3 117 Resultados Suplementary Figure 4 Suplementary Figure 5 118 Suplementary Figure 6 Suplementary Figure 7 119 Resultados Suplementary Figure 8 Suplementary Figure 9 120 Suplementary Figure 10 Suplementary Figure 11 121 Resultados Suplementary Figure 12 Suplementary Figure 13 122 Table S1 Table S2 Table S3 Table S4 123 Resultados DISCUSIÓN Las planarias representan un excelente organismo modelo para estudiar los mecanismos morfogenéticos implicados en la formación del patrón corporal durante la regeneración y homeostasis. Ya desde finales del siglo XIX, científicos renombrados como T. H. Morgan se interesaron e indagaron en los mecanismos que subyacen a la polaridad regenerativa. De esos estudios clásicos se derivó la idea de que la polaridad regenerativa en planarias depende de gradientes de señalización preexistentes. Sin embargo, no ha sido hasta estos últimos años cuando se ha abordado este fenómeno desde una perspectiva molecular, gracias sobre todo, a los nuevos métodos de análisis genéticos y a la secuenciación del genoma de la planaria de agua dulce Schmidtea mediterrana. En esta tesis doctoral he caracterizado el papel de dos componentes esenciales de la vía Wnt/βcatenina (βcatenina y axina) en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria S. mediterranea. Los resultados obtenidos han contribuido significativamente al campo de la regeneración, y al de la biología del desarrollo en general, al demostrar que en S. mediterranea: (i) la vía Wnt/βcatenina es esencial para restablecer y mantener el eje AP durante el desarrollo post-embrionario, resaltando la conservación funcional de esta vía en diferentes contextos del desarrollo; y que (ii) existen mecanismos auto-reguladores del eje AP que promueven la diferenciación del primordio del cerebro en el tejido preexistente en un contexto posteriorizado tras sobre-activar la vía Wnt/ßcatenina. Los datos que he obtenido durante mi tesis doctoral han sido corroborados por diferentes trabajos paralelos e independientes, los cuales serán discutidos a continuación en conjunto con los diferentes estudios relacionados sobre la formación del patrón AP. Finalmente, con todos los datos surgidos será expuesto un modelo sobre el papel de la vía Wnt/βcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje AP en planarias A lo largo de esta discusión general, y por motivos prácticos, utilizaré el término de planaria para referirme a este grupo de platelmintos en términos generales, aunque la gran mayoría de datos que discutiré han sido obtenidos en nuestra especie de trabajo S. mediterranea. 127 1. Conservación de los elementos de la vía de señalización Wnt/βcatenina en planarias En esta tesis doctoral he identificado y caracterizado dos ortólogos de la βcatenina (Smed-βcatenin-1 y Smed-βcatenin-2) y otros dos de la axina (Smed-axinA y Smed- axinB) en S. mediterranea. La identificación y/o caracterización de muchos otros componentes de la vía Wnt en los últimos años revela que los principales componentes asociados a la vía Wnt/βcatenina están conservados en planarias (tabla 2). Wnt Component S. mediterraea References Wnt secretion Porcupine 2 (Gurley et al., 2008) Evi/Wntless 1 (Fraguas et al., 2014) Antagonists sFRP 3 (Gurley et al., 2008; Molina, 2011 - Tesis Doctoral) notum 1 (Petersen and Reddien, 2011) WIF 1 (Riddiford and Olson, 2011) Cerberus - (Riddiford and Olson, 2011) Dickkopf (dkk) - (Riddiford and Olson, 2011) Wnt 9 (Adell et al., 2009; Gurley et al., 2008; Petersen and Reddien, 2008; Riddiford and Olson, 2011) Frizzled (fz) 13 (Gurley et al., 2008; Riddiford and Olson, 2011) Dishevelled (dvl) 2 (Almuedo-Castillo et al., 2011; Gurley et al., 2008) Diversin 1 (Almuedo-Castillo et al., 2011) Wnt ßcatenin dependent GSK3 3 (Adell et al., 2008) Axin 2 (Gurley et al., 2008; Iglesias et al., 2011) APC 1 (Gurley et al., 2008) ßcatenin 4 (Chai et al., 2010; Gurley et al., 2008; Iglesias et al., 2008) LEF/TCF 5 (Cadigan and Waterman, 2012) Wnt ßcatenin independent JNK 1 (Almuedo-Castillo et al., 2014) Wnt/Calcium Phospolipase C ! (Riddiford and Olson, 2011) CaMKII ! (Riddiford and Olson, 2011) Planar Cell Polarity Rho GTPase ! (Riddiford and Olson, 2011) Vang-Gogh 2 (Almuedo-Castillo et al., 2011) Tabla 2. Componentes de la vía Wnt identificados en S. mediterranea. Se muestra el número de ortólogos identificados para cada componente. Los vistos indican la presencia de uno o más componentes. Por su interés en la discusión de los resultados obtenidos durante la tesis doctoral, en el siguiente apartado introduciré brevemente los ligandos y antagonistas extracelulares de la vía Wnt, así como las βcateninas y las axinas. 128 1.1 Los ligandos y antagonistas extracelulares de la vía Wnt Hasta la fecha se han identificado 5 antagonistas extracelulares y 9 ligandos de la vía Wnt en S. mediterranea (tabla 3). Los ligandos Wnt solo se agrupan en 5 (Wnt1, Wnt2, Wnt4, Wnt5 y Wnt11) de las 12 subfamilias de Wnt inferidas en el ancestro común de los Protóstomos, lo que parece indicar una pérdida de 7 subfamilias de Wnt en el linaje de Platelmintos (Riddiford y Olson, 2011). Aunque clásicamente las subfamilias Wnt1 y Wnt2 se incluyen dentro de la clase de Wnts canónicos y las subfamilias Wnt5, Wnt4 y Wnt11 en la de Wnts no canónicos, se ha demostrado que la vía de señalización que activan estos ligandos depende del contexto celular (van Amerongen y Nusse, 2009); por tanto, aunque Smed-Wnt1 y Smed-Wnt2 son candidatos ideales a activar la vía Wnt/βcatenina, hace falta analizar específicamente en planarias cuáles son los ligandos Wnt que promueven una acumulación de βCATENINA citosólica y la regulación transcripcional de sus genes diana (activación de la βCATENINA de ahora en adelante). New Nomenclature Previous Nomenclature Other Homologs Smed-wnt1 Smed-wntP-11,2 DjwntP-15 Smed-wnt2 Smed-wnt2-11,2 DjwntB6 Smed-wnt4-1 Smed-wnt41; Smed-wntA3; Smed-wnt11-64 DjwntA6 Smed-wnt4-2 Smed-wntP-21,2; Smed-wnt11-54 Smed-wnt4-3 Smed-wntP-31,2; Smed-wnt11-44 Smed-wnt5 Smed-wnt52,3,4 Gtwnt-57 Smed-wnt11-1 Smed-wnt11-11,2 Smed-wnt11-2 Smed-wnt11-3* Smed-wnt72;Smed-wnt11-23 Smed-wnt62; Smed-wntP-43; Smed-wnt11-34 Djwnt11-25 Tabla 3. Clasificación de los ligandos Wnt según Riddiford y Olson (2011). 1, Petersen y Reddien, 2008; 2,Gurley y col., 2008; 3, Adell y col., 2009; 4, Gurley y col., 2010; 5, Yazawa y col., 2009; 6, Kobayashi y col., 2007; 7, Marsal y col., 2003; * Los análisis de Riddiford y Olson (2011) no adscriben a ninguna subfamilia de Wnts en concreto. Los patrones de expresión de estos ligandos y antagonistas en planarias intactas (no-regenerantes) sugiere que un código de Wnts como el propuesto en hidras (Guder y col., 2006a) pude estar operando para formar el patrón AP en planarias (figura 41). Código Wnt, que podría traducirse en un gradiente postero-anterior de actividad βCATENINA, tal y como las siguientes evidencias indican: (i) la anteriorización progresiva desde tejidos anteriores hacia más posteriores tras inhibir Smed-βcatenin1 (Iglesias y col., 2008), (ii) el grado de anteriorización depende de la dosis de inhibición de Smed-βcatenin1 (Iglesias y col., 2008), y (iii) el patrón de expresión de Smed-axinB, un posible gen reportero de la actividad βCATENINA (Iglesias y col., 2011). Todas estas evidencias a favor de un gradiente de actividad βCATENINA serán argumentadas durante el transcurso de esta discusión. 129 Conservación de los elementos de la vía Wnt/bcatenina Figura 41. Código Wnt en planarias e hipotético gradiente de actividad βCATENINA. (A) La expresion de Wnts en diferentes dominios a lo largo del eje AP y la de sus antagonistas extracelulares en anterior sugiere una actividad βCATENINA sesgada hacia posterior. Adaptado de Almuedo-Castillo y col., 2012. (B) La expresion de Smed-axinB y varias evidencias funcionales (detalles en el texto) indican que un gradiente posterio-anterior de actividad βCATENINA estaria regulando el patrón del eje AP. 1.2 La βcatenina El componente más decisivo en la transducción de la señal Wnt es la βCATENINA. Pero ésta no es su única función celular y clásicamente se la define como una proteína bifuncional capaz de mediar también las uniones adherentes en la membrana celular (Nelson y Nusse, 2004). El análisis de las secuencias aminoacídicas y del patrón de expresión de Smed-βcatenin-1 y Smed-βcatenin-2, junto los experimentos de pérdida de función en planarias y los experimentos de sobreexpresión en embriones de Xenopus claramente apuntan hacia una subfuncionalización de la βCATENINA ancestral en S. mediterranea (Iglesias y col., 2008). Es decir, la característica bifuncionalidad de la βCATENINA estaría separada en dos en planarias, siendo Smed-βcatenin-1 el parálogo que habría retenido la función de señalización (co- activador transcripcional) y Smed-βcatenin-2 el de la función de adhesión celular. Esta idea, ha sido validada mediante análisis más exhaustivos que demuestran la subfuncionalización total de las βcateninas de S. mediterranea en dos proteínas monofuncionales (Chai y col., 2010). Por ejemplo, Chai y colaboradores (2010) muestran que la SMED-βCATENINA-2 se localiza únicamente en las membranas epiteliales del sistema digestivo, la faringe y la epidermis en planarias; bioquímicamente demuestran que la SMED-βCATENINA2, pero no la SMED-βCATENINA-1, es capaz de interactuar con los principales elementos del complejo de caderinas. Por el contrario, SMED-βCATENINA-1, pero no SMED-βCATENINA-2, es capaz de activar la transcripción génica en ensayos TOPflash-reporter. De manera interesante, los mismos 130 Discusión autores identifican fragmentos de otros dos genes βcatenina en el genoma de S. mediterranea. Aunque Chai y colaboradores (2010) no los caracterizan, la presencia de más homólogos de βcatenina podría explicar la falta de un fenotipo aparente de integridad celular tras la pérdida de función de Smed-βcatenina2 en planarias (Iglesias y col., 2008). La presencia de más de un parálogo de βcatenina no es exclusiva de S. mediterranea. Tampoco lo es la subfuncionalización en los diferentes parálogos, aunque sea solo parcial (Chai et al., 2010). Ejemplo de ello son la βcatenina bifuncional y la plakoglobina especializada en uniones desmosomales de vertebrados, las 2 βcateninas de C. elegans subfuncionalizadas en señalización o adhesión (apartado 1.1 de la introducción) (Jackson y Eisenmann, 2012), o las dos βcateninas subfuncionalizadas parcialmente descritas recientemente en dos especies de insectos (Tribolium y Acyrthosiphon) (Bao y col., 2012). Estudios filogenéticos indican que todas estas βcateninas son parálogos surgidos por varios fenómenos de duplicación y posterior subfuncionalizacion génica de una única βcatenina ancestral bifuncional; parálogos que tienden a evolucionar paralelamente a proteínas monofuncionales especializadas en la adhesión celular/separación del centrosoma o la señalización Wnt (Chai y col., 2010; Schneider y col., 2003). En el caso concreto de los platelmintos, es difícil situar inequívocamente la duplicación de la βcatenina en el linaje que dio lugar a S. mediterranea, pero los estudios de Chai y colaboradores (2010) muestran un proceso similar de duplicación y subfuncionalización de la βcatenina en otros dos Platelmintos (S. mansoni y D. japonica), lo que sugiere que el evento de duplicación puede remontarse al menos al ancestro de planarias y platelmintos parásitos (el grupo Neoophora). Dado que el objetivo principal de esta tesis es la caracterización de la función señalizadora de la vía Wnt canónica, de ahora en adelante me referiré a Smed- βcatenina-1 como βcatenina canónica o simplemente βcatenina. 1.3 La Axina El armazón del complejo de destrucción de la βCATENINA es la AXINA, un regulador negativo de la vía Wnt/βcatenina muy conservado a lo largo de la filogenia animal (Logan y Nusse, 2004). En la gran mayoría de organismos estudiados se ha descrito un único ortólogo de este gen, excepto en vertebrados (Chia y Costantini, 2005), C. elegans (Korswagen y col., 2002), y como demuestro en esta tesis doctoral, en S. mediterranea donde existen dos parálogos (Iglesias y col., 2011). Los análisis filogenéticos realizados sugieren que las diferentes copias observadas en estos últimos 131 Conservación de los elementos de la vía Wnt/bcatenina grupos han surgido a partir de independientes fenómenos de duplicación génica de una axina ancestral. Una búsqueda preliminar de ortólogos de axina en los genomas de S. mansoni y C. sinensi, especies parasíticas pertenecientes a dos clases diferentes de Platelmintos, muestra que estos organismos también poseen al menos dos genes que codifican para la AXINA. Esto parece indicar que, al igual que la βcatenina, el origen de axinaA y la axinaB de S. mediterranea se remonta al menos al ancestro común de Neoophora. El patrón de expresión de las axinas en adultos de S. mediterranea merece especial atención, ya que éste es en forma de gradiente decreciente hacia anterior (gradiente postero-anterior), lo cual parece contradecir una actividad de la vía Wnt/βcatenina sesgada hacia posterior. No obstante, el patrón de expresión de axin parece correlacionar en general con la activación de la βCATENINA en los pocos organismos donde se conoce la expresión de este gen. En cnidarios por ejemplo, axin se expresa desde estadios muy tempranos del desarrollo en el polo animal/oral, el mismo polo donde se activa la vía Wnt/βcatenina (Momose y col., 2008; www.kahikai.org); además, esta expresión está regulada por la vía Wnt/βcatenina según los análisis funcionales en N. vectensis (Rottinger y col., 2012). En Tribolium, la expresión de Tc-axin es materna y asimétrica en el huevo, donde es necesaria para inhibir la βCATENINA y establecer el futuro polo anterior del organismo; sin embargo, a medida que transcurre el desarrollo embrionario, la expresión de Tc-axin pasa a ser ubicua y de manera similar a lo observado en planarias, es más fuerte en posterior que en anterior (estadio de blastodermo) (Fu y col., 2012). En vertebrados se sabe que axin-1 se expresa de manera ubicua durante la embriogénesis, mientras que axin-2 es un gen diana de la vía que se expresa en dominios más restringidos (Jho y col., 2002; Zeng y col., 1997). De manera similar a axin-2 de vertebrados y axin de N.vectensis, los análisis de RT-PCR en diferentes fondos ARNi indican que un mecanismo de retro-inhibición basado en al menos Smed-axinB y Smed-βcatenin-1 también puede estar actuando en S. mediterránea (Fig. S6 en Iglesias y col., 2011). En Xenopus, se ha sugerido que la concentración de Axina es un factor limitante para el ensamblaje del complejo de destrucción de la βCATENINA (MacDonald y col., 2009). Por tanto, una posibilidad es que el patrón de las axinas en planarias adultas refleje un control muy fino de los niveles de activación de la vía Wnt/βcatenina a lo largo del eje anteroposterior, de modo que en aquellas regiones más susceptibles a activar y/o donde es más activa la vía Wnt/βcatenina sean necesarios niveles más altos de axina para inhibir una activación excesiva de ésta. Asimismo, un mecanismo de retro-inhibición basado en Smed-axinB y Smed-βcatenin-1 estaría reflejando un gradiente de actividad βCATENINA en planarias adultas. 132 Discusión Los estudios de pérdida de función simple o conjunta de las axinas de S. mediterranea sugieren que Smed-axinA y Smed-axinB actúan de manera sinérgica regulando negativamente la βCATENINA, pero de manera interesante, pueden haber divergido sutilmente sus funciones (Iglesias y col., 2011). Por ejemplo, solo la inhibición de Smed-axinB es capaz por sí sola de resultar en un fenotipo two-tailed en fragmentos cola; en cambio, en fragmentos tronco es necesaria la inhibición de ambos parálogos para alterar la polaridad regenerativa. Estos datos pueden considerarse como un caso de redundancia y divergencia funcional, aunque sea a nivel temporal y/o espacial dado las ligeras diferencias de expresión de Smed-axinA y Smed-axinB observadas durante la regeneración o en un fondo βcatenina ARNi (Figura 1 y S6 en Iglesias y col., 2011). De manera similar, en C. elegans los dos parálogos de axina regulan negativamente la vía Wnt/βcatenina de manera redundante, pero también específicamente ahí donde su patrón de expresión no solapa (Oosterveen y col., 2007); y en vertebrados , axin-1 y axin-2 han evolucionado hacia una divergencia espacial más extrema (Chia y Costantini, 2005; Yu y col., 2005). Es por tanto posible, que a partir de una axina ancestral regulada por la misma vía Wnt/βcatenina (como la que hoy vemos presente en cnidarios), los parálogos surgidos independientemente en planarias, C. elegans y vertebrados hayan especializado su función como reguladores negativos de la vía Wnt/βcatenina en diferentes territorios y/o momentos del desarrollo al divergir sus patrones de expresión. Asimismo, sería interesante discernir en un futuro si las AXINAS de S. mediterranea han divergido también sus propiedades bioquímicas como inhibidores de la vía Wnt/βcatenina, como ocurre en C. elegans (Oosterveen y col., 2007), o son funcionalmente equivalentes como en vertebrados (Chia y Costantini, 2005). 2. La vía Wnt/βcatenina controla la polaridad Antero-Posterior de regeneración en planarias La mayoría de las planarias son capaces de regenerar, y cuando lo hacen, regeneran una cabeza en las heridas anteriores y una cola en las posteriores, fenómeno conocido como polaridad de regeneración (Allman, 1864; Morgan, 1901). Sin embargo, tras inhibir la βcatenina u otros elementos positivos de la vía Wnt/βcatenina, una planaria regenera una cabeza en vez de una cola en heridas posteriores (fenotipo two- headed) (Adell y col., 2009;Gurley y col., 2008; Hayashi y col., 2011;Iglesias y col., 2008; Petersen y Reddien, 2008;Petersen y Reddien, 2009) de manera complementaria, la perdida de función de las axinas (Smed-axinA/B ARNi) u otros reguladores negativos 133 de la misma vía resulta en la regeneración de una cola en vez de una cabeza en heridas anteriores (fenotipo two-tailed) (figura 42) (Gurley y col., 2008; Iglesias y col., 2011; Petersen y Reddien, 2011). Además, la polaridad de estos heteromorfos está alterada tan temprano como 12 horas después de amputar (Gurley y col., 2008); y, la falta de βcatenina específicamente durante el proceso de regeneración, mediante la inhibición de este gen justo después de amputar, resulta también en planarias two-headed (Petersen y Reddien, 2008). En conjunto, estos datos demuestran que la activación de la vía Wnt/βcatenina es necesaria y suficiente para restablecer tempranamente la polaridad de regeneración en planarias, al promover la formación de una cola e inhibir la de una cabeza durante las primeras 12 horas de regeneración. Este intervalo de tiempo, coincide con la estimación del tiempo necesario para la determinación de una cabeza propuesta en experimentos previos (Marsal, 2005 - Tesis Doctoral; Salo and Baguna, 1984). wntless (RNAi) wnt1 (RNAi) wnt5 (RNAi) wnt11-2 (RNAi) wnt4-1 (RNAi) notum (RNAi) dvl-1/2 (RNAi) GSK3s (blocker) axins (RNAi) ßcatenin1 (RNAi) Figura 42. Fenotipos descritos tras inhibir diferentes componentes de la vía Wnt/βcatenina durante la regeneracion bipolar. Smed-βcatenin-1 y Smed-axins (Smed-axinA y Smed-axinB) son componentes especificos de la vía Wnt/βcatenina. Mientras que la inhibicion de Smed-βcatenin-1 resulta en planarias two-headed, la sobre-activación de esta vía tras inhibir Smed-APC-1 o Smed- axinA/B da lugar a heteromorfos two-tailed. Smed-wntless, Smed-notum, Smed-wnt1 y Smed-dvl-1/2 son componentes que pueden afectar a todas las ramas de la vía Wnt y por tanto su inhibición afecta diferentes aspectos de la morfogenesis del eje AP. Smed-wnt1 ARNi fenocopia Smed- βcatenin-1 ARNi, y Smed-notum ARNi fenocopia la sobre-activación de la βCATENINA, por tanto son candidatos a mediar la vía Wnt/βcatenina (detalles en el texto). El papel de la vía Wnt/βcatenina en la polaridad regenerativa no es una peculiaridad de S. mediterranea ya que la inhibición de Dj- βcatenin-B (Oviedo y col., 2010; Yazawa y col., 2009) o Dj-wnt1 (Hayashi y col., 2011) tambien resulta en planarias two-headed en D. japonica. Los dibujos de Smed-βcatenin-1 (ARNi) y Smed-dvl- 1/2 (ARNi) son representaciones de los fenotipos menos severos observados. Blocker, Azakenpaullone. Referencias en Almuedo-Castillo y col., 2012 y en el texto. Adaptado de Almuedo- Castillo y col., 2012. 134 Discusión 2.1 ¿Qué mecanismo activa asimétricamente la vía Wnt/ßcatenina y establece la polaridad de regeneración? Varios estudios indican que Smed-wnt1 y Smed-wnt4-2 (llamado anteriormente Smed-wntP2; véase tabla 2) están involucrados en establecer la polaridad AP de regeneración a través de activar la vía Wnt/βcatenina (Adell y col., 2009; Hayashi y col., 2011; Petersen y Reddien, 2009) (tabla 4). De éstos dos ligandos, se ha sugerido que Smed-wnt1 es el estímulo primario en activar la βCATENINA durante la regeneración (Adell y col., 2009; Hayashi y col., 2011; Petersen y Reddien, 2009). En concreto, la expresión de Smed-wnt1 que es inducida tempranamente (6-24 horas después de amputar) en células diferenciadas de la herida de manera independiente de la actividad βCATENINA y bajo el control transcripcional de la vía Hedgehog (Hh) (Hayashi y col., 2011; Petersen y Reddien, 2009; Rink y col., 2009; Yazawa y col., 2009). Smed-wnt4-2 es otro ligando canónico que se expresa tempranamente en células diferenciadas de la herida y que actúa en sinergia con Smed-wnt1 para establecer la polaridad de regeneración. Sin embargo, a diferencia de la expresión inicial de Smed-wnt1, Smed- wnt4-2 depende de la activación inicial de βCATENINA desencadenada por Smed-wnt1 y es especifica de heridas posteriores (Petersen y Reddien, 2009) (tabla 4 y figura 43). Sorprendentemente, Smed-wnt1 se induce en cualquier herida independientemente de la polaridad que adopte el blastema (Gurley y col., 2010; Petersen y Reddien, 2009). No ha sido hasta el reciente descubrimiento de Smed- notum, un hidrolasa que modula el rango de acción de los ligandos Wnt, cuando se ha empezado a dilucidar como podría la acción de Smed-wnt1 confinarse a heridas posteriores para promover la regeneración de la cola (Petersen y Reddien, 2011). Smed-notum es el único inhibidor extracelular de la vía Wnt descrito hasta la fecha que se expresa preferentemente en heridas anteriores y cuya inhibición resulta en planarias RNAi experiment phenotype References Smed-wnt1 or Dj-wnt1 two-headed and tailless Adell et al., 2009; Hayashi et al., 2011; Petersen and Reddien, 2009 Smed-hh or Dj-hh two-headed and tailless Rink et al., 2009; Yazawa et al., 2009 Smed-hh/Smed-wnt1 two-headed (synergism) Rink et al., 2009 Smed-ptc or Dj-ptc two-tailled and Headless Rink et al., 2009; Yazawa et al., 2009 Smed-ptc/Smed-bcatenin1 two-headed Rink et al., 2009 Smed-ptc/Smed-wnt1 Rescue Anterior Head* Rink et al., 2009 Tabla 4. Wnt1 es el estímulo primario en activar la βCATENINA durante la regeneración. La tabla muestra diferentes combinaciones de ARNi con componentes de la vía Wnt y de la vía Hedgehog (Hh). * Los autores no muestran que polaridad adopta el blastema posterior. 135 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración two-tailed (Petersen y Reddien, 2011) (figura 42). Paradójicamente, la expresión de Smed-notum está regulada por la vía Wnt/βcatenina (Petersen y Reddien, 2011). A falta de una confirmación por métodos más precisos, la regulación directa de Smed-notum por βCATENINA implica, contra todo pronóstico, que la vía Wnt/βcatenina también debe activarse en heridas anteriores, aunque esta activación no sea aparentemente necesaria para formar una cabeza, ni suficiente como para promover la formación de una cola. Quedando todavía por resolver cuál es la función de la vía Wnt/βcatenina en heridas anteriores aparte de activar Smed-notum (desarrollado en las secciones de la discusión 3.2 y 5), una explicación plausible del porqué solo en heridas posteriores la vía Wnt/βcatenina promueve la formación de una cola es la activación sostenida de βCATENINA al haber menos Smed-notum que inhiba la acción local de Smed-wnt1. Es posible que el programa genético encargado de formar una cola solo se desencadene a partir de cierto umbral de activación de la vía Wnt/βcatenina, umbral que puede ser temporal y/o de nivel de señalización tal y como se ha descrito en otros sistemas (Rogers y Schier, 2011). Resumiendo, estos datos indican que la decisión binaria de regenerar una cabeza o una cola en planarias depende de señales desencadenadas directamente por la herida que inducen localmente la expresión de Smed-wnt1, y de un mecanismo de retro- inhibición basado en wnt1-βcatenina-notum que atenúa la vía Wnt/βcatenina en heridas anteriores y la activa asimétricamente en heridas posteriores. Además, respaldan la idea de que el establecimiento de la polaridad de regeneración es independiente de neoblastos (p.ej. Kato y col., 2001). Dos de los siguientes retos en este campo son: (i) determinar si el establecimiento de la polaridad AP depende de si la vía Wnt/βcatenina está activa/inactiva en el lugar de la herida o de un mecanismo basado en diferencias relativas de activación (ya sea entre heridas anteriores y posteriores o entre el lugar de la herida y el tejido preexistente inmediatamente contiguo). Para ello sería necesario analizar, por ejemplo, la localización subcelular de la βCATENINA o la A P Wnt1 notum ßcat-1 Hh X Wnt4-2 Hh notum ßcatenin-1axinB Wnt1 Wnt1 notum ßcat-1 Hh Figura 43. Eventos tempranos que establecen la polaridad regenerativa en células diferenciadas de la herida. Entre 6 y 24 horas después de amputar un mecanismo de retro-inhibición basado en wnt1-βcatenina-notum atenúa la vía Wnt/βcatenina en heridas anteriores y la activa asimétricamente en heridas posteriores. La señal X es un mecanismo desconocido que inhibe Smed-notum en heridas posteriores. Detalles en el texto. Adaptado de Almuedo-Castillo y col., 2012. 136 Discusión expresión de un gen reportero canónico de la vía, ya que la funcionalidad de la βCATENINA como co-activador transcripcional no solo está determinada por su localización nuclear, sino también por diversos reguladores negativos nucleares. Aunque todavía no se ha descrito ningún gen diana canónico de la vía Wnt/βcatenina en planarias, se ha sugerido que Smed-axinB, Smed-notum y Smed-wnt4-2 podrían serlo (Iglesias y col., 2011; Petersen y Reddien, 2008; Petersen y Reddien, 2009). En el caso concreto de Smed-axinB, su patrón de expresión parece que abarca los dominios de expresión de Smed-notum y Smed-wnt4-2, aunque estos dos últimos difieren considerablemente entre ellos, indicando que en todo caso se trata de genes específicos de tipo o contexto celular. (ii) entender el mecanismo subyacente a la expresión asimétrica de Smed-notum. En este sentido, los experimentos de Petersen y Reddien (2009) indican que Smed- notum se expresa en cualquier herida, pero éste es inhibido rápidamente en heridas posteriores por un mecanismo que aún se desconoce (señal X de la figura 43). 2.2 Integración de los mecanismos y vías de señalización que controlan la polaridad AP de regeneración En los últimos años diversos estudios funcionales han revelado que aparte de la vía Hedgehog (comentado más arriba), el potencial de membrana, la señalización por calcio, y la comunicación por uniones gap (GJC) también están implicados en el establecimiento de la polaridad AP de regeneración en planarias (tabla 5). Además, los estudios clásicos y la modelización teórica sugieren que la polaridad regenerativa depende de gradientes de señalización preexistentes e indican que el SNC tiene un papel muy importante en la decisión de regenerar una cabeza o una cola (Brøndsted, 1954; Child, 1911; Egger y col., 2007; Meinhardt, 2008; Morgan, 1905). Aunque se requieren más estudios para determinar como la información proveniente de estos distintos mecanismos y vías de señalización es integrada exactamente con la vía Wnt/βcatenina para restablecer la polaridad de regeneración, algunas piezas de este puzle pueden empezarse a relacionar como será desarrollado a continuación. 137 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! M ec ha ni sm / Pa th w ay A P Ph en ot yp e R el at io n w ith th e W nt /ß ca te ni n pa th w ay R el at io n w ith th e H h pa th w ay R el at io n w ith th e pr e- ex is tin g A P in fo rm at io n R el at io n w ith th e C N S W nt /% ß ca te ni n% tw o- ta ile d (S m ed -a xi nA /B (R N A i) )1 - S m ed -A P C -1 (R N A i) do n ot a ffe ct pt c ex pr es si on 4 tw o- ta ile d m or e pe ne tra nt a s m or e A 1 ?* tw o- he ad ed (S m ed -b ca te ni n1 (R N A i) )2 ta ill es s (S m ed -b ca te ni n1 (R N A i) )2 - S m ed -b ca te ni n1 (R N A i) do n ot a ffe ct pt c ex pr es si on 4 tw o- he ad ed m or e pe ne tra nt a s m or e A 10 ?* H ed ge ho g% tw o- ta ile d (S m ed -p tc (R N A i) o r D j-p tc (R N A i)) 3, 4 he ad le ss (S m ed -p tc (R N A i)3 S m ed -p tc /S m ed -b ca te ni n1 (R N A i) = tw o- he ad ed 4 - ? ?* tw o- he ad ed (D j-h h (R N A i) )4 ta ill es s (D j-h h (R N A i) or S m ed -h h (R N A i) )3 ,4 S m ed -h h/ S m ed -w nt 1 (R N A i) = tw o- he ad ed (s yn er eg is m )4 - tw o- he ad ed m or e pe ne tra nt a s m or e A 3 ?* Ca lc iu m %/ %%% M em br an e% Vo lt ag e% tw o- he ad ed (P ZQ , v ol ta ge -o pe ra te d C a2 + ch an el s ag on is t)5 ,6 (IV M , d ep ol ar iz at io n) 7 P ZQ + D j-b ca te ni n1 (R N A i) = tw o- he ad ed (s yn er eg is m )6 ,7 P ZQ + D j-A P C -1 (R N A i) = tw o- ta ile d6 P ZQ + D j-p tc (R N A i) = w ild -ty pe 6 P ZQ + D j-h h (R N A i) = tw o- he ad ed 6 ? ?* he ad le ss (n ic ar di pi ne , v ol ta ge -g at ed C a2 + ch an el s in hi bi to r) 7 (S C H , H ,K -A TP as e in hi bi to r; hy pe rp ol ar iz at io n) 7 S C H + D j-b ca te ni n1 (R N A i) = w ild -ty pe 7 ? he ad le ss m or e pe ne tra nt a s m or e P 3 Th e pr es en ce o f a br ai n re sc ue th e he ad le ss ph en ot yp e (S C H , H ,K - A TP as e in hi bi to r) 7 G JC tw o- he ad ed (G JC in hi bi to r o r D jIn x- 5/ -1 2/ -1 3 (R N A i) 8, 9 ta ill es s (G JC in hi bi to r) 8 G JC in hi bi to r + D j-b ca te ni n1 (R N A i) = tw o- he ad ed (s yn er eg is m )9 ? tw o- he ad ed m or e pe ne tra nt a s m or e A /P 7, 9 Th e pr es en ce o f a br ai n re sc ue th e tw o- he ad ed ph en ot yp e (G JC b lo ck ag e) 9 Ta bl a 5. R el ac ió n en tr e lo s di fe re nt es m ec an is m os y v ía s de s eñ al iz ac ió n qu e co nt ro la n la p ol ar id ad A P de r eg en er ac ió n. P ZQ , pr az iq ua nt el ; IV M , iv er m ec tin ; S C H ,S C H -2 80 80 . D et al le s en e l te xt o. * C om po ne nt es d e la v ía s e ex pr es an e n el S N C . 1 , G av in o et a l., 2 01 3; I gl es ia s et a l., 2 01 1; 2 , Ig le si as e t a l., 2 00 8; 3 , Y az aw a et a l., 2 00 9; 4 , R in k et a l., 2 00 9; 5 , N og i e t a l., 2 00 9; 6 , Zh an g et a l., 2 01 1; 7 , B ea ne e t a l., 2 01 1; 8 , N og i a nd L ev in , 2 00 5; 9 , O vi ed o et a l., 2 01 0; 1 0, a ne xo 1 .   138 Discusión La vía Wnt/ßcatenina controla la polaridad AP de regeneración sujeta a un gradiente de señalización preexistente La penetrancia de los fenotipos two-headed y two-tailed tras manipular la vía Wnt/βcatenina depende de la identidad AP preexistente del fragmento regenerante, siendo la susceptibilidad a desarrollar ambos heteromorfos mayor en fragmentos anteriores. Así, la penetrancia del fenotipo two-headed es mayor en cabezas que en troncos regenerantes (Anexo 1), y el fenotipo two-tailed es más penetrante en fragmentos pre-faríngeos que en troncos o fragmentos post-faríngeos (Iglesias y col., 2011). Estos datos sugieren que un mecanismo basado en gradientes está modulando el control de la polaridad AP de regeneración por la vía Wnt/βcatenina. Ahora bien, ¿cuál es la naturaleza molecular de dicho mecanismo y cómo éste, ante el mismo estímulo de inhibición de la βcatenina o las axinas, es capaz de amortiguar en fragmentos posteriores el impacto en la polaridad de regeneración de tanto una inhibición como de una activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina? Meinhardt (2009) propone que el restablecimiento de la polaridad original durante la regeneración viene determinada por el nivel relativo de una señal distribuida en forma de gradiente (apartado 2.3 de la introducción). En Hydra, esta señal es emitida por el organizador de cabeza y decrece gradualmente hacia el polo opuesto otorgando cada vez menos competencia a las células de la herida a restablecer dicho organizador (gradiente de competencia a formar el organizador de cabeza). La vía Wnt/βcatenina especifica y mantiene el organizador de cabeza de Hydra (Bode, 2009), y como muestro en esta tesis doctoral, la cola de planarias (Iglesias y col., 2011; Iglesias y col., 2008). Por tanto, aunque planaria e Hydra tienen planes corporales muy diferentes, podríamos hipotetizar la existencia de un gradiente de competencia a regenerar la cola en planarias que decrece hacia anterior y depende, al menos indirectamente, de la vía Wnt/βcatenina (figura 44). De manera análoga a Hydra, este gradiente modularía positivamente la activación de βCATENINA o la red génica que esta controla en el lugar de la herida. Así, el gradiente actuaría en sinergia con el mecanismo de retro-inhibición wnt1-bcatenina- notum descrito anteriormente para activar asimétricamente en heridas posteriores el programa de regeneración de cola. Un gradiente de este tipo podría explicar las penetrancias observadas de los heteromorfos two-headed y two-tailed si asumimos además que éste no es uniforme, sino de tipo exponencial, y la polaridad de regeneración depende de las diferencias relativas (temporales y/o de nivel de activación) de la señal que trasmite entre los dos polos del fragmento regenerante (Child, 1911; Meinhardt, 2008; Meinhardt, 2009b). Así, cuanto más anterior es el fragmento regenerante respecto el eje corporal, menores son las diferencias relativas 139 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración Figura 44. Hipotético gradiente de competencia a regenerar la cola que modula el control de la polaridad regenerativa por la vía Wnt/βcatenina. (A) Este gradiente puede ser un gradiente preexistente de actividad βCATENINA que actúa en sinergia con la activación de la vía Wnt/βcatnenina en el sitio de la herida, y/o el resultado de un gradiente inverso como el que subyace el head frequency. (B) Cuanto más anterior es el fragmento regenerante respecto el eje corporal, menores son las diferencias relativas del gradiente de competencia a regenerar la cola entre los dos polos del fragmento y más susceptible es éste a desarrollar los heteromorfos two- headed y two-tailed tras manipular la vía Wnt/βcatenina. del gradiente de competencia a regenerar la cola entre los dos polos del fragmento y más susceptible es éste a desarrollar los heteromorfos two-headed y two-tailed tras manipular la vía Wnt/βcatenina (figura 44). Señales candidatas a subyacer el hipotético gradiente de competencia a regenerar la cola Como se ha comentado, el patrón de expresión de las axinas en planarias adultas puede reflejar un mecanismo de retro-inhibición de la vía Wnt/βcatenina que limita la intensidad y/o duración de la señal Wnt, así como un gradiente postero-anterior de actividad βCATENINA. Si se confirman estos datos, el gradiente de actividad βCATENINA es un candidato ideal a ser el gradiente de competencia a regenerar la cola. De manera no excluyente, otro candidato a modular el control de la polaridad por la vía Wnt/βcatenina es el gradiente de señalización conocido como head-frequency en planarias. Tal y como se ha comentado en la introducción (sección 6.2), el concepto de head-frequency correlaciona con el hecho de que cuanto más anterior es el fragmento regenerante, más rápido se regenera la cabeza. Varios datos sugieren que este fenómeno no está afectado en los heteromorfos two-tailed y two-headed obtenidos tras 140 Discusión manipular la vía Wnt/βcatenina: por un lado, siempre aparece antes la cabeza anterior que la posterior ectópica en el fenotipo two-headed (observación personal y figura 1 en Iglesias y col., 2008); y por otro, las diferencias temporales de aparición del primordio del cerebro en diferentes fragmentos regenerantes del eje AP se mantienen en el fenotipo two-tailed (figura S13 en Iglesias y col., 2011; Evans y col., 2011). Estas diferencias temporales en la aparición del cerebro también podrían modular el control de la polaridad AP de regeneración por la vía Wnt/βcatenina. En vertebrados por ejemplo, el cerebro anterior expresa diferentes antagonistas intra y extracelulares de la vía Wnt/βcatenina (Elkouby y Frank, 2010). En planarias, se ha sugerido que el cerebro es la fuente de una señal de largo alcance que inhibe la regeneración de un cerebro/cabeza ectópico en heridas posteriores (Brain Inhibitor) (Lender, 1960; Oviedo y col., 2010). El potencial de membrana y la señalización por calcio regulan la polaridad de regeneración de manera antagónica a la vía Wnt/βcatenina En concordancia con los experimentos de Marsh y Beams (Lange y Steele, 1978; Marsh y Beams, 1952), estudios recientes demuestran que el potencial de membrana está implicado en la polaridad de regeneración de planarias a través de modular canales de calcio dependientes de voltaje (tabla 5). En particular, la despolarización de la membrana durante la regeneración aumenta los niveles de calcio intracelulares y promueve la formación de la cabeza en planarias (Beane y col., 2011; Nogi y col., 2009; Zhang y col., 2011) (figura 45). Por lo tanto, mientras que la vía Wnt/βcatenina promueve la regeneración de la cola, la señalización por calcio promueve la regeneración de una cabeza. De acuerdo con ésta función antagónica en el control de la polaridad AP, en un contexto normal estos dos mecanismos se activan asimétricamente en polos opuestos durante la regeneración bipolar (figura 45a). Figura 45 El potencial de membrana y la señalización por calcio regulan la polaridad de regeneración de manera antagónica a la vía Wnt/βcatenina. (A) La vía Wnt/βcatenina y la señalización por calcio se activan en polos opuestos durante la regeneración bipolar. Ante un daño, se desencadena una despolarización de manera diferencial en heridas anteriores que activa ciertos canales de calcio operados por voltaje. Como consecuencia, los niveles de esta señal intracelular aumentan en el blastema anterior y modulan la polaridad AP de regeneración en planarias. Representaciones a 1 día después de amputar. (B) La inhibición de las bombas de H,K-ATPasas hiperpolariza la membrana en heridas anteriores, efecto que se traslada en una disminución de los niveles de calcio intracelulares y en planarias que no regeneran ni una cabeza ni una cola en heridas anteriores (fenotipo headless). Por el contrario, un aumento de los niveles de calcio en heridas posteriores - ya sea tras promover la despolarización de la membrana o inhibir ciertos canales de calcio dependientes de voltaje - da lugar a un fenotipo two-headed. (C) La inhibición de la βcatenina compensa la inhibición de las bombas de H,K-ATPasas y viceversa (D) Posible relación de la vía Wnt/βcatenina y la señalización por calcio en el control de la polaridad regenerativa. A, anterior; P, posterior. PZQ, praziquantel ;IVM, ivermectin. Detalles y referencias en el texto. 141 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración La inhibición conjunta de las H,K-ATPasas (vía del calcio) y la βcatenina resulta en la regeneración de planarias aparentemente normales, al menos a nivel morfológico (Beane et al., 2011), puesto que se consigue rescatar tanto el fenotipo headless en blastemas anteriores (fenotipo asociado a la inhibición simple de las H,K-ATPasas), como la regeneración de una cabeza ectópica en heridas posteriores (fenotipo asociado a la inhibición de la βcatenina) (figura 45c). Estos datos sugieren que la vía de señalización Wnt/βcatenina y la del calcio se antagonizan mutuamente durante el restablecimiento de la polaridad de regeneración, ya que la inhibición de una vía compensa la inhibición de la otra. Dado que el efecto de bloquear las H,K-ATPasas en los niveles de calcio es especifico de blastemas anteriores (Beane et al., 2011), esta compensación implicaría que desde el polo anterior un mecanismo de señalización de larga distancia promueve, o deja de antagonizar, el programa génico de formación de cola que controla la βcatenina en el polo posterior. Sin embargo, es difícil discernir cómo o a qué nivel se produce este antagonismo mutuo, si consiste en regular los niveles de activación de la βCATENINA en el lugar de la herida, si tiene lugar por debajo de ella (ambas son vías paralelas que convergen en regular de manera antagónica unos mismos genes diana, que como ya se apuntó anteriormente no son todavía conocidos en planaria), o si se debe a que la inhibición conjunta de las H,K-ATPasas / βcatenina es poco penetrante (hipomorfo para uno o ambos fenotipos). 142 Discusión La idea de que el calcio intracelular puede inhibir la vía Wnt/βcatenina no es novedosa (Kohn y Moon, 2005). Nogi y colaboradores (2009) ya lo postulan en sus estudios sobre la vía del calcio y la polaridad regenerativa en planarias, y más recientemente, se ha descrito que el fenotipo two-headed que resulta tras aumentar de manera ectópica los niveles de calcio en heridas posteriores correlaciona con una disminución de la expresión de wnt1 regulada por Hh (Zhang y col., 2011). Es decir, niveles altos de calcio intracelular pueden inhibir el estímulo primario que activa la vía Wnt/βcatenina durante la regeneración posterior. Ahora bien, es importante remarcar dos observaciones. Por un lado, sabemos que una disminución de los niveles de calcio intracelulares en heridas anteriores resulta en un fenotipo headless pero no two-tailed, lo que sugiere que las señales que promueven la regeneración de una cola (o una cabeza) no actúan en heridas anteriores en este contexto (Beane y col., 2011). Por otro, la señalización por calcio se activa asimétricamente en heridas anteriores en un contexto normal, pero wnt1 se expresa en cualquier herida. Es posible que la disminución de los niveles de calcio en heridas anteriores tras inhibir las H,K-ATPasas resulte en una desinhibición de la actividad βCATENINA a nivel nuclear, tal y como se ha descrito en otros sistemas (Kohn y Moon, 2005), o a nivel de wnt1 (Zhang y col., 2011). Esta activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina en heridas anteriores podría ser suficiente como para inhibir la regeneración de la cabeza, pero insuficiente como para promover la formación de un two-tailed. Respaldando esta idea, el fenotipo headless también se ha descrito como un hipomorfo tras activar ectópicamente la vía Hh (Rink y col., 2009). Como discutiré más adelante (sección 3.2), este hipomorfo y otras evidencias sugieren que la correcta morfogénesis de la cabeza requiere que los niveles de activación de la vía Wnt/βcatenina se mantengan bajos durante la regeneración anterior. Por tanto, una hipótesis muy tentadora es que la activación asimétrica de la vía del calcio en un contexto normal ayude a notum a mantener los niveles bajos de activación de la red que controla la βCATENINA durante la regeneración anterior, ya sea tempranamente a nivel de wnt1 (Zhang y col., 2011) y/o más tardíamente a nivel nuclear (Beane y col., 2011; Zhang y col., 2011). Finalmente, es importante mencionar que se ha descrito un gradiente de potencial de membrana en planarias adultas (Beane y col., 2011), así como se ha sugerido un gradiente de calcio que decrece hacia posterior (Nogi y col., 2009); gradientes que podrían interpretarse como un gradiente postero-anterior de competencia a formar cola. Además, Zhang y colaboradores (2011) sugieren que los canales de calcio involucrados en la polaridad de regeneración actúan a nivel del SNC. 143 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración Señales nerviosas de largo alcance y las GJC controlan la polaridad regenerativa en sinergia con la vía Wnt/βcatenina. La inhibición de la comunicación por uniones gap (gap junction communication GJC) mediante drogas o específicamente mediante ARNi de tres inexinas (proteínas estructurales de las GJ) asociadas al SNC también resulta en un fenotipo two-headed en planarias (Nogi y Levin, 2005; Oviedo y col., 2010). Sin embargo, la inhibición de la GJC no afecta la polaridad regenerativa si el cerebro está presente en el fragmento regenerante y la comunicación a éste a través de los cordones nerviosos ventrales no está interrumpida (Oviedo y col., 2010). Los autores de estos artículos interpretan estos resultados de acuerdo con los estudios clásicos, y proponen que el cerebro produce una señal que es transmitida muy rápidamente (3-6 horas después de amputar) a través de los cordones nerviosos y las INEXINAS hasta el lugar de la herida que inhibe la formación de un cerebro/cabeza ectópica; es decir, respaldan la existencia de un Brain Inhibitor (BI) en planarias y la idea de que el SNC, junto con la GJC, actúa como mecanismo de transmisión de ésta señal de largo alcance (Lange y Steele, 1978). De manera interesante, los estudios de Oviedo y colaboradores (2010) muestran que las señales transmitidas por las GJ controlan la polaridad regenerativa en sinergia con la vía Wnt/βcatenina. No obstante, dado que la perdida de función de los genes en cuestión no es total (ARNi/droga) y en otros sistemas se ha descrito que la vía Wnt y la GJC pueden estar relacionadas a diferentes niveles (Giepmans, 2004; Rinaldi y col., 2014; Saezy y col.,1989), no podemos saber con certeza si las señales que transmiten estos dos mecanismos de control actúan de manera totalmente independiente sobre un/os genes diana comunes, si la vía Wnt/βcatenina interfiere con la GJC o si las señales inhibitorias de cerebro modulan positivamente la activación de la vía Wnt/βcatenina en heridas posteriores. Curiosamente, la susceptibilidad a desarrollar el fenotipo two-headed tras bloquear la GJC aumenta cuanto más posterior es el fragmento regenerante (Oviedo y col., 2010), mientras que estudios previos muestran justo lo contrario (Nogi y Levin, 2005). Lange y Steele (1978) proponen un gradiente de Brain Inhibitor que es transitorio o dinámico y que desde su fuente, el cerebro, migra hacia posterior movido por un campo bioeléctrico generado por el SNC. Por lo tanto, si el BI modula positivamente el hipotético gradiente de competencia a regenerar la cola, los datos de Oviedo y colaboradores (2010) podrían indicar que la GJC está involucrada en establecer dicho gradiente, mientras que los efectos de la vía Wnt/βcatenina en el establecimiento de la polaridad están sujetos a él. De acuerdo con esta idea, el bloqueo de la GJC afecta la transmisión del inhibidor de cabeza en Hydra (Bode, 2009). 144 Discusión En conjunto, todos estos datos ponen de manifiesto que el establecimiento de la polaridad de regeneración en planarias no depende meramente de señales locales desencadenadas por la herida (p.ej. wnt1, notum o el calcio intracelular), sino de una red de interacciones entre éstas, y señales de largo alcance que convergen en modular la activación de la βCATENINA o la red génica que controla en el lugar de la herida a través de diferentes mecanismos (como la GJC o el SNC). Asimismo, respaldan la idea que la restauración de la polaridad original en estos organismos está modulada por la acción antagónica de dos gradientes de señalización opuestos (Meinhardt, 2008; Meinhardt, 2009b): uno antero-posterior que promueve la regeneración de la cabeza directa (p.ej. el potencial de membrana, el calcio intracelular) e/o indirectamente a través de inhibir la regeneración de la cola por la acción de la βCATENINA (p.ej. inhibidores extra- e intracelulares como el calcio), llámese gradiente de competencia a regenerar la cabeza; y un gradiente postero-anterior de competencia a regenerar la cola que promueve la activación de la βCATENINA y la regeneración de la cola directa- (βCATENINA) e/o indirectamente a través de inhibir la regeneración de la cabeza (βCATENINA, BI), llámese gradiente de competencia a regenerar la cola. Dada la estrecha relación entre la señalización por calcio y el SNC (Zhang y col., 2011), y el papel del SNC como mecanismo de transmisión de el BI (Lange y Steele, 1978; Oviedo et al., 2010), podríamos interpretar el gradiente de competencia a regenerar la cabeza como el head frequency (figura 44). 2.3 La polaridad inicial del SNC es independiente de la polaridad que adopte el blastema tras manipular la vía Wnt/βcatenina Uno de los resultados más inesperados obtenidos en esta tesis doctoral es la diferenciación de un primordio del cerebro en heridas anteriores en los heteromorfos two-tailed generados tras silenciar las axinas o Smed-APC-1 (Iglesias y col., 2011). Estos datos han sido corroborados por los estudios realizados en paralelo por Evans y colaboradores (2011), pero ¿por qué la regeneración de una cola en heridas anteriores tras activar ectópicamente la vía Wnt/βcatenina no inhibe la regeneración inicial del primordio de cerebro, y la pérdida de función de ésta vía resulta en una cabeza y un cerebro aparentemente normal en heridas posteriores? 145 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración Antes de abordar esta pregunta, es importante remarcar que tanto la inhibición como la activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina no afecta de manera simétrica la regeneración del SNC. En el caso del fenotipo two-tailed es evidente que a nivel del SNC la cola ectópica no es como la normal posterior e inicialmente regenera asimétricamente (el primordio del cerebro en heridas anteriores); aunque a diferencia de un organismo control donde el primordio del cerebro se diferencia dentro del blastema anterior, éste se diferencia en el límite blastema-postblastema (Iglesias y col., 2011). Pero también es importante que la cabeza posterior en el fenotipo two-headed, aunque morfológicamente es normal, se forma más tarde que la cabeza anterior (observación personal y figura 1 en Iglesias y col., 2008). Además, según Evans y colaboradores (2011), tanto el primordio del cerebro del fenotipo two-tailed como el cerebro anterior en el fenotipo two-headed provienen de neoblastos en fase G2/M (determinados por una señal que actúa antes de las 16h), mientras que el cerebro posterior tras inhibir la βcatenina proviene de neoblastos en otro estadio del ciclo celular. Por tanto, estos datos indican que los mecanismos que determinan la regeneración del cerebro actúan inicialmente de acuerdo con la información preexistente del fragmento regenerante e indistintamente de la identidad AP (cabeza vs cola) que adopte el blastema tras manipular la vía Wnt/βcatenina. Ahora bien, ¿cuáles pueden ser estos mecanismos que determinan la regeneración asimétrica del SNC (cerebro vs no cerebro) en sus estadios más iniciales? Como he comentado, la vía Wnt/βcatenina controla la polaridad AP de regeneración en sinergia con un mecanismo basado en gradientes. Por tanto, una posibilidad es que dicho mecanismo, presente todavía en el tejido preexistente en el momento de la herida, sea el que inicialmente determina la regeneración asimétrica del SNC. De acuerdo con las ideas previamente desarrolladas por Adell y colaboradores (2010), en un contexto normal este mecanismo actuaría antes, o de manera simultánea, al mecanismo de retro- inhibición Wnt1-bcatenina-notum que se desencadena en el lugar de la herida, controlando así la polaridad AP de regeneración en sinergia. La manipulación de la vía Wnt/βcatenina desacopla inicialmente y de manera transitoria estos dos mecanismos en el lugar de la herida donde se regenerara ectópicamente la cola (axins o APC-1 ARNi) o la cabeza (βcatenina ARNi). Así, la diferenciación del primordio del cerebro en anterior (axins o APC-1 ARNi) y el retraso en la regeneración de una cabeza posterior (βcatenin ARNi) podrían deberse a los remanentes de la polaridad codificada inicialmente en el tejido preexistente. Es decir, la acción de manipular la vía Wnt/βcatenina no tiene un efecto inmediato sobre la polaridad de regeneración (al menos a nivel de la regeneración del SNC), permitiendo que los primeros neoblastos que responden a la herida (G2/M) se diferencien de acuerdo con la información preexistente codificada por el mecanismo basado en gradientes. En concordancia con esta idea, los estudios de 146 Discusión Yagazawa y colaboradores (2009) demuestran que hay una transformación gradual de la identidad inicial anterior hacia una posterior cuando se promueve indirectamente la vía Wnt/βcatenina (a través de promover la vía Hh). Además, la diferenciación del primordio del cerebro en el límite blastema-postblastema en un fondo axins o APC-1 ARNi coincide con la parte más anterior del tejido preexistente (Iglesias y col., 2011). La vía de señalización FGF es un candidato interesante a controlar inicialmente la diferenciación del primordio del cerebro indistintamente de la identidad AP que adopte el blastema de regeneración en planarias (Adell y col., 2010; Agata y Umesono, 2008; Cebria y col., 2002). La perdida de función de nou-darake (ndk, un tipo de receptor de FGF que modula la vía FGF) no afecta la polaridad AP en planarias, pero de manera similar a la diferenciación del primordio de cerebro en heridas anteriores tras activar la vía Wnt/βcatenina, la inhibición de este gen resulta en la diferenciación de tejido cerebral en la interfase blastema-postblastema posterior (en heridas posteriores) (Cebria y col., 2002; Iglesias y col., 2011). Desafortunadamente, no disponemos de las herramientas para testar si esta vía es la responsable de la formación del primordio de cerebro en un contexto axins o APC-1 ARNi. Sí se podría analizar, sin embargo, si la inhibición conjunta de ndk y βcatenina rescata el retraso de la regeneración de la cabeza posterior observado en un fondo βcatenina ARNi. En cualquier caso, el mecanismo que inicialmente controla la regeneración asimétrica del cerebro parece ser un sistema robusto definido por una red de señalización en el que la vía del calcio (Beane y col., 2011; Zhang y col., 2011), la vía ERK1/2 (Umesono y col., 2013) – quizás la misma vía que modula ndk -, las señales inhibitorias de cerebro (BI) que transmiten las GJ (Oviedo y col., 2010) y la función de la misma vía Wnt/βcatenina en homeostasis (hipotético gradiente de actividad βCATENINA) también pueden estar implicados (apartado de la discusión 2.2). Otra cuestión es si la determinación inicial del primordio del cerebro ocurre: (i) indistintamente de los niveles de βCATENINA en el sitio de la herida (tanto en axins ARNi como βcatenina ARNi) y bajo control de un gradiente anterior (p.ej. calcio o ERK1/2); (ii) también requiere de βCATENINA; o, (iii) no necesita de βCATENINA y en un fondo axins ARNi se forma porque el gradiente anterior es capaz de bloquear inicialmente la sobre-activación de la βCATENINA por debajo del complejo de destrucción de la βCATENINA. Si consideramos que notum y axinB son genes reporteros de la activación de la βCATENINA, la expresión temprana (6-24h) de estos genes en heridas anteriores descartaría la última opción. Durante el desarrollo temprano de vertebrados, la vía Wnt/βcatenina es necesaria inicialmente para establecer el centro de Nieuwkoop y el centro de BCNE necesario para dirigir el desarrollo de la cabeza y el 147 La vía Wnt/bcatenina y la polaridad AP de regeneración cerebro, aunque más tarde tiene la función de antagonizar el desarrollo de la parte más anterior del cerebro (Kiecker y Niehrs, 2001; Kuroda y col., 2004). En hemicordados sin embargo, se ha descrito que el neuroectodermo anterior es inducido muy tempranamente durante el desarrollo embrionario por factores maternales (p.ej. SoxB, Six3), factores que protegen de la posteriorización del neuroectodermo dependiente de la actividad βCATENINA (Angerer y col., 2011; Yaguchi y col., 2006). En definitiva, los mecanismos que determinan la regeneración del cerebro en las etapas más tempranas actúan inicialmente de acuerdo con la información preexistente del fragmento regenerante, e indistintamente de la identidad AP que otorga la vía Wnt/βcatenina al blastema de regeneración y del papel que esta vía pueda tener sobre la regeneración inicial del SNC. Estos datos son especialmente relevantes dentro del campo de la evolución y desarrollo. Una de las controversias actuales en este campo es si el eje oral-aboral de cnidarios corresponde al eje anteror-posterior de animales con simetría bilateral. Si se considera que el sitio de activación de la vía Wnt/βcatenina implica homología, el polo oral de cnidarios sería el equivalente al posterior de bilaterales y por ende, el aboral, donde se generan estructuras nerviosas centralizadas como el órgano apical, sería el anterior. Sin embargo, otras evidencias sugieren que el sistema nervioso localizado en el polo oral (donde la vía Wnt/βcatenina es activa) es el equivalente al cerebro de bilaterales (Martindale y Hejnol, 2009). Los resultados obtenidos en planaria nos dicen que de hecho, estas dos opciones no son tan contradictorias, ya que es posible la formación de un primordio de cerebro en un contexto posterior. 3. La vía Wnt/βcatenina y la elaboración del patrón a lo largo del eje AP en planarias Diversas evidencias sugieren que la inhibición parcial de la vía Wnt/βcatenina en planarias afecta la correcta regeneración de la cabeza y de la cola sin que ello conlleve a la formación de heteromorfos two-headed o two-tailed. Por ejemplo, bajas dosis de inhibición de βcatenina resulta en planarias que aparentemente no regeneran una cola ni una cabeza en heridas posteriores (fenotipo tailless) (Iglesias y col., 2008). De manera complementaria, la sobre-activación parcial de la vía Wnt/βcatenina resulta en un fenotipo headless (comentado en el apartado 1.2) (Rink y col., 2009) y otros 148 Discusión fenotipos hipomorfos de afectación de la cabeza (véase más adelante). En el otro lado de la balanza tenemos los fenotipos más extremos caracterizados en esta tesis doctoral: el fenotipo radial-like hypercephalized obtenido tras inhibir la βcatenina (Iglesias y col., 2008), y el fenotipo obtenido tras inhibir las axinas de “dos ejes AP opuestos y compuestos por una cola, una faringe y un primordio de cerebro” (Iglesias y col., 2011). En conjunto, estos datos muestran que la vía Wnt/βcatenina en planarias está involucrada en la elaboración de todas las estructuras del eje AP y sugieren un papel conservado en (i) promover el desarrollo y crecimiento de la parte posterior del cuerpo, y (ii) antagonizar el desarrollo del cerebro y la cabeza. 3.1 La vía Wnt/βcatenina y la regeneración de la cola Petersen y colaboradores describen dos fases de expresión de wnt1 durante la regeneración posterior: una temprana (6-24h) e independiente de neoblastos y βcatenina responsable de establecer la polaridad AP junto wnt4-2; y una subsiguiente (a partir de las 24h) que depende de neoblastos y βcatenina que los autores sugieren que es la encargada de promover la formación de la cola (Petersen y Reddien, 2009). Pero no ha sido hasta la posterior caracterización del gen islet en planarias cuando se ha validado específicamente esta función tardía de wnt1 (Hayashi y col., 2011). islet es un factor de transcripción implicado en la diferenciación de células post-mitóticas hacia células que expresan wnt1 y otros genes posteriores (p.ej. ligandos Wnt y genes Hox que se expresan específicamente en la región cola de un adulto), los cuales a su vez dependen de βcatenina y de wnt1. La inhibición de islet resulta en un fenotipo tailless, pero de manera importante, no afecta la expresión temprana de varios genes posteriores en células diferenciadas, ni en particular, la expresión de wnt1 y wnt4-2. Por lo tanto, estos datos demuestran que aunque se establezca la polaridad AP de regeneración, la correcta formación de una cola depende del mantenimiento de la actividad βCATENINA en heridas posteriores. Asimismo, Hayashi y colaboradores (2011) muestran que bajas dosis de inhibición de wnt1 resulta en un fenotipo tailless a través de afectar solo la segunda fase de expresión de este gen en blastemas posteriores, lo cual correlaciona con el fenotipo tailless observado tras bajas dosis de inhibición de la βcatenina (Iglesias y col., 2008). Entre los genes posteriores regulados por islet y βcatenina encontramos wnt11-1 y wnt11-2, otros Wnts posteriores que bien pueden transducir la señal a través de la βCATENINA, estableciendo un mecanismo de retroalimentación positiva, o a través de la vía Wnt no canónica, cuya función es bien conocida en otros sistemas por su implicación en los movimientos morfogenéticos de elongación del eje AP durante la embriogénesis (Holland, 2002) (apartado de la introducción 3.2). De acuerdo con esta 149 La vía Wnt/bcatenina y la elaboración del patrón AP posible función tardía de la vía Wnt/βcatenina, wnt11-2 se expresa relativamente tarde durante la regeneración posterior (3-4 días después de amputar) y su pérdida de función resulta también en un fenotipo tailless (Adell y col., 2009; Gurley y col., 2010). En definitiva, estos datos indican que durante la regeneración de planarias la vía Wnt/βcatenina no solo es necesaria tempranamente para activar la expresión de distintos genes posteriores en células diferenciadas (establecer el polo posterior), sino también para activar en las células post-mitóticas que se van generando durante el transcurso de la regeneración los genes que mantendrán esta “identidad posterior” y promoverán el crecimiento y desarrollo subsiguiente de la cola. 3.2 La vía Wnt/βcatenina y la regeneración de la cabeza Varios elementos de la vía Wnt se expresan en la cabeza y el cerebro en planarias adultas, y en particular la βcatenina, APC-1 y las axinas (Almuedo-Castillo y col., 2012; Iglesias y col., 2011; Iglesias y col., 2008). Todos estos elementos muestran un patrón de expresión muy dinámico durante la regeneración anterior (Almuedo-Castillo y col., 2012; Gurley y col., 2010), lo que sugiere que la vía Wnt está regulando diferentes procesos del desarrollo de la cabeza o cerebro. Destacadamente, βcatenina y axinB se expresan fuertemente en heridas anteriores tan tempranamente como 1 día después de amputar. Conforme transcurre la regeneración, la expresión de βcatenina en el blastema anterior se mantiene, mientras que la expresión de axinB decae y la de axinA se puede detectar a partir del tercer día (Iglesias y col., 2011; Iglesias y col., 2008). Los estudios funcionales de la vía Wnt/βcatenina respaldan que esta vía está regulando el desarrollo de la cabeza/cerebro en planarias, ya que aparte del fenotipo headless (Rink y col., 2009), la parcial sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina afecta la regeneración de la cabeza en diferentes grados. Así, el cerebro crece más o menos dependiendo de la dosis de inhibición de APC-1 (Fig. S9 en Iglesias y col., 2011); o por ejemplo, los fragmentos tronco donde se ha inhibido uno de los dos parálogos de la axina (axinA o axinB ARNi), regeneran una cabeza dónde no se diferencian los mecanoreceptores de la periferia (figura supl. 3 en Iglesias y col., 2011). Además, de manera muy parecida a lo descrito tras inhibir la función de las GSK3s (Adell y col., 2008) (apartado 8 de la introducción), las planarias axinA ARNi muestran una muesca en la punta de la cabeza y posibles problemas de conexión entre los dos ganglios cefálicos (figura supl. 3 en Iglesias y col., 2011). De manera interesante, la pérdida de función de bcatenina resulta en la formación de una cabeza ectópica en cualquier 150 Discusión blastema de regeneración excepto cuando se realizan cortes por encima de los ojos, en cuyo caso, solo se regenera el trozo que falta (Petersen y Reddien, 2008). Por consiguiente, una posibilidad es que la correcta morfogénesis de la cabeza necesite de bajos niveles de βCATENINA en la parte más anterior de la cabeza, y/o durante el periodo que se conectan los dos hemisferios (2-3dias). No obstante, estos hipomorfos no han sido estudiados tan detalladamente como el fenotipo tailless y solo podemos especular de cómo la vía Wnt/βcatenina puede estar regulando el desarrollo de una cabeza normal. Como se ha comentado en la introducción (apartado 3.2), después de la transición de blástula media de vertebrados, la vía Wnt/βcatenina regionaliza el neuroectodermo a lo largo del eje AP (Kiecker y Niehrs, 2001). En planarias, sabemos que los diferentes marcadores que subdividen el cerebro en diferentes dominios medio-laterales (otxA, otxB y otp) y antero-posteriores (WntA y FzA) se expresan en el primordio del cerebro en un fenotipo two-tailed y aparentemente, también marcan diferentes dominios de este primordio - aunque no podemos determinar exactamente la orientación de estos primordios respecto el eje primario del cuerpo - (Iglesias y col., 2011). Por tanto, y en base a los marcadores regionales utilizados, es muy probable que en los hipomorfos arriba comentados tampoco esté afectado este patrón del cerebro. Sin embargo, el análisis complementario en un fenotipo two-headed con FzA y wntA (wnt4-1en la nueva nomenclatura; tabla 3) nos revela que hemos de ser precavidos en sacar conclusiones (anexo 2). En parte porque FzA y wntA/wnt4-2 son componentes de la misma vía Wnt que podrían estar sujetos al control transcripcional de la βCATENINA, pero también porque en vertebrados la anteriorización o posteriorización del cerebro tras manipular la vía Wnt/βcatenina siempre respeta ciertos límites (Kiecker y Niehrs, 2001). Por tanto, no podemos descartar que la sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina antagonice el desarrollo del cerebro y la cabeza en planarias a través de afectar el patrón AP de la cabeza. Estos datos indican que de manera similar a lo descrito en muchos organismos, la vía Wnt/βcatenina en planarias esta involucrada en el desarrollo de la cabeza y que quizás, para que se forme la parte más anterior de la cabeza/cerebro, es necesario que se mantengan los niveles de βCATENINA bajos durante la regeneración anterior. En un futuro, seria interesante re-analizar detalladamente con otros marcadores regionales todos estos fenotipos hipomorfos de afectación de la cabeza, así como manipular específicamente la vía Wnt/βcatenina en diferentes ventanas temporales durante la regeneración. 151 La vía Wnt/bcatenina y la elaboración del patrón AP La vía Wnt/bcatenina y el límite posterior de la cabeza Como se ha comentado en la introducción (apartado 3.2), la vía Wnt/βcatenina está involucrada en mantener el organizador del Istmo en estadios tardíos del desarrollo de vertebrados (Kiecker y Niehrs, 2000; Kiecker y Niehrs, 2001), así como un centro equivalente en hemicordados (Pani y col., 2012) y quizás también en otros invertebrados (Oberhofer y col., 2014). De manera importante, este centro señalizador depende del mantenimiento de la señalización FGF por la vía Wnt/βcatenina en vertebrados (Elkouby y Frank, 2010). Los estudios de Kobayashi y colaboradores (2007) sugieren que la vía Wnt puede tener un papel en la posteriorización del cerebro y/o en mantener el límite posterior del cerebro en planarias. La expansión de la cabeza observada tras inhibir la βcatenina respaldan esta idea e involucra la vía Wnt/βcatenina en este proceso (Iglesias y col., 2008). De manera interesante, los experimentos de inhibición conjunta de ndk (un tipo de receptor de FGF) y APC-1 indican que la vía Wnt/βcatenina promueve la señal que ndk está restringiendo en la región de la cabeza en planarias (Agata y Umesono, 2008; Cebria y col., 2002; Iglesias y col., 2011). En conjunto, estos datos sugieren que la vía Wnt/βcatenina en planarias está involucrada en mantener los límites posteriores del cerebro a través de activar una señal tipo FGF. Sin embargo, es muy prematuro sugerir un centro equivalente al organizador del Istmo en planarias, y entre otras cosas, hace falta descubrir la señal tipo FGF que modula la βcatenina y que ndk restringe en la cabeza. 3.3 La vía Wnt/βcatenina es esencial para restaurar todo el eje AP Durante la regeneración de planarias no todas las estructuras perdidas se diferenciaran en el blastema. La correcta restauración del eje AP en estos organismos requiere que el tejido preexistente restablezca las diferentes estructuras del eje AP que faltan secuencialmente a la determinación de la polaridad de regeneración. De acuerdo con este pre-patrón, el fragmento regenerante se remodela para dar lugar al cabo del tiempo una planaria más pequeña, pero perfectamente proporcionada al nuevo tamaño corporal (apartado de la introducción 6.2). 152 Discusión La inhibición de la βcatenina no solo resulta en un fenotipo tailless o two-headed, sino que dependiendo de la dosis de inhibición, el fenotipo two-headed evoluciona hacia planarias totalmente anteriorizadas o cefalizadas, fenotipo llamado radial-like hyperchepalized. Esta anteriorización es gradual desde ambos blastemas y afecta diferentes estructuras del eje AP (SNC, digestivo, y varios marcadores regionales) (Iglesias y col., 2008). En cambio, el fenotipo two-tailed obtenido tras inhibir las axinas o APC-1 evoluciona hacia planarias con dos ejes AP opuestos compuestos por una cola, una faringe y un primordio del cerebro, el fenotipo más extremo observado. Este fenotipo depende del tiempo, la dosis de inhibición y la información preexistente del fragmento regenerante. Así por ejemplo, raramente se han observado fragmentos post- faríngeos que diferencien dos faringes en orientación opuesta con sus primordios del cerebro asociados; en estos fragmentos en cambio, parece que los dos ejes opuestos comparten un primordio del cerebro y una faringe sin orientación definida – la parte distal de la faringe no esta orientada hacia ninguna de las dos colas, más bien parece que se recoloca perpendicular a estas - (Iglesias et al., 2011). En conjunto, estos datos demuestran que la vía Wnt/βcatenina en planarias es esencial para restaurar todo el eje AP. Digo esencial, y no necesaria y suficiente, porque aparentemente el fenotipo de βcatenina ARNi indica que no es necesaria para formar el primordio del cerebro, pero el fenotipo axins ARNi nos indica que es capaz de inducir un segundo primordio del cerebro (llamado brain primordia-like en Iglesias y col., 2011). Asimismo, en los ejes opuestos que se inducen tras sobre-activar la vía Wnt/βcatenina, el cerebro/cabeza no se desarrolla y la región pre-faríngea no parece que se intercale entre los primordios del cerebro y las faringes, más bien parece que esta región desaparezca (p.ej. figura 1, 40días después de amputar, y figura 8 en Iglesias y col., 2011). Esta tendencia de no restaurar la región pre-faríngea en un fondo axins ARNi la respalda los fragmentos cabeza (figura Supl.11 en Iglesias y col., 2011). En conjunto, estos datos podrían indicar que la región pre-faríngea en planarias se restaura por la intercalación de valores entre la región cabeza y la región tronco-cola; y por un lado, la vía Wnt/βcatenina inhibe el desarrollo de la cabeza pero no la formación de un primordio del cerebro, y por el otro, promueve el desarrollo del tronco y de la cola y la aparición de nuevos primordios del cerebro. La inducción de ejes incompletos tras sobre-activar la vía Wnt/βcatenina probablemente es la suma de las diferentes funciones conservadas de esta vía en el tiempo (apartado de la introducción 2.2): inicialmente establece la polaridad del eje AP, y luego está involucrada en elaborar las diferentes estructuras de este eje (desarrollado más adelante). La inducción de ejes ectópicos pero incompletos anteriormente también se ha observado en ratones tras expresar ectópicamente Wnt8 antes de la transición de blástula media (Popperl y col., 1997) (compárese la figura 11 de la introducción con las figuras 3b y 8 en Iglesias y col., 2011). 153 La vía Wnt/bcatenina y la elaboración del patrón AP 4. Mantenimiento del eje AP durante la homeostasis Las planarias adultas o intactas continuamente crecen y decrecen dependiendo de las condiciones ambientales, pero siempre manteniendo la forma y proporciones corporales. Esta capacidad para remodelar su cuerpo continuamente sugiere la presencia de mecanismos de formación del patrón siempre activos para mantener el eje AP (Salo, 2006). El estudio de la inhibición de la βcatenina en organismos intactos demuestra que la vía Wnt/βcatenina también es necesaria para mantener el eje AP durante la homeostasis. Del mismo modo que durante la regeneración, la inhibición de la βcatenina resulta en una anteriorización progresiva y pérdida de las estructuras posteriores a la cabeza (Gurley y col., 2008; Iglesias y col., 2008). En la mayoría de casos analizados, la anteriorización empieza por la cola y continúa de manera comparable a lo observado durante la regeneración: desde ambas cabezas localizadas en los polos, hasta la región central de las planarias adultas tratadas (Iglesias y col., 2008). Esta dinámica en el proceso de anteriorización indica que el polo posterior y el limite posterior de la cabeza son las zonas más susceptibles a la inhibición. La susceptibilidad de estas zonas podría explicarse por: (i) tener unas tasas de recambio celular más elevadas, (ii) necesitar más βcatenina, y/o (iii) la βcatenina antagoniza una reacción en cadena de formación de cabeza que es promovida por la cabeza. Respaldando la idea de que la cola es una región con alta demanda de βcatenina, Gurley y colaboradores (2010) muestran que las células que expresan wnt1 en la cola dependen de la actividad βcatenina y tienen una alta tasa de recambio celular. Análisis preliminares de inhibición de las axinas en organismos intactos indican que la sobre-activación de la vía Wnt/βcatenina podría afectar el mantenimiento de la parte más anterior de la cabeza y el cerebro, promover el desarrollo de la cola, e inducir la formación de ejes ectópicos (anexo 3). No obstante, los defectos de la cabeza parecen estar asociados al sitio de inyección del ARN de doble cadena (anexo 3b). En un futuro sería interesante promover la vía Wnt/βcatenina mediante la técnica de ARNi por alimentación y comprobar por ejemplo, si esta vía antagoniza el mantenimiento de la parte más anterior de la cabeza durante la homeostasis. 154 Discusión 5. Hipotético modelo del papel de la vía Wnt/βcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje AP Después de haber desarrollado extensamente los resultados obtenidos en esta tesis doctoral en conjunto con los datos surgidos en paralelo o a posteriori, a continuación voy a proponer un modelo basado en un mecanismo de balancín molecular regulado por la vía Wnt/bcatenina para explicar el restablecimiento del eje AP. (i) Respuesta a la herida, establecimiento de organizadores y de la polaridad AP (6-24h). Rápidamente en respuesta a un daño diferentes componentes de la vía Wnt se expresan en células diferenciadas de la herida, en concreto en las células musculares subepiteliales de la pared corporal (Gurley y col., 2010; Petersen y Reddien, 2009; Petersen y Reddien, 2011; Witchley y col., 2013; Yazawa y col., 2009). Entre 6 y 9 horas después de amputar (en S.mediterranea), wnt1 y wntless se expresan en cualquier herida independientemente de si se ha de regenerar una cabeza o una cola. La activación de la vía Wnt/βcatenina induce la expresión de su inhibidor notum (6-18h), el cual se acumula preferencialmente en miocitos de la herida anterior porque un mecanismo desconocido lo inhibe en posterior (señal X en el esquema) (Petersen y Reddien, 2011; Witchley y col., 2013). En miocitos de la herida posterior la vía Wnt/βcatenina induce la expresión de wnt4-2 a las 24 horas después de amputar. En conjunto, esta expresión asimétrica en heridas anteriores vs posteriores promueve la activación de la βCATENINA en posterior y la inhibe en anterior, estableciendo así dos regiones organizadoras opuestas en células diferenciadas de la herida y por lo tanto, la polaridad regenerativa: un organizador anterior caracterizado por la expresión de notum, el cual dirigirá el desarrollo subsecuente de la cabeza (Roberts-Galbraith y Newmark, 2012; Scimone y col., 2014; Vasquez-Doorman y Petersen, 2014; Vogg y col., 2014); y un organizador posterior caracterizado por la expresión de wnt1 que dirigirá el desarrollo subsecuente del tronco y de la cola (Adell y col., 2009; Gurley y col., 2010; Hayashi y col., 2011; Petersen y Reddien, 2009). Esta función temprana de la vía Wnt/βcatenina de especificar la región tronco-cola en células diferenciadas la respalda el fenotipo pharynx/tailless descrito en cabezas regenerantes tras inhibir wnt1 pero no islet (solo es tailless) (Hayashi y col., 2011), así como la expresión de wnt4-2 en organismos intactos en forma de gradiente postero-anterior desde la cola hasta delante de la faringe 155 (Petersen y Reddien, 2009). Es importante tener en cuenta que el proceso de estabilización asimétrica de la βcatenina es un sistema robusto controlado por varías vías de señalización donde las relaciones de epistasia no están del todo claras, pero en el que el SNC podría tener un papel importante (apartado 2 de la discusión). Si consideramos que la expresión de notum (anterior) y wnt4-2 (posterior) marca el momento en el cual se establece la polaridad, es interesante que la región anterior es determinada mucho antes (6h) que la región tronco-cola (24h), lo que respalda la idea de que el destino dominante del blastema es anterior (Brøndsted, 1954) a menos que se active la vía Wnt de manera sostenida. Ahora bien, ¿por qué se activa inicialmente la vía Wnt/βcatenina en cualquier tipo de herida independientemente de la polaridad AP que adopte? Como se ha comentado en la introducción, la vía Wnt está involucrada en la epitelización de la herida y en modular la capacidad regenerativa en diversos modelos (Guder y col., 2006b; Kawakami y col., 2006; Poss, 2010). Los fenotipos headless y tailless sugieren que la vía Wnt controla el restablecimiento de la polaridad, así como también podría estar desencadenando el proceso regenerativo en planarias, ya que morfológicamente los extremos de estos heteromorfos están truncados. Esta hipótesis está de acuerdo con las ideas desarrolladas por M. Marsal (Marsal, 2005 - Tesis Doctoral) (apartado 8 de la introducción), y la respalda la expresión temprana de notum y axinB (posibles genes reporteros de la activación de la vía Wnt/βcatenina) en heridas anteriores y posteriores (Iglesias y col., 2011; Petersen y Reddien, 2011). Aunque la expresión de axinB no se ha analizado antes de 24h después de amputar (Iglesias y col., 2011), la expresión de notum indica que la vía Wnt/βcatenina ya está activa entre 6 y 18 horas (Petersen y Reddien, 2011). Así pues, la activación inicial de la vía Wnt/βcatenina en los miocitos de la herida podría ser necesaria para desencadenar el establecimiento del organizador anterior y posterior, ambos necesarios para promover la regeneración (figura 46). Es interesante destacar que durante el desarrollo temprano de vertebrados, la vía Wnt/βcatenina también es necesaria para establecer el organizador de cabeza y el organizador de Spemann y Mangold (De Robertis and Kuroda, 2004; Kiecker and Niehrs, 2000; Kuroda et al., 2004). Paradójicamente, el fenotipo headless se obtiene tras promover parcialmente la vía Wnt/βcatenina (Rink y col., 2009), mientras que el tailless tras inhibirla y col., 2008), lo que indica que la hipotética función de la vía Wnt/βcatenina en establecer regiones organizadoras que promueven la regeneración y la polaridad AP depende de niveles relativos de activación en el sitio de la herida. Por ejemplo, podría depender de los niveles de señalización en relación con el tejido preexistente inmediatamente contiguo. Como se ha sugerido en diversas ocasiones a lo largo de esta discusión, estos niveles 156 Discusión preexistentes de actividad βcatenina podrían ser en forma de gradiente postero-anterior. Precisamente, un mecanismo basado en dos organizadores opuestos que se activan bajo el mismo estímulo pero que depende de niveles relativos o gradientes de señalización preexistentes, es lo que define la auto-regulación del eje DV por BMP y ADMP en embriones de Xenopus y planarias (De Robertis, 2009; Gavino y Reddien, 2011; Molina y col., 2011; Reversade y De Robertis, 2005). Personalmente, un mecanismo de balancín molecular basado en la regulación transcripcional opuesta de un organizador anterior (notum) que se activa por niveles bajos de actividad βCATENINA, y un organizador posterior (wnt1) que se activa por niveles relativamente más altos de actividad βCATENINA, explicaría muchas de las observaciones descritas a lo largo de esta discusión. Por ejemplo, la susceptibilidad más elevada a desarrollar los fenotipos two-tailed y two-headed en regiones pre-faríngeas (apartado de la discusión 2.2.1), el porqué el fenómeno del head frequency en planarias no parece estar afectado tras manipular la vía Wnt/βcatenina (apartado de la discusión 2.2.1), o el “fenotipo normal” descrito tras inhibir conjuntamente la señalización por calcio y la βcatenina (la inhibición de la señalización por calcio en heridas anteriores compensa la inhibición de la βcatenina y viceversa) (Beane y col., 2011) (apartado de la discusión 2.2.2). Papel del SNC en el establecimiento de la polaridad AP por un mecanismo de balancín molecular regulado por la vía Wnt/βcatenina La inhibición de la βcatenina resulta en una cabeza ectópica en heridas posteriores, pero este efecto es compensado si se inhibe al mismo tiempo la señalización por calcio específicamente en heridas anteriores, lo que apunta a un mecanismo de larga distancia que comunica el polo anterior con el posterior (Beane y col., 2011). Este mecanismo lo podría aportar el sistema nervioso y la comunicación por uniones tipo GAP (GJC). En respuesta a la herida, los cordones nerviosos ventrales y GJC transmiten una señal (o señales) nerviosa que señaliza la presencia de un cerebro (o en proceso de formación) y que inhibe la formación de una cabeza ectópica en heridas posteriores (Nogi y Levin, 2005; Oviedo y col., 2010). En D. japonica esta señal se transmite entre 3-6 horas, pero debido a las diferencias entre especies, no podemos concluir que tenga lugar antes de la expresión de los componentes de la vía Wnt descrita en S. mediterranea. Esta señal nerviosa se ha postulado que podría ser el hipotético inhibidor de cerebro (BI) producido por el cerebro y descrito en la literatura clásica (Lender, 1960; Oviedo y col., 2010) (apartado de la introducción 6.2.1). La rápida transmisión del BI por las GJC y los cordones nerviosos del polo anterior al posterior podría ser uno de los mecanismos que actúan en sinergia con la vía Wnt/βcatenina para controlar la polaridad regenerativa en posterior (Oviedo y col., 2010). De hecho, el BI 157 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP podría ser la señal X que se ha postulado que inhibe notum en posterior (figura 46) (Petersen y Reddien, 2011). El cerebro, a parte de producir el BI que actúa en el polo posterior, también puede contribuir a mantener la polaridad anterior y el desarrollo de la cabeza a través de inhibir la βcatenina (Beane y col., 2011; Fraguas y col., 2014; Zhang y col., 2011). Así por ejemplo, la inhibición de egr-4 afecta el desarrollo del primordio del cerebro, el mantenimiento del organizador anterior y el desarrollo de la cabeza; fenotipo, que es rescatado si se inhibe al mismo tiempo βcatenina (Fraguas y col., 2014). Fraguas y colaboradores (2014) describen que la inhibición de egr-4 no afecta el establecimiento inicial del organizador anterior, lo que sugiere que el cerebro y el organizador anterior son dos mecanismos redundantes que promueven el desarrollo de la cabeza a través de inhibir βcatenina. Ahora bien, es posible que bajos niveles de βCATENINA inicialmente promuevan el organizador anterior y éste a su vez induzca el primordio del cerebro, como es igualmente posible que bajos niveles de βCATENINA promuevan en paralelo el establecimiento del organizador anterior y la determinación del primordio del cerebro, sin uno requerir del otro (apartado de la discusión 2.3). En vertebrados, la βcatenina materna especifica el BCNE y el endomesodermo anterior (organizador), ambos necesarios para promover el desarrollo del cerebro y la cabeza (Kuroda y col., 2004). Interesantemente, el sistema nervioso y la vía Wnt/bcatenina promueven de manera redundante la regeneración de las extremidades en anuros; además, se ha sugerido que la capacidad regenerativa de estos organismos depende inicialmente de la vía Wnt/βcatenina (cuando la herida no esta inervada) y luego de señales nerviosas (Yokoyama y col., 2011). En definitiva, el SNC y la GJC serían los mecanismos de larga distancia que complementan el modelo de balancín molecular basado en la regulación transcripcional opuesta de un organizador anterior y el cerebro, que se activa antes por niveles bajos de actividad βCATENINA, y un organizador posterior, que se activa un poco más tarde por niveles relativamente más altos de actividad βCATENINA. El gradiente preexistente de actividad βCATENINA seria el gradiente de competencia a formar cola referido anteriormente (apartado de la discusión 2.2), y postulado por los modelos teóricos de restauración de la polaridad original (Meinhardt, 2008; Meinhardt, 2009b). A diferencia del modelo de Gierer-Meinhardt (1972), el modelo del balancín molecular asume además que el organizador anterior/cerebro y el organizador posterior se activan por el mismo estímulo (la vía Wnt/βcatenina). Obviamente, este modelo ganaría fuerza si se demuestra por otros medios - que no sea la expresión de axinB – la presencia de un gradiente postero-anterior de actividad βCATENINA así como su activación en los organizadores anterior y posterior, al menos en los estadios iniciales de la regeneración. 158 Discusión Figura 46. Modelo del papel de la vía Wnt/βcatenina en el establecimiento inicial de dos regiones organizadoras que promueven la regeneración y la polaridad regenerativa en planarias. Detalles en el texto. La vía de señalización de TGFβ (Roberts-Galbraith y Newmark, 2012), o ERK1/2 (Umesono y col., 2013) también se han descrito que pueden estar mediando la respuesta a la herida y la capacidad regenerativa en planarias. Cabe destacar que hay ciertas evidencias que sugieren que el modelo aquí propuesto también podría estar operando para establecer el eje primario en otros modelos. Hejnol y Martindale (2009) proponen que el polo animal de embriones no- bilaterales es el equivalente al polo dónde se forma el cerebro en bilaterales, el polo anterior, el mismo polo donde se activa la βCATENINA. En términos del modelo aquí presentado, en el polo animal la βcatenina podría estar activando el equivalente al organizador anterior a la vez que activa el organizador posterior (blastoporo). La hipótesis de Hejnol y Martindale propone que en la transición a la bilateralidad la activación de la βCATENINA se desplaza del polo animal a algún lugar del polo vegetal, permitiendo entre otras cosas que se desarrolle un SNC. No obstante, en varios organismos bilaterales hay indicios de cierta activación de la βCATENINA en el polo animal (futuro anterior). Como se ha comentado, en Xenopus la βcatenina materna es necesaria inicialmente para especificar el organizador anterior y el cerebro (Kiecker and Niehrs, 2000; Kuroda et al., 2004). En embriones de erizo de mar, un mecanismo materno degrada preferencialmente la βCATENINA en el polo animal para restringirla al posterior (Angerer y col., 2011; Kenny y col., 2003). Y de hecho, el polo anterior de estos organismos es refractario a la posteriorización tras sobre-activar la vía Wnt/βcatenina (Wikramanayake y col., 1995; Wikramanayake y col., 1998; Yaguchi y col., 2006). Otro ejemplo es la βCATENINA nuclear que se acumula en los micromeros animales muy tempranamente durante el desarrollo del gasterópodo C. fornicata, pero que a posteriori es degradada para restringir la βCATENINA nuclear preferencialmente en el linaje 4d (posible equivalente al organizador de Spemann y Mangold) (Henry y col., 2010). 159 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP ¿Integración del eje AP y DV a nivel de los organizadores? Durante el desarrollo de bilaterales, el eje AP se forma de manera integrada con el DV para asegurar un crecimiento proporcionando del patrón corporal. En planarias, la manipulación de la vía Wnt/βcatenina a nivel de βcatenina o del complejo de destrucción de la βcatenina no parece afectar el patrón del eje DV (Iglesias y col., 2011; Iglesias y col., 2008), ni la manipulación de la vía BMP – implicada en la formación del eje DV – parece afectar el eje AP (Molina, 2011 - Tesis Doctoral), lo que sugiere que estos ejes se forman de manera independiente pero integrada. No obstante, tanto para la vía Wnt/βcatenina (expuesto anteriormente), como para la vía BMP/Smads, se han descrito fenotipos de no-regeneración o con blastemas severamente afectados (Reddien y col.,2007; Molina, 2011 - Tesis Doctoral). Además, los postulados organizadores se localizan en la línea media ventral en anterior, y en la línea media dorsal en posterior; lo que apunta a que los ejes AP y DV se integran a nivel de estos organizadores, y estos promueven la regeneración y la restauración del patrón corporal de manera coordinada. Se ha sugerido que la integración de los ejes AP y DV es mediada en parte a nivel de GSK3, una kinasa que regula la vida media de muchas proteínas intracelulares, entre ellas la βCATENINA y Smad1, un efector intracelular de la vía BMP (Fuentealba y col.,2007; Huang y col., 2015). Así, mientras la vía BMP controla la intensidad de la señal de Smad1 y dirige la formación del eje DV, la vía Wnt controla la duración de esta señal de manera integrada con la formación del eje AP (Niehrs, 2010; Fuentealba y col.,2007). Aunque este mecanismo de integración solo se ha descrito en Xenopus y Drosophila, se ha postulado que también podría estar conservado en planarias (Eivers y col., 2009). (ii) Mantenimiento de la polaridad AP y restauración del patrón a lo largo del eje AP (1-4dias) Después de la expresión inicial de wnt1 y wnt4-2 en miocitos de la herida posterior, wnt11-1 y wnt11-2 se expresan sucesivamente de manera dependiente de βcatenina y neoblastos para promover el desarrollo y crecimiento de la cola (Gurley y col., 2010; Hayashi y col., 2011; Petersen y Reddien, 2009). Esta función tardía y conservada de la vía Wnt/βcatenina la respalda el fenotipo tailless descrito tras inhibir parcialmente βcatenin (Iglesias y col., 2008), inhibir wnt11-2 (Adell y col., 2009; Gurley y col., 2010) o islet (Hayashi y col., 2011). En conjunto, estos datos indican que la activación temprana de la vía Wnt/βcatenina en planarias establece un organizador 160 Discusión posterior de Wnts – caracterizado por la localización de wnt1 en la línea media dorsal y posterior al final de este estadío - que dirige el desarrollo la parte posterior (tronco-cola) a través de mantener activa la vía Wnt/βcatenina (Adell y col., 2010; Almuedo-Castillo y col., 2012; Meinhardt, 2009a; Meinhardt, 2009b). En un futuro seria interesante analizar si este mecanismo conservado también depende en planarias de la activación de la vía Wnt no canónica y de diferentes genes Hox por parte de la βcatenina. En cambio, para promover el desarrollo de la cabeza es necesario que se mantenga la actividad del organizador anterior inicialmente establecido en miocitos de la herida anterior. Este organizador expresa diferentes antagonistas de la vía Wnt (p.ej. notum) y de la vía TGF/Activina (follistatin) (Roberts-Galbraith y Newmark, 2012) – aunque la función de follistatin no es exclusiva de anterior (Gavino y col., 2013) –, y su mantenimiento depende la acción de FoxD, ZicA y cofactores como pbx y prep en células postmitóticas que se localizan a lo largo de la línea media ventral (Blassberg y col., 2013; Felix y Aboobaker, 2010; Scimone y col., 2014; Vasquez-Doorman y Petersen, 2014; Vogg y col., 2014). Durante este estadío, el primordio del cerebro crece al mismo tiempo que restablece las conexiones entre los dos hemisferios y con los cordones nerviosos ventrales (Cebria, 2007). Los diferentes grados de afectación de la cabeza/cerebro observados tras bajas dosis de inhibición de APC-1, la inhibición de axinA (Iglesias y col., 2011), o tras inhibir las tres GSK3s de planaria (Adell y col., 2008), sugieren una función conservada de la vía Wnt/βcatenina en antagonizar este estadio del desarrollo del SNC más anterior. En el desarrollo de la cabeza también está involucrada la señalización por calcio (Beane y col., 2011; Zhang y col., 2011) y la señalización de EGFR-3/egr-4 (Fraguas y col., 2014), señales que actúan a nivel del SNC y posiblemente ayudan a mantener bajos niveles de activación de la βCATENINA desde los estadios más iniciales de la regeneración anterior. Finalmente, al mismo tiempo que la cabeza y la cola se desarrollan por el aporte de nuevas células y el mantenimiento de los organizadores correspondientes, también se restaura el patrón del eje AP en células diferenciadas del tejido preexistente (músculo subepitelial) y de manera dependiente de βcatenina (Gurley y col., 2010; Witchley y col., 2013). Así, de acuerdo con el patrón de expresión en el músculo subepitelial de diferentes marcadores regionales observado en colas regenerantes, al final de este estadío el eje AP está dividido en al menos 4 grandes regiones: cabeza, pre-faringe, tronco y cola. 161 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP Figura 47. Modelo del papel de la vía Wnt/βcatenina en el mantenimiento de la polaridad y restablecimiento de todo el eje. El organizador anterior promovería el desarrollo de la cabeza a través de antagonizar la βCATENINA en la parte más distal. Al mismo tiempo pero, la βCATENINA podría ser necesaria para regular diferentes aspectos de la morfogénesis del cerebro y la cabeza (p.ej. el patrón AP o el organizador del Istmo,Iso). El organizador posterior promueve el desarrollo de la cola a través de activar diferentes ligandos Wnt que mantienen la actividad βCATENINA, y quizás también a través de activar la vía Wnt no canónica y diferentes genes Hox. Abajo se muestra la expresión de diferentes componentes de la vía Wnt en una cola regenerante de manera independiente de neoblastos. Esta expresión restauraría el patrón a lo largo del eje AP. No hay datos de si ésta expresión ocurre de manera independiente de neoblastos en fragmentos tronco. Formación del hipotético gradiente de actividad βCATENINA y el código Wnt Muy probablemente, la restauración de las diferentes estructuras del eje AP depende del establecimiento inicial de un organizador posterior de Wnts que mantiene activa la βCATENINA, y un organizador anterior que la inhibe. Esta actividad antagónica de los organizadores es lo que podría estar restaurando a su vez el gradiente postero- anterior de actividad de βCATENINA responsable de mantener la polaridad original ante un daño. Es bastante inverosímil que el gradiente de actividad βCATENINA se forme por la difusión de un único morfógeno desde un polo de la planaria al otro (revisado en Wolpert,2010). La expresión solapante a lo largo del eje AP de diferentes ligandos Wnts respalda un modelo de reacción en cadena de interacciones inductivas entre células vecinas (Meinhardt y Gierer, 1980), donde una célula o región del eje AP modificaría el 162 Discusión comportamiento de la vecina a través de ligandos Wnt y así sucesivamente (apartado de la introducción 3.1). Estos ligandos Wnt pueden traducir la señal a través de la βcatenina o de las vías Wnt no canónicas, que entre otras funciones, son conocidas por antagonizar la βCATENINA (Logan y Nusse, 2004). Así pues, del mismo modo que en erizos de mar (Range y col., 2013), la acción integrada de las tres vías de Wnt podría generar el gradiente postero-anterior de actividad βCATENINA y el patrón del eje AP. En el polo anterior, diferentes antagonistas extracelulares (p.ej. notum) contribuirían a inhibir la activación de la βCATENINA. Asimismo, el gradiente antero-posterior de calcio intracelular postulado (Nogi y col., 2009) también podría antagonizar la actividad βCATENINA al mismo tiempo que reflejar una posible actividad de la vía Wnt no canónica. Dado que la vía Wnt/βcatenina es necesaria para restaurar todas las estructuras posteriores a la cabeza, el gradiente de actividad de βCATENINA podría a su vez otorgar información posicional y regionalizar el eje AP a través de activar diferentes genes Hox (Martin and Kimelman, 2009; Ryan and Baxevanis, 2007). En otras palabras, un código Wnt como el propuesto en hidras (Guder y col., 2006a) estaría formando el patrón del eje AP en planarias (figura 49). (iii) Remodelación anatómica y refinamiento del patrón (4-7/15dias) A partir del 4 día, los tejidos preexistentes se remodelan de acuerdo al patrón establecido en los días previos y al nuevo tamaño. Esta remodelación anatómica refina al mismo tiempo el patrón del eje AP y requiere del aporte de nuevas células por la proliferación de neoblastos (Gurley y col., 2010), así como seguramente de una alta tasa de muerte celular (Gonalez-Estevez y col., 2007; Pellettieri y col.,2010; Gonzalez- Estévez y Saló, 2010). Dependiendo del grado de remodelación que ha de sufrir el fragmento regenerante, este estadío se prolonga más o menos; una cola restaura el eje AP perfectamente proporcionado aproximadamente en dos semanas (Gurley y col., 2010). La formación de dos ejes AP opuestos pero incompletos tras inhibir las axinas (primordio del cerebro, faringe y cola) sugiere que la región pre-faríngea en planarias se restaura por la intercalación de valores entre la región cabeza y la región tronco-cola (apartado 3.3). Recientemente, se ha sugerido otro gradiente antero-posterior de actividad ERK1/2 regulado por ndk, ndk-like genes (ndl) y βcatenina (Umesono y col., 2013). Umesono y colaboradores (2013) sugieren que este gradiente de ERK1/2 estaría implicado en formar las estructuras que se encuentran entre la cabeza y la faringe. 163 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP Figura 48. Remodelación anatómica y refinamiento del patrón AP. No obstante, el papel de la vía Wnt/βcatenina en este estadío o en el proceso especifico de remodelación (proliferación, diferenciación y muerte celular) es escaso, por no decir nulo. La βcatenina se expresa tanto en neoblastos como en células diferenciadas (Iglesias y col., 2011), así que potencialmente también puede regular diferentes aspectos de la biología de los neoblastos. Interesantemente, la única zona de la planaria donde no parece que se necesite mucha actividad βCATENINA es justo por delante de los ojos, zona desprovista de neoblastos y sistema digestivo. (iv) Mantenimiento del eje durante la homeostasis Una vez regenerado el eje AP, este también es mantenido contínuamente por la vía Wnt/βcatenina. El mantenimiento durante toda la vida de la planaria de dos gradientes de señalización con funciones antagónicas (p.ej. gradiente postero-anterior de actividad βCATENINA y gradiente anteror-posterior de calcio) explicaría la gran plasticidad de las planarias: la capacidad de escalar continuamente el patrón corporal durante procesos de crecimiento y decrecimiento en tamaño que padecen estos organismos, y la capacidad de restaurar el patrón durante la regeneración. Estos gradientes serían establecidos por la acción combinada del organizador anterior y el cerebro - en el polo anterior -, y el organizador posterior - en el polo posterior -. Para que el sistema se auto-regule, diferentes mecanismos y vías de señalización estarían implicados en mediar la mutua inhibición y activación de estos gradientes (Meinhardt, 2008 y 2009). Por ejemplo, el SNC y las GJC inhibirían la formación de un cerebro/cabeza en posterior a través de actuar en sinergia con la vía Wnt/βcatenina en posterior (Oviedo y col.,2010); mientras que la actividad de la βCATENINA en el cerebro y/o en el organizador anterior en homeostasis podría promover a su vez el gradiente antero-posterior. 164 Discusión Figura 49. Modelo del papel del papel de la vía Wnt/βcatenina en el mantenimiento del eje AP durante la homeostasis. Se han descrito diferentes gradientes antero-posteriores que pueden subyacer el gradiente de competencia a regenerar la cabeza. Código Wnt y el gradiente de actividad βCATENINA. 1, Posible papel del SNC y las GJC en promover la activación de βCATENINA en posterior; 2, Posible papel de la βCATENINA en promover el organizador anterior y/o regular la morfogénesis del cerebro; 3, Posible papel de βCATENINA en inhibir el gradiente de ERK1/2; 4, Posible papel del calcio intracelular en inhibir la βCATENINA. Conclusiones finales del modelo De acuerdo con los modelos teóricos de Meinhardt que postulan un gradiente de competencia para restaurar la polaridad original (revisado en Meinhardt,2008 y 2009), este modelo propone que la polaridad regenerativa depende de un gradiente preexistente postero-anterior de actividad βCATENINA. Ante el mismo estímulo de activación de la βCATENINA desencadenado por una herida (wnt1), bajos niveles de actividad βCATENINA activan un organizador anterior y promueven la determinación de ciertas células a formar el cerebro; mientras que niveles relativamente más altos de actividad βCATENINA activan un organizador posterior. El organizador anterior /determinación de cerebro se activa antes y envía una señal a través de los cordones nerviosos y las GJC que promueve la activación sostenida de la vía Wnt/βcatenina en posterior, promueve el establecimiento del organizador posterior. Por tanto, la vía Wnt/βcatenina es necesaria inicialmente para establecer el polo anterior y el posterior, y con ello la polaridad regenerativa. La acción combinada de los organizadores y el SNC 165 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP dirigirán subsecuentemente la restauración y elaboración de todo el eje AP a través de sus actividades opuestas: el organizador anterior/cerebro promueve la regeneración de la cabeza a través de expresar antagonistas de la vía Wnt y TGF/Activina en la parte distal, y por tanto una de sus funciones sería la de mantener bajos niveles de activación de la βCATENINA, pero al mismo tiempo el cerebro promovería la vía Wnt/βcatenina y mantendría los límites posteriores del cerebro/cabeza; el organizador posterior promueve la regeneración del tronco y la cola a través de expresar varios Wnts y mantener activa la βCATENINA (funciones tardías de la vía Wnt/βcatenina). Ambos organizadores se mantienen activos durante toda la vida de la planaria, y junto con el SNC, mantienen el gradiente de actividad de βCATENINA. El eje AP se auto-regula ante cualquier perturbación (daño y cambios de tamaño) por un mecanismo de balancín molecular basado en la regulación transcripcional opuesta por la vía Wnt/βcatenina de la cabeza (organizador anterior y cerebro) y la cola (el organizador posterior). Los fenotipos two-headed y two-tailed según el modelo En una contexto βcatenin ARNi, tanto planarias intactas como regenerantes bipolares experimentan una anteriorización progresiva desde ambos extremos (Iglesias y col., 2008). Esta dinámica podría explicarse por la alta tasa de recambio celular de los organizadores situados en los extremos (Gurley y col., 2010;Vogg y col., 2014), junto una reacción en cadena desde ambas cabezas, ya que en base al modelo propuesto, cada cabeza promovería la inhibición de la actividad βCATENINA, y se necesita la βcatenina para mantener o restaurar todas las estructuras del eje. En cambio, la inhibición de las axinas o APC-1 durante la regeneración bipolar estaría promoviendo el establecimiento del organizador posterior en heridas anteriores y posteriores, pero también la respuesta compensatoria y más rápida de activar el organizador anterior/cerebro ahí donde los niveles preexistentes de βCATENINA son más bajos (postblastema de la herida anterior). En este momento tendríamos dos organizadores posteriores activos en cada herida, y uno anterior/cerebro en el postblastema de la herida anterior que promovería la formación del primordio del cerebro. La acción combinada de estos organizadores y el primordio del cerebro daría lugar a dos gradientes de actividad βCATENINA opuestos y a la formación de dos ejes opuestos compuestos por una cola, una faringe y un primordio del cerebro. Para explicar la aparición del segundo primordio del cerebro (un nuevo mínimo de activación de la βCATENINA) tendría que suponer además: (i) que el primer primordio del cerebro o zona anterior es capaz de antagonizar la reacción de formación de un nuevo organizador y/o cerebro en los tejidos inmediatamente contiguos (Meinhardt, 2008 y 166 Discusión 2009); y/o (ii) que la zona anterior a la faringe (p.ej. el esófago) antagoniza la activación de la βCATENINA. Dado que el desarrollo subsecuente del cerebro/cabeza necesita bajos niveles de βCATENINA, los ejes inducidos tras sobre-activar la βCATENINA son incompletos anteriormente. 167 Modelo del papel de la vía Wnt/bcatenina en la formación del eje AP CONCLUSIONES   Las conclusiones principales de esta tesis doctoral son: 1. La planaria Schmidtea mediterrana posee al menos dos ortólogos de la ßcatenina subfuncionalizados: (i) Smed-ßcatenin-1 tiene la función de señalización conservada como co- activador transcripcional de la vía Wnt/ßcatenina (ii) Smed-ßcatenin-2 ha retenido posiblemente la función de adhesión celular. Esta subfuncionalización de Smed-ßcatenin-2 ha sido demostrada posteriormente por otros autores. 2. Schmidtea mediterrana posee al menos dos ortólogos de la axina (Smed-axinA y Smed-axinB) con la función conservada de inhibir la vía Wnt/ßcatenina. (i) La expresión de Smed-axinB está regulada directa- o indirectamente por SMED-ßCATENINA-1. Por tanto, Smed-axinB es un gen reportero de la actividad SMED-ßCATENINA-1, y entre otras aspectos, indica un gradiente postero- anterior de actividad SMED-ßCATENINA-1 en planarias adultas. 3. La vía Wnt/ßcatenina es necesaria y suficiente para restablecer la polaridad regenerativa en la planaria Schmidtea mediterrana. (i) La vía Wnt/ßcatenina restablece la polaridad regenerativa sujeta a un mecanismo basado en gradientes de señalización preexistentes. (ii) Los mecanismos que determinan la polaridad inicial del sistema nervioso actúan indistintamente de la polaridad que adopte el blastema tras manipular la vía Wnt/ßcatenina. 4. La vía Wnt/ßcatenina es esencial para restaurar todas las estructuras del eje AP durante la regeneración de la planaria Schmidtea mediterrana: (i) promueve la formación de la cola. (ii) antagoniza el desarrollo del cerebro y la cabeza. (iii) es necesaria para restaurar el eje AP, y suficiente para inducir la formación de ejes AP incompletos de manera auto-reguladora. 171 5. La vía Wnt/ßcatenina es necesaria para mantener todas las estructuras posteriores a la cabeza , y por extensión, todo el eje AP durante la homeostasis de planarias. En conjunto, todos estos datos obtenidos en planarias respaldan la conservación de la vía Wnt/ßcatenina en la formación del eje AP en diferentes contextos del desarrollo de los metazoos.       172 BIBLIOGRAFÍA 173 174 A Adams, D. S., Masi, A. and Levin, M. (2007). H+ pump-dependent changes in membrane voltage are an early mechanism necessary and sufficient to induce Xenopus tail regeneration. Development 134, 1323-35. Adell, T., Cebria, F. and Salo, E. (2010). Gradients in planarian regeneration and homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a000505. Adell, T., Marsal, M. and Salo, E. (2008). Planarian GSK3s are involved in neural regeneration. Dev Genes Evol 218, 89-103. Adell, T., Salo, E., Boutros, M. and Bartscherer, K. (2009). Smed-Evi/Wntless is required for beta-catenin-dependent and -independent processes during planarian regeneration. Development 136, 905-10. Agata, K. (2003). Regeneration and gene regulation in planarians. Current Opinion in Genetics & Development 13, 492-496. Agata, K., Saito, Y. and Nakajima, E. (2007). Unifying principles of regeneration I: Epimorphosis versus morphallaxis. Dev Growth Differ 49, 73-8. Agata, K., Tanaka, T., Kobayashi, C., Kato, K. and Saitoh, Y. (2003). Intercalary regeneration in planarians. Dev Dyn 226, 308-16. Agata, K. and Umesono, Y. (2008). Brain regeneration from pluripotent stem cells in planarian. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 363, 2071-8. Agathon, A., Thisse, C. and Thisse, B. (2003). The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature 424, 448-52. Allman, J. A. (1864). Report of the present state of our knowledge of the reproductive system in the Hydroida. Report of the 33rd Meeting of the British Association. Almuedo-Castillo, M., Crespo-Yanez, X., Seebeck, F., Bartscherer, K., Salo, E. and Adell, T. (2014). JNK controls the onset of mitosis in planarian stem cells and triggers apoptotic cell death required for regeneration and remodeling. PLoS Genet 10, e1004400. Almuedo-Castillo, M., Salo, E. and Adell, T. (2011). Dishevelled is essential for neural connectivity and planar cell polarity in planarians. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2813-8. Almuedo-Castillo, M., Sureda-Gomez, M. and Adell, T. (2012). Wnt signaling in planarians: new answers to old questions. Int J Dev Biol 56, 53-65. Angerer, L. M. and Angerer, R. C. (2000). Animal-vegetal axis patterning mechanisms in the early sea urchin embryo. Dev Biol 218, 1-12. Angerer, L. M., Yaguchi, S., Angerer, R. C. and Burke, R. D. (2011). The evolution of nervous system patterning: insights from sea urchin development. Development 138, 3613-23. Aulehla, A., Wiegraebe, W., Baubet, V., Wahl, M. B., Deng, C., Taketo, M., Lewandoski, M. and Pourquie, O. (2008). A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nat Cell Biol 10, 186-93. B Baguna, J. (2012). The planarian neoblast: the rambling history of its origin and some current black boxes. Int J Dev Biol 56, 19-37. Baguñà, J. (1976). Mitosis in the intact and regenerating planarianDugesia mediterranea n.sp. II. Mitotic studies during regeneration, and a possible mechanism of blastema formation. Journal of Experimental Zoology 195, 65-79. Baguñà, J. and Ballester, R. (1978). The nervous system in planarians: Peripheral and Gastrodermal plexuses,pharynx innervation, and the relationship between central nervous system structure and the Acoelomate organization. 175 Baguñà, J. and Romero, R. (1981). Quantitative analysis of cell types during growth, degrowth and regeneration in the planarians Dugesia mediterranea and Dugesia tigrina. Hydrobiologia 84, 181-194. Baguñà, J., Saló, E. and Auladell, C. (1989a). Regeneration and pattern formation in planarians. III. Evidence that neoblasts are totipotent stem cells and the source of blastema cells. Development 107, 77-86. Baguñà, J., Saló, E. and Romero, R. (1989b). Effects of activators and antagonists of the neuropeptides substance P and substance K on cell proliferation in planarians. Int J Dev Biol 33, 261-6. Baguña, J., Salo, E., Romero, R., Garcia-Fernandez, J., Bueno, D., Muñoz-marmol, A., Bayascas, J. R. and Casali, A. (1994). Regeneration and Pattern Formation in Planarians:Cells, Molecules and Genes. Zoological Science 11. Bao, R., Fischer, T., Bolognesi, R., Brown, S. J. and Friedrich, M. (2012). Parallel duplication and partial subfunctionalization of beta-catenin/armadillo during insect evolution. Mol Biol Evol 29, 647-62. Bardeen, C. and Baetjer, F. H. (1904). The inhibitive action of the Roentgen rays on regeneration in planarians. . J. Exp. Zool. Bayascas, J. R., Castillo, E., Muñoz-Mármol, A. M., Baguñà, J. and Saló, E. (1998). Synchronous and early activation of planarian Hox genes and the re-specification of body axes during regeneration in Dugesia (G.) tigrina (Turbellaria; Tricladida). Hydrobiologia 383, 125-130. Beane, W. S., Morokuma, J., Adams, D. S. and Levin, M. (2011). A chemical genetics approach reveals H,K-ATPase-mediated membrane voltage is required for planarian head regeneration. Chem Biol 18, 77-89. Bely, A. E. and Nyberg, K. G. (2010). Evolution of animal regeneration: re-emergence of a field. Trends Ecol Evol 25, 161-70. Benazzi, M., Baguná, J., Ballester, R., Puccinelli, I. and Papa, R. D. (1975). Further Contribution to the Taxonomy of the «Dugesia Lugubris-Polychroa Group» with Description ofDugesia MediterraneaN.SP. (Tricladida, Paludicola). Bolletino di zoologia 42, 81-89. Blassberg, R. A., Felix, D. A., Tejada-Romero, B. and Aboobaker, A. A. (2013). PBX/extradenticle is required to re-establish axial structures and polarity during planarian regeneration. Development 140, 730-9. Bode, H. R. (2009). Axial patterning in hydra. Cold Spring Harb Perspect Biol 1, a000463. Bolognesi, R., Farzana, L., Fischer, T. D. and Brown, S. J. (2008). Multiple Wnt genes are required for segmentation in the short-germ embryo of Tribolium castaneum. Curr Biol 18, 1624-9. Brockes, J. P. (1997). Amphibian limb regeneration: rebuilding a complex structure. Science 276, 81-7. Brockes, J. P. and Kumar, A. (2008). Comparative aspects of animal regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol 24, 525-49. Brøndsted, H. (1954). Planarian regeneration. Pergamon,Oxford. Brøndsted, H. (1969). Planarian regeneration. Pergamon,Oxford. Broun, M., Gee, L., Reinhardt, B. and Bode, H. R. (2005). Formation of the head organizer in hydra involves the canonical Wnt pathway. Development 132, 2907-16. Burton, P. M. and Finnerty, J. R. (2009). Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol 219, 79-87. 176 C Cadigan, K. M. and Waterman, M. L. (2012). TCF/LEFs and Wnt signaling in the nucleus. Cold Spring Harb Perspect Biol 4. Carranza, S., Baguna, J. and Riutort, M. (1997). Are the Platyhelminthes a monophyletic primitive group? An assessment using 18S rDNA sequences. Mol Biol Evol 14, 485-97. Cebria, F. (2007). Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol 217, 733-48. Cebria, F. (2008). Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: an immunocytochemical study. Neurosci Res 61, 375-84. Cebria, F., Kobayashi, C., Umesono, Y., Nakazawa, M., Mineta, K., Ikeo, K., Gojobori, T., Itoh, M., Taira, M., Sanchez Alvarado, A. et al. (2002a). FGFR-related gene nou-darake restricts brain tissues to the head region of planarians. Nature 419, 620-4. Cebria, F., Kudome, T., Nakazawa, M., Mineta, K., Ikeo, K., Gojobori, T. and Agata, K. (2002b). The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mech Dev 116, 199-204. Cebria, F., Nakazawa, M., Mineta, K., Ikeo, K., Gojobori, T. and Agata, K. (2002c). Dissecting planarian central nervous system regeneration by the expression of neural- specific genes. Dev Growth Differ 44, 135-46. Cebria, F. and Romero, R. (2001). Muscle Body-wall mucle restoration dynacmis are different in dorsal and ventral blastemas during planariasn regeneration. Belgian Journal of Zoology 131. Chai, G., Ma, C., Bao, K., Zheng, L., Wang, X., Sun, Z., Salo, E., Adell, T. and Wu, W. (2010). Complete functional segregation of planarian beta-catenin-1 and -2 in mediating Wnt signaling and cell adhesion. J Biol Chem 285, 24120-30. Chandebois, R. (1976). Cell sociology: a way of reconsidering the current concepts of morphogenesis. Acta Biotheor 25, 71-102. Chandebois, R. (1980). The dynamcs of wound closure and its role in the programming of planarian regeneration. II-Distalization. Development,Growth &Differentiation. Chia, I. V. and Costantini, F. (2005). Mouse axin and axin2/conductin proteins are functionally equivalent in vivo. Mol Cell Biol 25, 4371-6. Child, C. (1911). Studies on the dynamics of morphogenesis and inheritance in experimental reproduction. I The axial gradient in Planaria dorotocephala as a limiting factor in regulation. J Exp Zool 10, 265–320. Cho, S. J., Valles, Y., Giani, V. C., Jr., Seaver, E. C. and Weisblat, D. A. (2010). Evolutionary dynamics of the wnt gene family: a lophotrochozoan perspective. Mol Biol Evol 27, 1645-58. Clevers, H. and Nusse, R. (2012). Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell 149, 1192-205. Cowles, M. W., Brown, D. D., Nisperos, S. V., Stanley, B. N., Pearson, B. J. and Zayas, R. M. (2013). Genome-wide analysis of the bHLH gene family in planarians identifies factors required for adult neurogenesis and neuronal regeneration. Development 140, 4691-702. Croce, J. C. and McClay, D. R. (2006). The canonical Wnt pathway in embryonic axis polarity. Semin Cell Dev Biol 17, 168-74. Croce, J. C. and McClay, D. R. (2008). Evolution of the Wnt pathways. Methods Mol Biol 469, 3-18. Currie, K. W. and Pearson, B. J. (2013). Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development 140, 3577-88. 177 Bibliografía D De Robertis, E. M. (2006). Spemann's organizer and self-regulation in amphibian embryos. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 296-302. De Robertis, E. M. (2009). Spemann's organizer and the self-regulation of embryonic fields. Mech Dev 126, 925-41. De Robertis, E. M. and Kuroda, H. (2004). Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 285-308. Demilly, A., Steinmetz, P., Gazave, E., Marchand, L. and Vervoort, M. (2013). Involvement of the Wnt/beta-catenin pathway in neurectoderm architecture in Platynereis dumerilii. Nat Commun 4, 1915. Duboc, V., Lapraz, F., Besnardeau, L. and Lepage, T. (2008). Lefty acts as an essential modulator of Nodal activity during sea urchin oral-aboral axis formation. Dev Biol 320, 49-59. Dubois, F. (1949). Contribution àl’étude de la migration des cellules de régénération chez les Planaires dulcicoles. . Bull. Biol. Fr.Belg. 83. E Egger, B., Gschwentner, R. and Rieger, R. (2007). Free-living flatworms under the knife: past and present. Dev Genes Evol 217, 89-104. Eisenhoffer, G. T., Kang, H. and Sanchez Alvarado, A. (2008). Molecular analysis of stem cells and their descendants during cell turnover and regeneration in the planarian Schmidtea mediterranea. Cell Stem Cell 3, 327-39. Eivers, E., Demagny, H. and De Robertis, E. M. (2009). Integration of BMP and Wnt signaling via vertebrate Smad1/5/8 and Drosophila Mad. Cytokine Growth Factor Rev 20, 357-65. Elkouby, Y. and Frank, D. (2010). Wnt/Bcatenin Signaling in vertebrate posterior nerual development. Dev Biol Book. Evans, D. J., Owlarn, S., Tejada Romero, B., Chen, C. and Aboobaker, A. A. (2011). Combining classical and molecular approaches elaborates on the complexity of mechanisms underpinning anterior regeneration. PLoS One 6, e27927. F Felix, D. A. and Aboobaker, A. A. (2010). The TALE class homeobox gene Smed-prep defines the anterior compartment for head regeneration. PLoS Genet 6, e1000915. Fraguas, S., Barberan, S., Iglesias, M., Rodriguez-Esteban, G. and Cebria, F. (2014). egr-4, a target of EGFR signaling, is required for the formation of the brain primordia and head regeneration in planarians. Development 141, 1835-47. Fu, J., Posnien, N., Bolognesi, R., Fischer, T. D., Rayl, P., Oberhofer, G., Kitzmann, P., Brown, S. J. and Bucher, G. (2012). Asymmetrically expressed axin required for anterior development in Tribolium. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 7782-6. Garcia-Fernandez, J. (2005). The genesis and evolution of homeobox gene clusters. Nat Rev Genet 6, 881-92. Gavino, M. A. and Reddien, P. W. (2011). A Bmp/Admp regulatory circuit controls maintenance and regeneration of dorsal-ventral polarity in planarians. Curr Biol 21, 294- 9. Gavino, M. A., Wenemoser, D., Wang, I. E. and Reddien, P. W. (2013). Tissue absence initiates regeneration through follistatin-mediated inhibition of activin signaling. Elife 2, e00247. 178 Giepmans, B. N. (2004). Gap junctions and connexin-interacting proteins. Cardiovasc Res 62, 233-45. Gierer, A. and Meinhardt, H. (1972). A theory of biological pattern formation. Kybernetik 12, 30-9. Gilbert, S. F. (2013). Developmental biology. University of Helsinki and Swarthmore College. Goldstein, B. and Freeman, G. (1997). Axis specification in animal development. Bioessays 19, 105-16. Gonzalez-Estevez, C., Felix, D. A., Aboobaker, A. A. and Salo, E. (2007). Gtdap-1 promotes autophagy and is required for planarian remodeling during regeneration and starvation. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 13373-8. Gonzalez-Estevez, C., Felix, D. A., Smith, M. D., Paps, J., Morley, S. J., James, V., Sharp, T. V. and Aboobaker, A. A. (2012). SMG-1 and mTORC1 act antagonistically to regulate response to injury and growth in planarians. PLoS Genet 8, e1002619. Gonzalez-Estevez, C. and Salo, E. (2010). Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis 15, 279-92. Guder, C., Philipp, I., Lengfeld, T., Watanabe, H., Hobmayer, B. and Holstein, T. W. (2006a). The Wnt code: cnidarians signal the way. Oncogene 25, 7450-60. Guder, C., Pinho, S., Nacak, T. G., Schmidt, H. A., Hobmayer, B., Niehrs, C. and Holstein, T. W. (2006b). An ancient Wnt-Dickkopf antagonism in Hydra. Development 133, 901-11. Gurley, K. A., Elliott, S. A., Simakov, O., Schmidt, H. A., Holstein, T. W. and Sanchez Alvarado, A. (2010). Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev Biol 347, 24-39. Gurley, K. A., Rink, J. C. and Sanchez Alvarado, A. (2008). Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science 319, 323-7. H Handberg-Thorsager, M., Fernandez, E. and Salo, E. (2008). Stem cells and regeneration in planarians. Front Biosci 13, 6374-94. Hayashi, T., Motoishi, M., Yazawa, S., Itomi, K., Tanegashima, C., Nishimura, O., Agata, K. and Tarui, H. (2011). A LIM-homeobox gene is required for differentiation of Wnt-expressing cells at the posterior end of the planarian body. Development 138, 3679- 88. Henry, J. Q., Perry, K. J. and Martindale, M. Q. (2010). beta-catenin and early development in the gastropod, Crepidula fornicata. Integr Comp Biol 50, 707-19. Hobmayer, B., Rentzsch, F., Kuhn, K., Happel, C. M., von Laue, C. C., Snyder, P., Rothbacher, U. and Holstein, T. W. (2000). WNT signalling molecules act in axis formation in the diploblastic metazoan Hydra. Nature 407, 186-9. Holland, L. Z. (2000). Body-plan evolution in the Bilateria: early antero-posterior patterning and the deuterostome-protostome dichotomy. Curr Opin Genet Dev 10, 434- 42. Holland, L. Z. (2002). Heads or tails? Amphioxus and the evolution of anterior-posterior patterning in deuterostomes. Dev Biol 241, 209-28. Holstein, T. W. (1991). Pattern of Epithelial Cell cycling in Hydra. Hori, I. (1997). Cytological approach to morphogenesis in the planarian blastema. II. The effect of neuropeptides. J Submicrosc Cytol Pathol 29, 91-7. Huang, S., Shetty, P., Robertson, S. M. and Lin, R. (2007). Binary cell fate specification during C. elegans embryogenesis driven by reiterated reciprocal asymmetry of TCF POP-1 and its coactivator beta-catenin SYS-1. Development 134, 2685-95. 179 Bibliografía Huang, Y. L., Anvarian, Z., Doderlein, G., Acebron, S. P. and Niehrs, C. (2015). Maternal Wnt/STOP signaling promotes cell division during early Xenopus embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 5732-7. I Iglesias, M., Almuedo-Castillo, M., Aboobaker, A. A. and Salo, E. (2011). Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/beta-catenin pathway. Dev Biol 358, 68-78. Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Salo, E. and Adell, T. (2008). Silencing of Smed- betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development 135, 1215- 21. J Jackson, B. M. and Eisenmann, D. M. (2012). beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a007948. Jho, E. h., Zhang, T., Domon, C., Joo, C. K., Freund, J. N. and Costantini, F. (2002). Wnt/ -Catenin/Tcf Signaling Induces the Transcription of Axin2, a Negative Regulator of the Signaling Pathway. Molecular and Cellular Biology 22, 1172-1183. K Kato, K., Orii, H., Watanabe, K. and Agata, K. (2001). Dorsal and ventral positional cues required for the onset of planarian regeneration may reside in differentiated cells. Dev Biol 233, 109-21. Kawakami, Y., Rodriguez Esteban, C., Raya, M., Kawakami, H., Marti, M., Dubova, I. and Izpisua Belmonte, J. C. (2006). Wnt/beta-catenin signaling regulates vertebrate limb regeneration. Genes Dev 20, 3232-7. Kelly, C., Chin, A., Leatherman, J., Kozlowsi, D. and Weinberg, E. (2000). Maternally controlled bcatenin-mediated signalling is requires for organizer formation in zebrafish. Development 127. Kenny, A. P., Oleksyn, D. W., Newman, L. A., Angerer, R. C. and Angerer, L. M. (2003). Tight regulation of SpSoxB factors is required for patterning and morphogenesis in sea urchin embryos. Developmental Biology 261, 412-425. Kiecker, C. and Niehrs, C. (2000). The Role of Wnt Signaling in Vertebrate Head Induction and the Organizer-Gradient Model Dualism. Madame Curie Bioscience Database Austin (TX): Landes Bioscience. Kiecker, C. and Niehrs, C. (2001). A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. Development 128, 4189-201. Kobayashi, C., Kobayashi, S., Orii, H., Watanabe, K. and Agata, K. (1998). Identification of two distinct muscles in the planarian Dugesia japonica by their expression of myosin heavy chain genes. Zoolog. Sci. Zoolog Sci 15, 861-869. Kobayashi, C., Saito, Y., Ogawa, K. and Agata, K. (2007). Wnt signaling is required for antero-posterior patterning of the planarian brain. Dev Biol 306, 714-24. Kohn, A. D. and Moon, R. T. (2005). Wnt and calcium signaling: beta-catenin- independent pathways. Cell Calcium 38, 439-46. Korswagen, H. C. (2002). Canonical and non-canonical Wnt signaling pathways in Caenorhabditis elegans: variations on a common signaling theme. Bioessays 24, 801- 10. 180 Korswagen, H. C., Coudreuse, D. Y., Betist, M. C., van de Water, S., Zivkovic, D. and Clevers, H. C. (2002). The Axin-like protein PRY-1 is a negative regulator of a canonical Wnt pathway in C. elegans. Genes Dev 16, 1291-302. Kraus, Y., Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G. and Technau, U. (2007). The blastoporal organiser of a sea anemone. Curr Biol 17, R874-6. Kuroda, H., Wessely, O. and De Robertis, E. M. (2004). Neural induction in Xenopus: requirement for ectodermal and endomesodermal signals via Chordin, Noggin, beta- Catenin, and Cerberus. PLoS Biol 2, E92. L Lambert, J. D. (2010). Developmental patterns in spiralian embryos. Curr Biol 20, R72- 7. Lange, C. S. and Steele, V. E. (1978). The mechanism of anterior-posterior polarity control in planarians. Differentiation 11, 1-12. Lapan, S. W. and Reddien, P. W. (2011). dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet 7, e1002226. Lee, P. N., Pang, K., Matus, D. Q. and Martindale, M. Q. (2006). A WNT of things to come: evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians. Semin Cell Dev Biol 17, 157- 67. Lender, T. (1956). L’inhibition de la re´ge´ne´ration du cervau des planaries Polycelis nigra (Ehr.) et Dugesia lugubris (O. Schm.) en pre´sence de broyats de teˆtes ou de queues. Bull Soc Zool Fr 81. Lender, T. (1960). The specific inhibition of the differentiation of the brain of freshwater planarians during regeneration. J Embryol Exp Morphol. Lengfeld, T., Watanabe, H., Simakov, O., Lindgens, D., Gee, L., Law, L., Schmidt, H. A., Ozbek, S., Bode, H. and Holstein, T. W. (2009). Multiple Wnts are involved in Hydra organizer formation and regeneration. Dev Biol 330, 186-99. Liu, J., Phillips, B. T., Amaya, M. F., Kimble, J. and Xu, W. (2008). The C. elegans SYS-1 protein is a bona fide beta-catenin. Dev Cell 14, 751-61. Lobo, D., Beane, W. S. and Levin, M. (2012). Modeling planarian regeneration: a primer for reverse-engineering the worm. PLoS Comput Biol 8, e1002481. Logan, C. Y. and Nusse, R. (2004). The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 781-810. Lu, F. I., Thisse, C. and Thisse, B. (2011). Identification and mechanism of regulation of the zebrafish dorsal determinant. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 15876-80. Luo, W. and Lin, S. C. (2004). Axin: a master scaffold for multiple signaling pathways. Neurosignals 13, 99-113. M MacDonald, B. T., Tamai, K. and He, X. (2009). Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell 17, 9-26. Marlow, F., Gonzalez, E. M., Yin, C., Rojo, C. and Solnica-Krezel, L. (2004). No tail co-operates with non-canonical Wnt signaling to regulate posterior body morphogenesis in zebrafish. Development 131, 203-16. Marlow, H., Matus, D. Q. and Martindale, M. Q. (2013). Ectopic activation of the canonical wnt signaling pathway affects ectodermal patterning along the primary axis during larval development in the anthozoan Nematostella vectensis. Dev Biol 380, 324- 34. 181 Bibliografía Marsal, M. (2005 - Tesis Doctoral). Caracterització funcional d'elements conservats de la via Wnt en la regeneració cefàlica de planàries. Tesi doctoral - Universitat de Barcelona. Marsal, M., Pineda, D. and Saló, E. (2003). Gtwnt-5 a member of the wnt family expressed in a subpopulation of the nervous system of the planarian Girardia tigrina. Gene Expression Patterns 3, 489-495. Marsh, G. and Beams, H. W. (1952). Electrical control of morphogenesis in regenerating D. tigrina. J cell comp Physiol. 39. Martin, B. L. and Kimelman, D. (2009). Wnt signaling and the evolution of embryonic posterior development. Curr Biol 19, R215-9. Martindale, M. Q. (2005). The evolution of metazoan axial properties. Nat Rev Genet 6, 917-27. Martindale, M. Q. and Hejnol, A. (2009). A developmental perspective: changes in the position of the blastopore during bilaterian evolution. Dev Cell 17, 162-74. McGregor, A. P., Pechmann, M., Schwager, E. E., Feitosa, N. M., Kruck, S., Aranda, M. and Damen, W. G. (2008). Wnt8 is required for growth-zone establishment and development of opisthosomal segments in a spider. Curr Biol 18, 1619-23. Meinhardt, H. (1993). A model for pattern formation of hypostome, tentacles, and foot in hydra: how to form structures close to each other, how to form them at a distance. Dev Biol 157, 321-33. Meinhardt, H. (2008). Models of biological pattern formation: from elementary steps to the organization of embryonic axes. Curr Top Dev Biol 81, 1-63. Meinhardt, H. (2009a). Beta-catenin and axis formation in planarians. Bioessays 31, 5- 9. Meinhardt, H. (2009b). Models for the generation and interpretation of gradients. Cold Spring Harb Perspect Biol 1, a001362. Miyawaki, K., Mito, T., Sarashina, I., Zhang, H., Shinmyo, Y., Ohuchi, H. and Noji, S. (2004). Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mech Dev 121, 119-30. Molina, M. D. (2011 - Tesis Doctoral). Estudio funcional de la vía BMP en la especificación del eje dorsoventral durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea. Tesi doctoral - Universitat de Barcelona. Facultat de Biologia. Departament de Genètica. Molina, M. D., Neto, A., Maeso, I., Gomez-Skarmeta, J. L., Salo, E. and Cebria, F. (2011). Noggin and noggin-like genes control dorsoventral axis regeneration in planarians. Curr Biol 21, 300-5. Momose, T., Derelle, R. and Houliston, E. (2008). A maternally localised Wnt ligand required for axial patterning in the cnidarian Clytia hemisphaerica. Development 135, 2105-13. Morgan, T. H. (1898). Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwickelungsmech Org 7, 364-397. Morgan, T. H. (1901). Regeneration in the egg, embryo, and adult The American Naturalilst. Morgan, T. H. (1904). An Analysis of the Phenomena of Organic 'Polarity.'. Science 20, 742-8. Morgan, T. H. (1905). “Polarity” considered as a phenomenon of gradation of materials. J Exp Zool 2, 495-506. 182 N Nelson, W. J. and Nusse, R. (2004). Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science 303, 1483-7. Newmark, P. A. and Sanchez Alvarado, A. (2002). Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet 3, 210-9. Niehrs, C. (1999). Head in the WNT: the molecular nature of Spemann's head organizer. Trends Genet 15, 314-9. Niehrs, C. (2004). Regionally specific induction by the Spemann-Mangold organizer. Nat Rev Genet 5, 425-34. Niehrs, C. (2010). On growth and form: a Cartesian coordinate system of Wnt and BMP signaling specifies bilaterian body axes. Development 137, 845-57. Nieuwkoop, P. D. (1973). The organization center of the amphibian embryo: its origin, spatial organization, and morphogenetic action. Adv. morphogenesis 10, 1-39. Nogi, T. and Levin, M. (2005). Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol 287, 314-35. Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D. and Marchant, J. S. (2009). A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis 3, e464. Nusse, R. (2008). Wnt signaling and stem cell control. Cell Res 18, 523-7. O Oberhofer, G., Grossmann, D., Siemanowski, J. L., Beissbarth, T. and Bucher, G. (2014). Wnt/beta-catenin signaling integrates patterning and metabolism of the insect growth zone. Development 141, 4740-50. Oosterveen, T., Coudreuse, D. Y., Yang, P. T., Fraser, E., Bergsma, J., Dale, T. C. and Korswagen, H. C. (2007). Two functionally distinct Axin-like proteins regulate canonical Wnt signaling in C. elegans. Dev Biol 308, 438-48. Orii, H., Kato, K., Umesono, Y., Sakurai, T., Agata, K. and Watanabe, K. (1999). The planarian HOM/HOX homeobox genes (Plox) expressed along the anteroposterior axis. Dev Biol 210, 456-68. Oviedo, N. J. and Levin, M. (2007). smedinx-11 is a planarian stem cell gap junction gene required for regeneration and homeostasis. Development 134, 3121-31. Oviedo, N. J., Morokuma, J., Walentek, P., Kema, I. P., Gu, M. B., Ahn, J. M., Hwang, J. S., Gojobori, T. and Levin, M. (2010). Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol 339, 188- 99. P Pallas, P. (1766). Miscellanea zoologica, quibus novae imprimis atque obscurae animalium species. Hagae Comitum, apud Pterum van Cleef, Holland. Pani, A. M., Mullarkey, E. E., Aronowicz, J., Assimacopoulos, S., Grove, E. A. and Lowe, C. J. (2012). Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature 483, 289-94. Pellettieri, J., Fitzgerald, P., Watanabe, S., Mancuso, J., Green, D. R. and Sanchez Alvarado, A. (2010). Cell death and tissue remodeling in planarian regeneration. Dev Biol 338, 76-85. 183 Bibliografía Pellettieri, J. and Sanchez Alvarado, A. (2007). Cell turnover and adult tissue homeostasis: from humans to planarians. Annu Rev Genet 41, 83-105. Petersen, C. P. and Reddien, P. W. (2008). Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science 319, 327-30. Petersen, C. P. and Reddien, P. W. (2009a). Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell 139, 1056-68. Petersen, C. P. and Reddien, P. W. (2009b). A wound-induced Wnt expression program controls planarian regeneration polarity. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 17061- 6. Petersen, C. P. and Reddien, P. W. (2011). Polarized notum activation at wounds inhibits Wnt function to promote planarian head regeneration. Science 332, 852-5. Philipp, I., Aufschnaiter, R., Ozbek, S., Pontasch, S., Jenewein, M., Watanabe, H., Rentzsch, F., Holstein, T. W. and Hobmayer, B. (2009). Wnt/beta-catenin and noncanonical Wnt signaling interact in tissue evagination in the simple eumetazoan Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4290-5. Popperl, H., Schmidt, C., Wilson, V., Hume, C. R., Dodd, J., Krumlauf, R. and Beddington, R. S. (1997). Misexpression of Cwnt8C in the mouse induces an ectopic embryonic axis and causes a truncation of the anterior neuroectoderm. Development 124, 2997-3005. Poss, K. D. (2010). Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet 11, 710-22. R Randalph, H. (1897). Observations and experiments on regeneration in planarians. Arch. Entwm. Org. 5. Range, R. (2014). Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis 52, 222-34. Range, R. C., Angerer, R. C. and Angerer, L. M. (2013). Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior- posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol 11, e1001467. Reddien, P. W. (2013). Specialized progenitors and regeneration. Development 140, 951-7. Reuter, M. and Kreshchenko, N. (2004). Flatworm asexual multiplication implicates stem cells and regeneration. Canadian Journal of Zoology 82, 334-356. Reuter, M., Sheiman, I., Gustafsson, M., Halton, D., Maule, A. and Shaw, C. (1996). Development of the nervous system in Dugesia tigrina during regeneration after fissioning and decapitation. J invertebr. Repr. 29, 199-211. Reversade, B. and De Robertis, E. M. (2005). Regulation of ADMP and BMP2/4/7 at opposite embryonic poles generates a self-regulating morphogenetic field. Cell 123, 1147-60. Reya, T. and Clevers, H. (2005). Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434, 843-50. Riddiford, N. and Olson, P. D. (2011). Wnt gene loss in flatworms. Dev Genes Evol 221, 187-97. Rinaldi, F., Hartfield, E. M., Crompton, L. A., Badger, J. L., Glover, C. P., Kelly, C. M., Rosser, A. E., Uney, J. B. and Caldwell, M. A. (2014). Cross-regulation of Connexin43 and beta-catenin influences differentiation of human neural progenitor cells. Cell Death Dis 5, e1017. Ring, A., Kim, Y. M. and Kahn, M. (2014). Wnt/catenin signaling in adult stem cell physiology and disease. Stem Cell Rev 10, 512-25. 184 Rink, J. C., Gurley, K. A., Elliott, S. A. and Sanchez Alvarado, A. (2009). Planarian Hh signaling regulates regeneration polarity and links Hh pathway evolution to cilia. Science 326, 1406-10. Roberts-Galbraith, R. and Newmark, P. A. (2012). Follistatin antagonizes Activin signaling and acts with Notum to direct planarian head regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. Rogdestvenskaya, Z., Tiras, K., Srebnitskaya, L. and Lednev, V. (2001). Modulation of regeneration of planarians Dugesia tigrina (Platyhelminthes, Tricladida) by weak combined magnetic field,. Belgian Journal of Zoology. Rogers, K. W. and Schier, A. F. (2011). Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annu Rev Cell Dev Biol 27, 377-407. Rottinger, E., Dahlin, P. and Martindale, M. Q. (2012). A framework for the establishment of a cnidarian gene regulatory network for "endomesoderm" specification: the inputs of ss-catenin/TCF signaling. PLoS Genet 8, e1003164. Ruiz-Trillo, I., Paps, J., Loukota, M., Ribera, C., Jondelius, U., Baguna, J. and Riutort, M. (2002). A phylogenetic analysis of myosin heavy chain type II sequences corroborates that Acoela and Nemertodermatida are basal bilaterians. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11246-51. Ryan, J. F. and Baxevanis, A. D. (2007). Hox, Wnt, and the evolution of the primary body axis: insights from the early-divergent phyla. Biol Direct 2, 37. S Salo, E. (2006). The power of regeneration and the stem-cell kingdom: freshwater planarians (Platyhelminthes). Bioessays 28, 546-59. Saló, E. (1978 - Tesis Doctoral). Gradients axials de regeneració a planaries : relacions amb la proliferació i la formació del sistema nerviós Tesi doctoral - Universitat de Barcelona. Salo, E. and Baguna, J. (1984). Regeneration and pattern formation in planarians. I. The pattern of mitosis in anterior and posterior regeneration in Dugesia (G) tigrina, and a new proposal for blastema formation. J Embryol Exp Morphol 83, 63-80. Salo, E. and Baguna, J. (2002). Regeneration in planarians and other worms: New findings, new tools, and new perspectives. J Exp Zool 292, 528-39. Saló, E. and Baguñà, J. (1985). Proximal and distal transformation during intercalary regeneration in the planarian Dugesia (S) mediterranea. Salvetti, A., Rossi, L., Bonuccelli, L., Lena, A., Pugliesi, C., Rainaldi, G., Evangelista, M. and Gremigni, V. (2009). Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev Biol 328, 305-14. Schilt, J. (1970). Induction expèrimentaled’excroissances par des greffes hétéropolaires chez la planaire Dugesia lugubris O. Schimdt. Ann Embryol. Morphogenet 3, 93-106. Schneider, S. Q. and Bowerman, B. (2007). beta-Catenin asymmetries after all animal/vegetal- oriented cell divisions in Platynereis dumerilii embryos mediate binary cell-fate specification. Dev Cell 13, 73-86. Schneider, S. Q., Finnerty, J. R. and Martindale, M. Q. (2003). Protein Evolution: Structure-Function Relationships of the Oncogene Beta-Catenin in the Evolution of Multicellular Animals. Journal of Experimental Zoology. Schubert, M., Holland, L. Z., Stokes, M. D. and Holland, N. D. (2001). Three amphioxus Wnt genes (AmphiWnt3, AmphiWnt5, and AmphiWnt6) associated with the tail bud: the evolution of somitogenesis in chordates. Dev Biol 240, 262-73. Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W. and Reddien, P. W. (2014a). Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports 3, 339-52. 185 Bibliografía Scimone, M. L., Lapan, S. W. and Reddien, P. W. (2014b). A forkhead transcription factor is wound-induced at the planarian midline and required for anterior pole regeneration. PLoS Genet 10, e1003999. Silhankova, M. and Korswagen, H. C. (2007). Migration of neuronal cells along the anterior-posterior body axis of C. elegans: Wnts are in control. Curr Opin Genet Dev 17, 320-5. Sivickis, P. (1931). A quantitative study of regeneration along the main axis of the triclad body. Arch Zool Ital 16, 430-449. Spemann, H. and Mangold, H. (1924). Induction of embryonic primordial by implantation of organizers from a different species. Roux’s Arch. Entw. Mech. 100. Stewart, S., Rojas-Munoz, A. and Izpisua Belmonte, J. C. (2007). Bioelectricity and epimorphic regeneration. Bioessays 29, 1133-7. Sugimura, R. and Li, L. (2010). Noncanonical Wnt signaling in vertebrate development, stem cells, and diseases. Birth Defects Res C Embryo Today 90, 243-56. T Tabata, T. and Takei, Y. (2004). Morphogens, their identification and regulation. Development 131, 703-12. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A. and McMahon, A. P. (1994). Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes Dev 8, 174-89. Technau, U., Cramer von Laue, C., Rentzsch, F., Luft, S., Hobmayer, B., Bode, H. R. and Holstein, T. W. (2000). Parameters of self-organization in Hydra aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12127-31. Turing, A. M. (1952). The Chemical Basis of Morphogenesis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 237, 37-72. U Umesono, Y., Tasaki, J., Nishimura, K., Inoue, T. and Agata, K. (2011). Regeneration in an evolutionarily primitive brain--the planarian Dugesia japonica model. Eur J Neurosci 34, 863-9. Umesono, Y., Tasaki, J., Nishimura, Y., Hrouda, M., Kawaguchi, E., Yazawa, S., Nishimura, O., Hosoda, K., Inoue, T. and Agata, K. (2013). The molecular logic for planarian regeneration along the anterior-posterior axis. Nature 500, 73-6. Umesono, Y., Watanabe, K. and Agata, K. (1997). A planarian orthopedia homolog is specifically expressed in the branch region of both the mature and regenerating brain. Dev Growth Differ 39, 723-7. Umesono, Y., Watanabe, K. and Agata, K. (1999). Distinct structural domains in the planarian brain defined by the expression of evolutionarily conserved homeobox genes. Dev Genes Evol 209, 31-9. V van Amerongen, R. and Nusse, R. (2009). Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Development 136, 3205-14. 186 Vasquez-Doorman, C. and Petersen, C. P. (2014). zic-1 Expression in Planarian neoblasts after injury controls anterior pole regeneration. PLoS Genet 10, e1004452. Vogg, M. C., Owlarn, S., Perez Rico, Y. A., Xie, J., Suzuki, Y., Gentile, L., Wu, W. and Bartscherer, K. (2014). Stem cell-dependent formation of a functional anterior regeneration pole in planarians requires Zic and Forkhead transcription factors. Dev Biol 390, 136-48. W Wagner, D. E., Wang, I. E. and Reddien, P. W. (2011). Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science 332, 811-6. Wei, Z., Yaguchi, J., Yaguchi, S., Angerer, R. C. and Angerer, L. M. (2009). The sea urchin animal pole domain is a Six3-dependent neurogenic patterning center. Development 136, 1179-89. Wenemoser, D. and Reddien, P. W. (2010). Planarian regeneration involves distinct stem cell responses to wounds and tissue absence. Dev Biol 344, 979-91. Wikramanayake, A. H., Brandhorst, B. P. and Klein, W. H. (1995). Autonomous and non-autonomous differentiation of ectoderm in different sea urchin species. Development 121, 1497-505. Wikramanayake, A. H., Huang, L. and Klein, W. (1998). Bcatenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. Witchley, J. N., Mayer, M., Wagner, D. E., Owen, J. H. and Reddien, P. W. (2013). Muscle cells provide instructions for planarian regeneration. Cell Rep 4, 633-41. Wodarz, A. and Nusse, R. (1998). Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu Rev Cell Dev Biol 14, 59-88. Wolff, E. (1962). Regeneration : 20th Growth Symp.The Ronald Press Co., New York. Wolpert, L. (1969). Positional information and the spatial pattern of cellular differentiation. J Theor Biol 25, 1-47. Wolpert, L. (2011). Positional information and patterning revisited. J Theor Biol 269, 359-65. Wolpert, L., Tickle, C., Arias, A. M., Lawrence, P., Lumsden, A., Robertson, E., Meyerowitz, E. and Smith, J. (2015). Principles of development. Oxford University Press. Y Yaguchi, S., Yaguchi, J. and Burke, R. D. (2006). Specification of ectoderm restricts the size of the animal plate and patterns neurogenesis in sea urchin embryos. Development 133, 2337-46. Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H. and Agata, K. (2009). Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 22329-34. Yokoyama, H., Maruoka, T., Ochi, H., Aruga, A., Ohgo, S., Ogino, H. and Tamura, K. (2011). Different requirement for Wnt/beta-catenin signaling in limb regeneration of larval and adult Xenopus. PLoS One 6, e21721. Yu, H. M., Jerchow, B., Sheu, T. J., Liu, B., Costantini, F., Puzas, J. E., Birchmeier, W. and Hsu, W. (2005). The role of Axin2 in calvarial morphogenesis and craniosynostosis. Development 132, 1995-2005. 187 Bibliografía Z Zeng, L., Fagotto, F., Zhang, T., Hsu, W., Vasicek, T. J., Perry, W. L., 3rd, Lee, J. J., Tilghman, S. M., Gumbiner, B. M. and Costantini, F. (1997). The mouse Fused locus encodes Axin, an inhibitor of the Wnt signaling pathway that regulates embryonic axis formation. Cell 90, 181-92. Zhang, D., Chan, J. D., Nogi, T. and Marchant, J. S. (2011). Opposing roles of voltage- gated Ca2+ channels in neuronal control of regenerative patterning. J Neurosci 31, 15983-95. 188 ANEXOS Anexo 1                                               1dx 3inj/d 2dx 3inj/d 3dx 3inj/d Heads 2/5 wild-type 1/5 tailless 2/5 two-headed 8/8 two-headed 1/15 wild-type 14/15 two-headed Trunks 3/5 wild-type 2/5 tailless 5/9 wild-type 4/9 two-headed 1/12 tailless 11/12 two-headed La penetrancia del fenotipo two-headed tras inhibir Smed-βcatenin1 es mayor en cabezas que en troncos regenerantes. Este efecto es más evidente cuanto menor es la dosis de inhibición. 1,2 o 3d x 3inj/d indica que las planarias fueron inyectadas tres veces durante 1, 2 o 3 días consecutivos, respectivamente. El análisis es a nivel morfológico y corresponde a 10dias después de amputar a nivel pre- y post-faríngeo. Estos porcentajes no variaron durante el tiempo analizado (19dias después de amputar). Los controles fueron inyectados con agua (n=5)     191 Anexos Anexo 2                                                                         Patón de expresión de FzA y WntA/wnt11-6 en troncos regenereantes de 12 días tras inhibir Smed-ßcatenin1. WntA marca el cerebro posterior y la faringe proximal. FzA se expresa en el cerebro anterior y la faringe distal. El análisis con estos marcadores del fenotipo two-headed indica que los cerebros (anterior y ectópico) presentan ambos dominios. No obstante, la inhibición de la bcatenina expande el dominio de WntA hacia los tejidos preexistentes. Debajo de cada in situ whole-mount, el mismo individuo con DAPI para visualizar la morfología general del sistema nervioso central. 192 in ta ct in jA in ta ct in jP control axins (-) 35d 23d 23d 23d 66d 35d control control control axins (-) axins (-) axins (-) G pa s sF R P- 1 08 21 _f intact 36dA injA intact 56dA injA intact 38dA injA A B a b c a’ b’ c’ d e f g j k ml h i Anexo 3   Defectos observados en el mantenimiento del eje AP tras inhibir Smed-axins en organismos no-regenerantes (intactos). (A) Imágenes de organismos inyectados en anterior (A) o en posterior (P) a diferentes días (d) tras la inhibición de las axinas. (B) Análisis de animales inyectados en anterior con diferentes marcadores: Gpas, ramas cefálicas; sFRP,parte distal de la cabeza; 0821, marcador de faringe; inmunotinción con anti-synapsin (se muestran diferentes planos de confocal). Experimentos preliminares sugieren que la sobre-activación de la vía Wnt/Bcatenina en organismos intactos afecta la homeostasis del eje AP en diferentes grados: (i) problemas en el mantenimiento de la parte más distal de la cabeza (b-c) y cerebro (Gpas) (e). Sin embargo, no se han detectado problemas en el mantenimiento de sFRP en la punta de la cabeza (dónde se sitúa el organizador anterior) (g). (ii) En la homeostasis de la parte posterior. Los animales tratados parecen tener colas más anchas que un contro (b, b’, e) (iii) formación de bultos o ejes ectópicos asociados con el sitio de la inyección del ARNi (b-c y b’-c’). Estos ejes vienen acompañados por la diferenciación de ojos (c´), o nuevas farínges (k). Asimismo, se han detectado organismos que desdoblan los cordones nerviosos ventrales                                                               193 Anexos                                                                                                                   Anexo 4   Artículo 3 Planarian regeneration: achievements and future directions after 20 years of research. Saló E, Abril JF, Adell T, Cebrià F, Eckelt K, Fernandez-Taboada E, Handberg- Thorsager M, Iglesias M, Molina MD, Rodríguez-Esteban G. International Journal of Developmental Biology, 53:1317-1327 (2009). Factor de Impacto (2009): 2,162                           195 Anexos                                                                                                       Resumen en castellano: Regeneración en planarias: resultados y perspectivas futuras tras veinte años de estudio Las planarias poseen la capacidad de regenerar un nuevo organismo a partir de un pequeño fragmento del animal. No obstante, su plasticidad no tan sólo se refleja en la regeneración. A diferencia del estadio adulto prácticamente invariable de otros animales, las planarias ajustan continuamente su tamaño y crecen o decrecen en función de las condiciones ambientales o su estado nutricional. La extraordinaria plasticidad morfológica de las planarias reside en la presencia en el organismo adulto de una población de células madre pluripotentes, denominadas neoblastos, capaces de diferenciarse en cualquiera de los tipos celulares presentes en el individuo, incluido la línea germinal en los organismos sexuados. En conjunto, todas estas características hacen de estos animales un modelo excelente para analizar fenómenos como la morfogénesis, la restauración del patrón, el control de las proporciones corporales o la homeostasis tisular, así como para investigar los mecanismos involucrados en el mantenimiento y la diferenciación de las células madre durante estos procesos. Hasta hace relativamente poco, los análisis moleculares en planarias no eran posibles. Sin embargo, gracias a la puesta a punto de diversas técnicas, actualmente es posible analizar el fenotipo resultante de la inhibición de su expresión. Además, la secuenciación del genoma de la planaria Schmidtea mediterranea nos ha provisto con las herramientas necesarias para analizar en profundidad la regulación genómica de este modelo. Esta revisión trata de ofrecer una visión general de la planaria como organismo modelo para la investigación de los procesos de desarrollo y regeneración, y describe las nuevas líneas principales de trabajo en esta área.                     197 Anexos   Planarian regeneration: achievements and future directions after 20 years of research EMILI SALÓ*, JOSEP F. ABRIL, TERESA ADELL, FRANCESC CEBRIÀ, KAY ECKELT, ENRIQUE FERNÁNDEZ-TABOADA, METTE HANDBERG-THORSAGER, MARTA IGLESIAS, Mª DOLORES MOLINA and GUSTAVO RODRÍGUEZ-ESTEBAN Departament de Genètica, Facultat de Biologia and Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), Barcelona, Catalunya, Spain ABSTRACT Planarians can undergo dramatic changes in body size and regenerate their entire body plan from small pieces after cutting. This remarkable morphological plasticity has made them an excellent model in which to analyze phenomena such as morphogenesis, restoration of pattern and polarity, control of tissue proportions and tissue homeostasis. They have a unique population of pluripotent stem cells in the adult that can give rise to all differentiated cell types, including the germ cells. These cellular characteristics provide an excellent opportunity to study the mechanisms involved in the maintenance and differentiation of cell populations in intact and regenerating animals. Until recently, the planarian model system lacked opportunities for genetic analysis; however, this handicap was overcome in the last decade through the development of new molecular methods which have been successfully applied to planarians. These techniques have allowed analysis of the temporal and spatial expression of genes, as well as interference with gene function, generating the first phenotypes by loss or gain of function. Finally, the sequencing of the planarian genome has provided the essential tools for an in-depth analysis of the genomic regulation of this model system. In this review, we provide an overview of planarians as a model system for research into development and regeneration and describe new lines of investigation in this area. KEY WORDS: planarian, regeneration, neoblast, germ cell, nervous system, eye, signalling molecule Introduction Freshwater planarians (class Turbellaria; Fig. 1) are free-living members of the phylum Platyhelminthes (the flatworms). Molecu- lar phylogeny locates Platyhelminthes together with annelids and molluscs in the Lophotrochozoan clade (Carranza et al., 1997). They are triploblastic, acoelomate, unsegmented, and dorsoven- trally flattened soft-bodied organisms, without circulatory, respi- ratory, or skeletal structures. A pharynx and a blind gut lacking an anus form the digestive system. A solid mass of tissue, called mesenchyme or parenchyma, fills the space between the epider- mis and the gut (for a recent review, see Saló, 2006). The most peculiar cell type in planarians is a small, round or ovoid undiffer- entiated cell called the neoblast (Fig. 2A). These cells are the only mitotically active cells in planarians (Baguñà, 1981, Baguñà and Romero, 1981) and they differentiate to form all planarian cell types, including the germ line (reviewed in Saló, 2006; Handberg- Int. J. Dev. Biol. 53: 1317-1327 (2009) doi: 10.1387/ijdb.072414es THE INTERNATIONAL JOURNAL OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY www.intjdevbiol.com *Address correspondence to: Emili Saló. Departament de Genètica, Facultat de Biologia and Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), Diagonal 645, 08028 Barcelona, Catalunya, Spain. e-mail: esalo@ub.edu. Web: http://planarian.bio.ub.es/ Final author-corrected PDF published online: 23rd April 2008. ISSN: Online 1696-3547, Print 0214-6282 © 2008 UBC Press Printed in Spain Thorsager et al., 2008). Such unique cell behaviour endows planarians with a remarkable morphological plasticity through which the animal can regenerate from almost any body piece and change its adult size according to availability of food. When a planarian is cut, the wound epithelium contracts and a thin film of old epidermis covers it in less than an hour (Fig. 2B) (Baguñà et al., 1988). Below the wound epithelium, groups of undifferentiated cells produced by proliferation in the underlying old parenchyma aggregate to produce a new undifferentiated and non-pigmented new tissue called the blastema, which will grow and differentiate to replace the most distal structures (Fig. 2). The rest of the old tissue readapts to the reduced proportions by cell death, cell proliferation and differentiation. In contrast to other higher organ- isms, which display a unique developmental process to reach a final adult size, planarians can withstand long periods of starva- tion without any alteration of their functionality. They shrink from their adult size to their initial size at hatching, and even beyond it. 199 1318 E. Saló et al. More surprisingly, when food is given again, they grow to an adult size without impairment of their physiological capacities. In recent years, a handful of reviews have been published in which these phenomena are further described (Agata and Watanabe, 1999, Baguñà et al., 1994, Newmark and Sánchez-Alvarado, 2002, Reddien and Sánchez-Alvarado, 2004, Saló, 2006, Saló and Baguñà, 2002, Sánchez-Alvarado, 2006, Cebrià, 2007). Freshwater planarians have asexual, sexual and mixed (sexual/ asexual, usually seasonal) modes of reproduction. Asexual re- production occurs by transverse fission and produces two new individuals that regenerate the missing parts. Animals from sexually reproducing species are hermaphrodites and reproduce towards an understanding of basic biology of planarian regenera- tion, the results of which can be extrapolated to vertebrates. This review introduces the main characteristics of planarians as a model system for research into regeneration, summarises the most important research questions being tackled by our group and addresses new and upcoming issues in planarian regenera- tion. Early molecular studies of planarian regeneration: the homeobox and Hox genes In order to ascertain whether the same developmental gene regulators identified in classical developmental model organisms such as Drosophila and vertebrate models were also involved in controlling planarian regeneration, the basic molecular tools to characterize homeobox and Hox genes in the genome of the planarian Girardia tigrina were prepared by E. Saló in 1985-1986 during his postdoctoral stay at the Biozentrum (Basel, Switzer- land). Using those tools, two homeobox-containing genes, Dth-1 and Dth-2, were identified in Platyhelminthes (García-Fernàndez et al., 1991). They belong to the NK family and display tissue- specific expression: Dth-1 is expressed in cells surrounding the gut while Dth-2 is expressed in peripheral parenchymal cells (García-Fernàndez et al., 1993a). Screening of cDNA and ge- nomic libraries generated from G. tigrina using PCR with degen- erate oligonucleotides yielded a large number of homeobox- containing genes from the paired, POU and, most importantly, the Hox families. From the paired family we characterized two genes: a paired-like gene Dtprd-1 (Muñóz-Mármol et al., 1997), which is Fig. 1. Dorsal view of the freshwater planarian Schmidtea mediterranea. The animal displays bilateral symmetry and cephalization. The head has two differentiated eye spots (e) with a non-pigmented periglobular area. The insert shows the two basic cell types of the planarian eye spots: the photoreceptor cells (phc) are shown in green with the rhabdomeric structures where the visual pigment accumulates (r) and the pigment cells (pc) in brown. Ph, Pharynx. Scale bar, 1 mm. Fig. 2. Planarian head regeneration. (A) Electron microscopy view of an undifferentiated neoblast showing a single nucleus and a small cytoplasmic veil with a few organelles, including free ribosomes, mitochondria (arrows) and chromatoid bodies (white arrowhead). (B) Scanning electron micrograph of the wound area 6 hours after cutting. The wound is completely covered by the old epidermis. The arrows indicate the direction of contraction of the intact sides due to a general muscle contraction. v, ventral; d, dorsal. Different stages of planarian head regeneration: Numbers refer to days of regeneration. (1) One day later, there is still evidence of muscle contraction in the wound area and the small non-pigmented blastema tissue is visible. In the following panels different stages of head regeneration can be observed with the gradual growth and differentiation of the eyes and pigmented epidermis in the blastema. At 5 days (5) the early differentiation of the eyes and pigmentation of the epidermis is visible. At 14 days (14), the planarian reaches new appropriate proportions according to the reduced size. Scale bars: A, 3 μm; B, 0.2 mm; 1-14, 1 mm. BA by cross-fertilization; following copulation, they deposit egg capsules from which several hatchlings with the appearance of miniature adults emerge ready to feed and grow. The reproductive system is usually very complex, consisting of multiple testes located dorsally and a pair of ventrally located ovaries with numerous separate vitellaria. The eggs are ectolecithal. The copulatory apparatus is very complex and can be used for taxonomic classi- fication (for a general view of the reproductive system see Saló, 2006). For more than 20 years, our group has under- taken molecular studies in planarians to charac- terize a large number of developmental regula- tory genes during regeneration, with special emphasis on Hox and homeobox genes, the nervous system, the eye genetic network, germ cell determination and maintenance, and au- tophagic processes in planarian homeostasis. New strategies such as proteomics are now being applied to characterize factors involved in determination and maintenance of the stem cell lineage, Finally, DNA microarray technology is being used to characterize new genetic compo- nents involved in regulation of the CNS and eye morphogenesis, along with more in-depth analy- sis of elements of the signalling cascade in- volved in axis determination and maintenance. These lines of research open new avenues Planarian regeneration 1319 expressed in cyanophilic ventral gland cells, and a Pax-6 family gene (Callaerts et al., 1999), which later allowed research to be undertaken into the gene network controlling planarian eye deter- mination. We also studied three POU domain genes. One of them, GtPOU-1, was found to be ubiquitously expressed, but a specific C6 epitope raised against the GtPOU-1 fusion protein labelled neural cells from the anterior third of adult planarians. This epitope is dynamically expressed during regeneration and pro- vided the first molecular evidence of morphallactic processes during planarian regeneration (Muñóz-Mármol et al., 1998). Pla- narians contain a large number of Hox genes that can be accom- modated into the canonical series of paralogous groups from Plhox-1 to Plhox-9 (Saló et al., 2001). However, only Plhox-5, -6 and -9 display differential axial nested expression—the rest are ubiquitously expressed. These genes are activated during the first day of tail regeneration and down-regulated during head Marker Species Gene Expression and/or functional Features Reference Axial Genes Gt Gthox Ubiquitous & AP axis (Saló et al., 1995, Saló et al., 2001) (Bayascas et al., 1998a, Bayascas et al., 1997, Bayascas et al., 1998b) Hox genes Sm SmedHox Ubiquitous & AP axis Work in progress Cephalic Genes Orthodenticle Gt DtOtx Cephalic ganglia (Stornaiuolo et al., 1998) Six-3 Gt Gtsix-3 Brain branches (Pineda and Saló, 2002) Patterning Genes Bone morphogenetic proteins (BMPs) Sm Smed/BMP Smed-Smad1 Smed-nlg-1 Smed-noggin1 Dorsal midline Mesenchyme, pharynx, CNS Cephalic branches CNS, dorsal midline (Molina et al., 2007) Gt Gtwnt-5 External and iterative CNS cells (Marsal et al., 2003) Wnt-pathway proteins Sm SmedB-cat’s SmedGsk-3 Ubiquitous expression, Neural regeneration (Iglesias et al., 2008) (Adell et al., 2008) Germ Cell Markers Nanos-related gene Sm Smednos Precursor germ cell determination and maintenance (Handberg-Thorsager and Saló, 2007) Neural Markers POU-domain protein Gt GtPOU-1 Anterior nerve cells (Muñóz-Mármol et al., 1998) Eye Markers Pax-6 Gt GtPax-6A GtPax-6B Eye cells (Callaerts et al., 1999) (González-Estévez et al., 2003, Pineda et al., 2001, Pineda et al., 2002, Saló et al., 2002) Sine oculis Gt Gtso Eye cell determination and maintenance (Pineda et al., 2000, Pineda et al., 2001, Saló et al., 2002) Eyes absent Dj Djeya Eye cell determination and maintenance (Mannini et al., 2004) Opsin Gt Gtops Photoreceptors (Pineda et al., 2000) Cell-Specific Markers Paired-like gene Gt Dtprd-1 Secretory gland cells (Muñóz-Mármol et al., 1997) NK-type homeobox genes Gt Dth-1 Dth-2 Gastrodermal cells Parenchyma cells (García-Fernàndez et al., 1991, García-Fernàndez et al., 1993a) Myosin heavy chain Gt Gtmhc Muscle cells (Cebrià et al., 1999, Cebrià et al., 1997) Regional Markers C-type multidomain free lectins Gt Scarf1, 2, 3 Gtlec1, 2a, 2b, 2c Parenchyma pre-pharyngeal region (Shagin et al., 2002) General Markers Protein tyrosine kinases Gt Spk-1 Continuous expression during regeneration (Burgaya et al., 1994) Planarian Mariner Transposon Gt Pmar-1 All cells (García-Fernàndez et al., 1995, García-Fernàndez et al., 1993b) Dead Associated Protein Gt GtDap-1 Cells in autophagy, induces cell death (González-Estévez et al., 2007a, González-Estévez et al., 2007b, Tettamanti et al., 2008) miRNAs let-7 Gt Let-7 Not determined (Pasquinelli et al., 2003) TABLE 1 SUMMARY OF GENES CHARACTERIZED IN FRESHWATER PLANARIANS (ORDER TRICLADIDA) Species abbreviations: Dj, Dugesia japonica; Gt, Girardia tigrina; Sm, Schmidtea mediterranea. 1320 E. Saló et al. regeneration (Bayascas et al., 1998a, Nogi and Watanabe, 2001, Orii et al., 1999, Saló and Baguñà, 2002). For a summary of the genes characterized by our group see Table1. Main topics currently under study in planarian regen- eration and homeostasis Several strategies have been developed in the last decade to analyze the function of the isolated genes in planarian regenera- tion. The first was RNA-mediated genetic interference (RNAi) by application of dsRNA to silence endogenous transcripts with an identical sequence and thereby generate loss-of-function pheno- types. This strategy was originally developed in Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998) and then successfully adapted for use in planarians (Sánchez-Alvarado and Newmark, 1999). We used RNAi to produce the first non-eye phenotype by interfering with expression of sine oculis, one of the genes of the conserved genetic network involved in early eye determination (Pineda et al., 2000). The second strategy involves the production of gain-of- function phenotypes by transgenesis. To that end we developed a new strategy by injection of DNA constructs flanked with repeated transposable sequences plus a second vector that contains a specific helper to facilitate integration. To facilitate transfer to the nucleus the animals injected with the constructs were immediately electroporated with a single pulse of 60 volts/ cm2 for 30 milliseconds with electrodes used in zebrafish em- bryos. This produced a mosaic in which some neoblasts dis- played transformation. Transformed sexual mosaic strains pro- duced transgenic planarians in the next generation through germ cells derived from transformed neoblasts (González-Estévez et al., 2003). To improve the characterization of the phenotypes generated using these strategies, a large number of new molecular markers have been developed based on the characterization of gene expression patterns by in situ hybridization and immunohis- tochemistry. The initial list of genes characterized by similarity using cDNA libraries and PCR amplification using degenerate oligonucleotides (see Table 1) was completely overtaken with the production of large collections of expressed sequenced tags (ESTs) (Mineta et al., 2003, Sánchez-Alvarado et al., 2002, Zayas et al., 2005). There has been an effort to sequence the genome of a clonal line of Schmidtea mediterranea sexual strain at the Genome Sequencing Center at Washington University, St. Louis (WUSL, http://genome.wustl.edu/genome.cgi?GENOME= Schmidtea%20mediterranea), following its prioritization in March 2003 by the National Human Genome Research Institute (NHGRI, you can find details of the original whitepaper proposal at http:// www.genome.gov/12512286). By 2006 a high coverage assem- bly, 11.60X Q20, was already available from WUSL, and had an estimated length of 865Mbp. It was composed of a set of nearly 90,000 contigs instead of 8 chromosome sequences, mainly due to intrinsic characteristics of the genome in this species. Accord- ing to WUSL, the low G+C content (31%), large amount of repetitive sequences (46% of the total genome), sequence het- erozygosity (even though the animals used for DNA preparation were clonally derived), and further problems with BAC library preparations, makes this assembly hard to finish. High rates of polymorphism have presented challenges for the assembly in other invertebrate species, such as sea urchin (Sodergren et al., 2006) or Ciona savigny (Vinson et al., 2005). Despite that, all the available genomic sequences, taking into account current genes cloned in planarian relatives, the EST collections (Sánchez- Alvarado et al., 2002, Zayas et al., 2005), the shotgun sequencing traces and the assembled contig drafts, can prove useful to locate orthologs of genes with known functions in other species or unannotated ones. Those genes may have novel functions in planarians that could play an important role in biological pro- cesses such as regeneration. Many examples can be cited for different species, and the use of comparative genomic analysis of Dugesia japonica EST sequences has already proven fruitful in efforts to identify genes expressed in the CNS (Mineta et al., 2003). Recent in-depth analyses of selected sequences representa- tive of 1% of the human genome have uncovered a more complex scenario of gene expression and regulation than expected, with many novel functional regions that do not code for proteins (The ENCODE Project Consortium, 2007). The planarian genome cannot be studied in such detail until a better assembly is released. However, we can take advantage of the currently available sequence catalogue to screen for protein coding re- gions with a custom-designed microarray, using NimbleGen maskless photolitography technologies (Nuwaysir et al., 2002). In addition, a database of open reading frames (ORFs) derived from genomic sequences has been devised in order to extend peptide searches from mass fingerprint spectra in a proteomics analysis. Bioinformatics has an important role to play in the integration of all the data to define annotation hypotheses that will be validated or refuted later at the bench, and also in the analysis of the results obtained with high-throughput technologies used in our current transcriptomics and proteomics approaches. Such combinations of new methods and innovations should allow us to tackle planarian regeneration from a new perspective. Below we describe the main topics that are being addressed in our laboratory. Strategies to analyse planarian stem cells or neoblasts Planarians have a unique cell type known as neoblasts, which are pluripotent stem cells that proliferate and differentiate into all cell types, including the germ line. Unfortunately the neoblast cell lineages are not established, largely due to the lack of good molecular markers. Since neoblasts may have a stable popula- tion of silenced mRNAs, we initiated a proteomic strategy to characterize factors that may be responsible for regulating the totipotent or pluripotent stages of the neoblasts, since that ap- proach would overcome the noise produced by silenced mRNAs. We analysed differential protein expression by 2D fluorescence difference gel electrophoresis (DIGE), comparing control planar- ians with organisms depleted of neoblasts by either X-rays or piwi silencing by RNAi (Reddien et al., 2005). Protein spots unique to the neoblasts i.e. present in the controls and absent in the irradiated organisms—were analysed by mass spectrometry. The resulting spectral fingerprints were compared with an “in silico” peptide database produced from the complete set of genomic sequences for S. mediterranea. An initial study using this ap- proach led to the identification of heat shock proteins and proteins from the mitotic cytoskeleton, as well as proteins with the con- served PAZ-domain. We expect to characterize new proteins related to specific neoblast functions that will be validated by their Planarian regeneration 1321 expression patterns and functional analyses by RNAi (work in progress). One of the big challenges for the study of neoblasts is to explain how cell homeostasis is maintained in organisms that continu- ously change their size and can regenerate a complete, normally proportioned animal in two weeks. The isolation and functional characterization of a dead associated protein-like gene in planar- ians, Gtdap-1, has allowed us to analyse the importance of cell autophagy and cell death in that process (González-Estevez et al., 2007a; González-Estevez et al., 2007b; Tettamanti et al., 2008). Autophagy refers to a process of cell recycling through lysosomal degradation, allowing recycling of material for macro- molecular synthesis and/or ATP generation. We observed a rapid upregulation of Gtdap-1 when the planarian is undergoing archi- tectural remodelling or when cells need to generate intracellular nutrients and energy during starvation. Inhibition of Gtdap-1 by RNAi revealed remodelling defects and a decrease in the speed of regeneration that we attribute to a reduction in autophagy and autophagic programmed cell death. Overexpression of Gtdap-1 by transgenesis in planarians under conditions of stress induces programmed cell death (González-Estevez et al., 2007a). Those findings confirm the role of autophagy as an essential mechanism to maintain the proportionality of the different cell types in planar- ians and provide the energy required for neoblast proliferation and differentiation in such situations. The planarian germline S. mediterranea exists as two strains, a sexually reproducing and an asexually reproducing strain. Whereas the hermaphroditic sexual strain reproduces by cross-fertilization, the asexual strain reproduces uniquely by fission and does not possess reproduc- tive organs. However, it has been described that under certain conditions (temperature below 12oC and intensive feeding, twice per week) the asexual strain can develop gonads and copulatory translational regulators have been shown to play an essential role in germline development and maintenance in a wide variety of organisms using different modes (epigenesis or preformation) to determine the germline (reviewed in Parisi and Lin, 2000). In S. mediterranea, nanos expression is observed already at late stages of embryogenesis (Fig. 3A; stage 8 according to Cardona et al., 2005) in the presumptive male germ cells, sug- gesting that the germline is segregated during or at least by late stages of embryogenesis (Handberg-Thorsager and Saló, 2007). In juvenile planarians and during sexualization of S. mediterranea and D. japonica, nanos is expressed in the presumptive primordial germ cells of both the testes and the ovaries. The expression of nanos corresponds to clusters of cells with no clear or known morphological structure, but as the planarian matures sexually and the gonads develop, nanos expression is restricted to the periphery of the gonads, corresponding to the spermatogonia in the testes and to the oogonia in the ovaries (Fig. 3B) (Handberg- Thorsager and Saló, 2007, Sato et al., 2006, Wang et al., 2007). A knock-down of nanos in sexually reproducing S. mediterranea resulted in a loss of the development, formation and maintenance of the germ cells in juveniles, regenerating and intact planarians, respectively (Wang et al., 2007). Remarkably, expression of nanos was also found in presump- tive primordial male and female germ cells in asexually reproduc- ing planarians (Fig. 3C). The expression in dorsally and ventrally located clusters of cells shows high similarity to that found in the juvenile and immature sexual planarian (Handberg-Thorsager and Saló, 2007, Sato et al., 2006, Wang et al., 2007). These observa- tions suggest that even though the asexual strain does not repro- duce sexually, it does possess clusters of primordial germ cells. Interestingly a knock-down of nanos in the asexual strain of S. mediterranea resulted in a loss of the clusters of primordial germ cells, as demonstrated with germinal histone H4, which labels presumptive germ cells and neoblasts (Wang et al., 2007). Fig. 3. Whole-mount in situ hybridization of nanos in Schmidtea mediterranea. (A) Expression of nanos in male primordial germ cells during late development of an embryo (stage 8). (B) In the sexually mature S. mediterranea, nanos is expressed in the spermatogonia of the testes located on the dorsal side of the animal and in the oogonia of the ovaries, which are located in an anterior-ventral position (insert). (C) In asexual S. mediterranea gonad primordia can be detected with nanos on the dorsal side in male primordial germ cells and on the ventral side in female primordial germ cells (insert). Anterior is to the left. Dorsal view. Ventral view of the same planarian shown in the insert. c, copulatory apparatus; fpgc, female primordial germ cells; mpgc, male primordial germ cells; ph, pharynx; ov, ovaries; te, testes. Scale bar, 1 mm. B CA apparatus, but without producing fertile cocoons (Benazzi et al., 1975). How the germline is determined in planarians is still an open question, but based on earlier studies carried out by Thomas H. Morgan (Morgan, 1902) it has been suggested that an epigenetic mechanism is involved in segregation of the germline from the totipotent neoblasts (Zayas et al., 2005). Morgan showed that if you amputate the planarian at a level anterior to the gonads both the piece that contains germ cells and the piece that does not can regener- ate an entire planarian with a fertile reproductive system. At the same time, W. Curtis (Curtis, 1902) described the formation of the reproductive organs in juveniles, which do not posses these organs on hatching, and during sexualization of asexual pla- narians of the species Planaria maculata. With the recent characterization of a planarian nanos gene in the planarian species S. mediterranea (Smednos or Smed-nanos) and Dugesia japonica (Djnos), it is now possible to distinguish gonad primordia in juve- nile and immature adult sexual planarians as well as in asexual planarians (Handberg-Thorsager and Saló, 2007, Sato et al., 2006, Wang et al., 2007). The zinc-finger proteins from the nanos family of 1322 E. Saló et al. whereas nanos-positive cells in asexual animals seem to be potential proliferative cells since they are labeled with PCNA but they do not incorporate BrdU. Those authors proposed that nanos-positive cells in asexual planarians could be in cell cycle arrest. A number of germ-cell markers in mature gonads have been described in planarians, including DeY1, a component of ribo- nucleoprotein particles (Salvetti et al., 2002), DjPTK-1, a receptor protein tyrosine kinase (Ogawa et al., 1998), PCNA, a proliferat- ing cell protein (Orii et al., 2005), vasa, a germ granule-specific gene (Shibata et al., 1999) and a variety of genes from the EST collection from sexual S. mediterranea (Zayas et al., 2005). However, with the recent description of nanos (Handberg- Thorsager and Saló, 2007, Sato et al., 2006, Wang et al., 2007) and germinal histone H4 (Wang et al., 2007), it is now possible to detect and describe gonad primordia at an early stage of devel- opment of the reproductive system. Determination and maintenance of axial polarity: Wnt and BMP signalling pathways How polarity is re-established along the anteroposterior (AP) and dorsoventral (DV) axes during planarian regeneration is still largely unknown. Many studies have shown that the Wnt and BMP signalling pathways function in highly conserved mechanisms responsible for correct patterning and morphogenesis during development and that they are required for AP and DV patterning, respectively, in both vertebrates and invertebrates (reviewed in De Robertis and Kuroda, 2004, Little and Mullins, 2006, Niehrs, 2004). Unravelling the function of these signalling pathways in planarians will clarify whether they are responsible for axis re- establishment during regeneration. Moreover, these studies will give us clues as to whether the mechanisms responsible for patterning during development are also used in regeneration. Wnt signalling regulates a broad range of cell processes, such as stem cell maintenance, cell fate specification, determination of cell polarity and cell migration (reviewed in Logan and Nusse, 2004, Reya and Clevers, 2005). During early development, the Wnt pathway is involved in axis specification and germ layer establishment from mammals to cnidarians (reviewed in Croce and McClay, 2006, Lee et al., 2006, Marikawa, 2006). At later developmental stages it is responsible for conferring head versus tail identity (reviewed in Holland, 2002, Niehrs, 1999). The Wnt pathway is not only activated during development but also in adult organisms, where it is involved in tissue self-renewal and tumori- genesis (reviewed in Clevers, 2006). Through its role in stem cell maintenance, the Wnt pathway has been demonstrated to be required for regeneration in fish and amphibian appendages (Caubit et al., 1997, Stoick-Cooper et al., 2007) and mammalian tissues (Osakada et al., 2007). Despite the requirement for Wnt activation in regeneration, a role for elements of the Wnt pathway in re-patterning the regenerating tissue has only been demon- strated in cnidarians. Experiments in hydra and Nematostella demonstrate that Wnt signalling is involved in axis formation, patterning and germ-layer specification not only during embryo- genesis but also during regeneration (rev in Lee et al., 2006). In vertebrates, the BMP pathway specifies ventral cell fates during embryogenesis. Mutations in BMP genes result in a dorsalizing phenotype, whereas mutations in antagonists of this pathway, such as noggin or chordin, give rise to a ventralized phenotype (reviewed in De Robertis and Kuroda, 2004). On the contrary, BMP specifies dorsal cell fates in invertebrates. Research in our laboratory has sought to address whether the Wnt and BMP pathways are required during planarian regenera- tion for both blastema growth and body patterning. Interestingly, two recent reports suggest that during planarian regeneration both pathways are required for patterning. Kobayashi et al. (2007) demonstrated the involvement of the Wnt pathway in AP pattern- ing of the CNS in the planarian species D. japonica, while Orii and Watanabe (2007) reported a role for a BMP gene in DV patterning. Previously, our group reported the isolation of a member of the Wnt family, Gt-wnt5, which is expressed in the CNS (Marsal et al., 2003). From the available genomic database of S. mediterranea we have identified several elements of the Wnt pathway that are currently being characterized (Wnts, TCFs, frizzleds, dishevelled, GSK3, axin, beta-catenin). Inhibition of GSK3 using synthetic drugs has been successfully used in cnidarians to demonstrate the role of the Wnt pathway in pattern formation during regenera- tion (reviewed in Lee et al., 2006). Using the same strategy we have demonstrated that GSK3 is required for normal regeneration of the nervous system in S. mediterranea (Adell et al., 2008). Fig. 4. Whole-mount in situ hybridization for homologs of receptors for neuroactive substances in Schmidtea mediterranea. Arrows indicate serotonin receptor expression in the photosensitive cells in the inset in (D). Anterior to the left. cg, cephalic ganglia; vnc, ventral nerve cords. Scale bar, 1 mm Further characterization of nanos-positive cells demonstrated that these indeed have characteristics of undifferentiated cells. In situ hybridization analyzed by electron micros- copy showed that nanos transcripts are lo- cated in the chromatoid body and nanos- positive cells are labeled with PCNA, which is essential for DNA replication and is found in proliferating cells (Sato et al., 2006). Further- more nanos expressing cells are sensitive to irradiation (Handberg-Thorsager and Saló, 2007, Sato et al., 2006, Wang et al., 2007), suggesting that these cells are either depen- dent on the neoblasts, which are eliminated upon irradiation, or that they stop expressing nanos and change their cell fate. Finally, Sato et al. (2006) showed by BrdU incorporation that nanos-positive cells in sexual planarians are proliferative cells and incorporate BrdU, B C D A Planarian regeneration 1323 GSKs inhibited animals showed a delayed and improper regen- eration of the anterior structures, while the posterior regenerated normally, suggesting that also in planarians the Wnt pathway could have a role in AP axis patterning. Recently, the requirement of the canonical wnt pathway for AP axis establishment and maintenance during planarians regeneration and normal homeo- stasis has been certainly demonstrated (Gurken et al., 2008; Pettersen and Reddien 2008, Iglesias et al., 2008). Inhibition of Smed-βcatenin1 leads to a striking phenotype: radial-like hypercephalized animals, in which the AP axis polarity is abol- ished, while the DV remains unaffected (Iglesias et al., 2008). Moreover, inhibition of APC, a component of the β-catenin de- struction complex, leads to the opposite phenotype, planarians which are not able to regenerate the head, showing a tail structure instead (Gurken et al., 2008). Similarly, several members of the BMP pathway, including homologues of BMP, Smad and noggin, have also been isolated from S. mediterranea (Molina et al., 2007, Reddien et al., 2007). RNAi-based silencing of Smed-BMP or Smed-Smad1 results in a major disruption of the DV axis in both intact and regenerating animals. Mainly, the dorsal side of the treated planarians looses the expression of dorsal specific mark- ers at the same time that ventral specific markers are ectopically expressed. In addition to this partial ventralization of the dorsal side, a duplicated CNS differentiates dorsally on those RNAi- treated animals (Molina et al., 2007). Also, the BMP pathway has been proposed to regulate dorsal midline and asymmetric regen- eration (Reddien et al., 2007). These results indicate that the BMP pathway is essential for the re-specification and maintenance of the DV axis in planarians. The influence of the nervous system on planarian regenera- tion Over the years, a variety of experimental evidence has sug- gested a role for the nervous system in planarian regeneration. Evidence supporting a pivotal role for the nervous system in regulating key events during regeneration, such as cell prolifera- tion and differentiation, has been obtained from both classical experiments—mainly carried out through amputation at different levels along the AP axis, removal of the ventral nerve cords from the regenerating pieces or grafting tissue fragments into different body regions (reviewed in Brondsted, 1969)—and the more recent molecular-based approaches. However, the exact nature of this putative neural influence remains mostly uncharacterized. In the early 1950s Wolff and Lender carried out several experi- ments that indicated a requirement for brain regeneration prior to eye differentiation, suggesting an inductive role for the brain (Lender, 1952, Wolff and Lender, 1950). More recently, nou- darake, an FGF receptor-like gene specifically expressed in the planarian cephalic region, has been shown to restrict the differen- tiation of brain tissues in this region (Cebrià et al., 2002). Also, abnormal regeneration of the central nervous system after Smed_roboA RNAi has been correlated with the differentiation of ectopic pharynges and dorsal outgrowths with head identity (Cebrià and Newmark, 2007). In the absence of proper connec- tions between the newly differentiated brain and ventral nerve cords, putative neurally derived signals could be present in the surrounding tissues, altering the behaviour of the neoblasts and inducing the morphogenesis defects observed (Cebrià and Newmark, 2007). Neurotransmitters and growth factors have been also impli- cated in regulating stem cell fate in different systems. In planar- ians, the presence of neurons expressing serotonin, FMRFamide, EGF receptor, met-enkephalin (opioid neuropeptide) and neu- ropeptide F has been reported based on immunocytochemistry (Reuter and Gustafsson, 1995, Venturini et al., 1983). Further- more, indirect evidence mostly obtained through the use of agonists or antagonists of some of these neural factors suggest putative roles during planarian regeneration. For example, sero- tonin, one of the most ubiquitous neurotransmitters in animals, and dopamine increase rates of regeneration (Franquinet, 1979, Franquinet and Le Moigne, 1979), and substance P and sub- stance K seem to have a stimulatory effect on neoblast prolifera- tion (Baguñà et al., 1989, Saló and Baguñà, 1986). In contrast, somatostatin has been suggested to have an inhibitory effect on proliferation (Bautz and Schilt, 1986). However, despite the role these factors might play in regeneration, the genes are not well characterized. Thus, except for four serotonin receptor-like genes (Saitoh et al., 1997), several ESTs from Dugesia japonica show- ing homology to different neurotransmitters (Mineta et al., 2003), and recent characterization of genes expressed in dopaminergic and serotonergic neurons (Nishimura et al., 2007a, Nishimura et al., 2007b), little is known about these neurotransmitters and their receptors in planarians. In our laboratory we are taking advantage of the available data on the S. mediterranea genome in order to isolate those genes and characterize their function during regen- eration. Using the amino acid sequences of several neurotrans- mitter receptors from different vertebrates and invertebrates, tblastn searches were carried out against S. mediterranea ge- nomic sequences. Following this in silico approach, several genomic contigs containing putative ORFs coding for several Fig. 5. New genetic methods ap- plied to studies of planarian regen- eration. (A,B) Inhibition of eye re- generative capacity by Smedsix-1 dsRNA (work in progress). Bright-field images of dorsal views of living re- generated planarian heads in Schmidtea mediterranea. (A) Control showing a regenerated head with differentiated eyes (arrows). (B) dsRNA-fed animal; although the head is normal with a complete brain (not shown) and auricle, no eyes or periglobular area (non-pigmented epidermis in the top of the eye) are observed. a, auricles. (C) Fluorescence view of a transgenic planarian head in Girardia tigrina transformed by electroporation with EGFP Hermes-derived vector constructs (González-Estévez et al., 2003). A homogeneous fluorescent signal is observed in the photoreceptor cells of both eyes. Scale bar, 1 mm. B CA 1324 E. Saló et al. types of receptors have been isolated. These include candidate genes for the planarian homologs of receptors for serotonin, dopamine, octopamine, allatostatin, FMRFamide, somatostatin and neuropeptide F. Specific primers have been designed and used to amplify some of these genes from S. mediterranea cDNA. Whole mount in situ hybridizations for dopamine, allatostatin, octopamine and serotonin receptors show that all of them are expressed, at different levels, in the CNS (Fig. 4). In addition dopamine, allatostatin and octopamine receptors are also ex- pressed in the pharynx, probably in its neural plexus. The seroto- nin receptor is also expressed in the photosensitive cells (panel in Fig. 4D). Further analysis will allow us to characterize the function of these genes during planarian regeneration. The eye genetic network Planarian eyes are well-defined sensory structures, generally located on the dorsal side of the third branch of cephalic ganglia and grouped together into simple eyespots or ocelli (Sakai et al., 2000). They are composed of two characteristic cell types, pho- toreceptors and pigmented cells (Fig.1). Photoreceptors are bipolar neurons. Their axons project caudally to the dorsomedial side of the cephalic ganglia, with some axons from each side projecting contralaterally across the midline to produce an optic chiasm, which integrates photosensory inputs from both sides (Sakai et al., 2000). Dendritic extremities generally have a rhabdomeric structure, a regularly ordered microvilli assembly, where opsin accumulates (Orii et al., 1998). The pigmented cells group to form an eyecup which surrounds the rhabdomeres (Fig. 1). Since the initial characterization of the Pax6 gene, we have continued the search for planarian orthologs of genes involved in eye determination (Table 1). We confirmed that the initial eye genetic network is highly conserved in planarians compared to other metazoans, with the characterization of orthologs of sine oculis, eyes absent and opsin genes in different planarian species (Mannini et al., 2004, Pineda et al., 2002, Saló et al., 2002). Loss of function of sine oculis and eyes absent confirms their function in eye determination during regeneration and maintenance in adult planarians (Fig. 5A, B) (Mannini et al., 2004, Pineda et al., 2000). Also, the production of transgenic planarians carrying several dimeric Pax6 binding sites plus an enhanced green fluorescent protein reporter gene produces a new phenotype in which the planarians show green eyes (Fig. 5C) (González- Estévez et al., 2003). The complex expression pattern of compo- nents of the eye genetic network can now be studied in S. mediterranea by DNA microarray technology in different non-eye phenotypes. This may provide a list of candidate downstream genes and suggest the type of interactions with the conserved early eye genetic network (work in progress). Conclusions Due to their extreme morphological plasticity, planarians have provided many scientists with an attractive model organism for centuries. Their high regenerative capacity along with the pres- ence of a totipotent stem cell system that is unique in the metazoans provides an ideal model system for studying regen- eration, pattern formation and stem cell regulation. In addition, the availability of new genomic and proteomic techniques should permit the characterization of novel genes as well as those loci with as yet unknown functions. Other advances, including the ability to create knock-down phenotypes by RNAi, perform transgenesis and characterize miRNAs, as well as the possibility of analyzing cell lineages, should enable longstanding questions to be answered. Since the planarian genome represents one of the first complete genomes available from within the lophotrochozoa, comparative genomics with ecdysozoa and deu- terostomes will become an important tool for identifying candidate genes and regulatory elements involved in the complex biology of metazoans. Acknowledgements The authors wish to thank all those colleagues, postdoctoral research- ers and postgraduate students working on their theses in the Departament de Genètica (Universitat de Barcelona) who, over the last twenty years, have contributed to the results mentioned in this review. We thank Prof. W. Gehring’s group and Dr. Cristina Gonzàlez-Estevez for help and advice on the eye genetic network and transgenesis; Dr R. Batistoni’s group for the long and intense collaboration on the eye genetic network; Dr M. Pala for providing the sexual strain of S. mediterranea and Dr. Iain Patten for critical comments and corrections. This work was supported by grants BMC2002-03992 and BFU2005-00422 from the Ministerio de Educación y Ciencia, Spain, and grant 2005SGR00769 from AGAUR (Generalitat de Catalunya). TA received a C-RED postdoctoral fellowship from Generalitat de Catalunya and FC is the recipient of a Ramón y Cajal fellowship from the Ministerio de Educación y Ciencia, Spain. K F-T and G R-E are recipients of FPI fellowships, and MH-T and MDM are supported by FPU fellowships from the Ministerio de Educación y Ciencia, Spain. Finally KE and MI are the recipients of fellowships from the Generalitat de Catalunya and University of Barcelona, respectively. References AGATA, K. and WATANABE, K. (1999). Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol 10: 377-83. ADELL, T., MARSAL, M. and SALÓ, E. (2008). Planarian GSK3s are involved in neural regeneration. Dev Genes Evol, 218: 89-103. BAGUÑÀ, J. (1981). Planarian neoblasts. Nature 290: 14-15. BAGUÑÀ, J. and ROMERO, R. (1981). Quantitative analysis of cell types during growth, degrowth and regeneration in the planarians Dugesia mediterranea and Dugesia tigrina. Hydrobiologia 84: 181-194. BAGUÑÀ, J., SALÓ, E., COLLET, J., AULADELL, C. and RIBAS, M. (1988). Cellular, molecular and genetic approaches to regeneration and pattern forma- tion in planarians. Fortschr. Zool. 36: 65-78. BAGUÑÀ, J., SALÓ, E. and ROMERO, R. (1989). Effects of activators and antagonists of the neuropeptides substance P and substance K on cell prolifera- tion in planarians. Int J Dev Biol 33: 261-6. BAGUÑÀ, J., SALÓ, E., ROMERO, R., GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., BUENO, D., MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M., BAYASCAS-RAMÍREZ, J.R. and CASALI, A. (1994). Regeneration and pattern formation in planarians: cells, molecules and genes. Zool. Sci. 11: 781-795. BAUTZ, A. and SCHILT, J. (1986). Somatostatin-like peptide and regeneration capacities in planarians. Gen Comp Endocrinol 64: 267-72. BAYASCAS, J.R., CASTILLO, E., MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M., BAGUNÀ, J. and SALÓ, E. (1998a). Synchronous and early activation of planarian Hox genes and re-specification of body axes during regeneration. Hidrobiologia 383: 125- 130. BAYASCAS, J.R., CASTILLO, E., MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M. and SALÓ, E. (1997). Planarian Hox genes: novel patterns of expression during regeneration. Devel- opment 124: 141-148. BAYASCAS, J.R., CASTILLO, E. and SALÓ, E. (1998b). Platyhelminthes have a Hox code differentially activated during regeneration, with genes closely related to those of spiralian protostomes. Dev. Genes Evol. 208: 467-473. Planarian regeneration 1325 BENAZZI, M., BAGUÑÀ, J., BALLESTER, R., PUCCINELLI, I. and DEL PAPA, R. (1975). Further contribution to the taxonomy of the Dugesia lugubris-polychroa group with description of Dugesia mediterranea n.sp. (Tricladida, Paludicola). Boll Zool 42: 81-89. BRONDSTED, H.V. (1969). Planarian regeneration. Pergamon Press. BURGAYA, F., GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., RIUTORT, M., BAGUÑÀ, J. and SALÓ, E. (1994). Structure and expression of Spk-1, an src-related gene product formed in the planarian’Dugesia (G) tigrina. Oncogene 9: 1267-1272. CALLAERTS, P., MUÑÓZ-MÀRMOL, A.M., GLARDON, S., CASTILLO, E., SUN, H., LI, W.H., GEHRING, W.J. and SALÓ, E. (1999). Isolation and expression of a Pax-6 gene in the regenerating and intact Planarian Dugesia(G)tigrina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 558-563. CARDONA, A., HARTENSTEIN, V. and ROMERO, R. (2005). The embryonic development of the triclad Schmidtea polychroa. Development, Genes and Evolution 215: 109-131. CARRANZA, S., BAGUÑÀ, J. and RIUTORT, M. (1997). Is the Platyhelminthes a Monophyletic Primitive group? An assessment using 18S rDNA sequences. Mol. Biol. Evol. 14: 485-497. CAUBIT, X., NICOLAS, S. and LE PARCO, Y. (1997). Possible roles for Wnt genes in growth and axial patterning during regeneration of the tail in urodele amphib- ians. Dev Dyn 210. CEBRIÀ, F. (2007). Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol 217: 733-748. CEBRIÀ, F., BUENO, D., REIGADA, S. and ROMERO, R. (1999). Intercalary muscle cell renewal in planarian pharynx. Dev Genes Evol 209: 249-53. CEBRIÀ, F., KOBAYASHI, C., UMESONO, Y., NAKAZAWA, M., MINETA, K., IKEO, K., GOJOBORI, T., ITOH, M., TAIRA, M., SÁNCHEZ-ALVARADO, A. et al. (2002). FGFR-related gene nou-darake restricts brain tissues to the head region of planarians. Nature 419: 620-4. CEBRIÀ, F. and NEWMARK, P.A. (2007). Morphogenesis defects are associated with abnormal nervous system regeneration following roboA RNAi in planar- ians. Development. CEBRIÀ, F., VISPO, M., NEWMARK, P.A., BUENO, D. and ROMERO, R. (1997). Myocyte differentiation and body wall muscle regeneration in the planarian Girardia tigrina. Dev Genes Evol 207: 306-316. CLEVERS, H. (2006). Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell 127: 469-80. CROCE, J.C. and MCCLAY, D.R. (2006). The canonical Wnt pathway in embryonic axis polarity. Semin Cell Dev Biol 17: 168-74. CURTIS, W. (1902). The life history, the normal fission, and the reproductive organs of Planaria maculata. Proc. Boston Society of Nat. Hist. 30: 515-549. DE ROBERTIS, E.M. and KURODA, H. (2004). Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol 20: 285-308. FIRE, A., MONTGOMERY, M., KOSTAS S.A., DRIVER S.E. and MELLO CC. (1998). Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806–811. FRANQUINET, R. (1979). The role of serotonin and catecholamines in the regen- eration of the planaria Polycelis tenvis. J Embryol Exp Morphol 51: 85-95. FRANQUINET, R. and LE MOIGNE, A. (1979). Relation entre les variations des taux de sérotonine et d’AMP cyclique au cors de la régénération d’une planaire. Biol. Cell. 34: 71-76. GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., BAGUÑÀ, J. and SALÓ, E. (1991). Planarian homeobox genes: Cloning, sequence analysis, and expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7338-7342. GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., BAGUÑÀ, J. and SALÓ, E. (1993a). Genomic organi- zation and expression of the planarian homeobox genes Dth-1 and Dth-2. Development 118: 241-253. GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., BAYASCAS-RAMÍREZ, J.R., MARFANY, G., MUÑÓZ- MÁRMOL, A.M., CASALI, A., BAGUÑÀ, J. and SALÓ, E. (1995). High copy number of highly similar mariner-like transposons in planarian (Platyhelminthe): evidence for a trans-phyla horizontal transfer. Molecular Biology and Evolution 12: 421-431. GARCÍA-FERNÀNDEZ, J., MARFANY, G., BAGUÑÀ, J. and SALÓ, E. (1993b). Infiltration of mariner elements. Nature 364: 109-10. GONZÁLEZ-ESTÉVEZ, C., FELIX, A.D., ABOOBAKER, A.A. and SALÓ, E. (2007a). Gtdap-1 promotes autophagy and is required for planarian remodeling during regeneration and starvation. Proc Natl Acad Sci USA USA 104: 13373-13378. GONZÁLEZ-ESTÉVEZ, C., FELIX, A.D., ABOOBAKER, A.A. and SALÓ, E. (2007b). Gtdap-1 and the role of autophagy during planarian regeneration and starva- tion. Autophagy 3; 6 : 640-642. GONZÁLEZ-ESTÉVEZ, C., MOMOSE, T., GEHRING, W.J. and SALÓ, E. (2003). Planarian transgenic lines obtained by electroporation using transposon-de- rived vectors and an eye-specific GFP marker. Proc Natl Acad Sci USA 100: 14046-14051. GURLEY, K.A., RINK, C. and SÁNCHEZ-ALVARADO, S. (2008). B-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science 319: 323-327. HANDBERG-THORSAGER, M. and SALÓ, E. (2007). The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development, Genes and Evolution 217: 403- 411. HANDBERG-THORSAGER, M., FERNANDEZ, E. and SALÓ, E. (2008). Stem cells and regeneration in planarians. Frontiers in Bioscience 13:6374-6394. HOLLAND, L.Z. (2002). Heads or tails? Amphioxus and the evolution of anterior- posterior patterning in deuterostomes. Dev Biol 241: 209-28. IGLESIAS. M., GOMEZ-SKARMETA, J.L., SALÓ, E. and ADELL, T. (2008). Silencing of Smed-β−catenin1 generates radial-like hypercephalized planar- ians. Development 135: 1215-1221. KOBAYASHI, C., SAITO, Y., OGAWA, K. and AGATA, K. (2007). Wnt signaling is required for antero-posterior patterning of the planarian brain Dev Biol 306: 714- 24. LEE, P.N., PANG, K., MATUS, D.Q. and MARTINDALE, M.Q. (2006). A WNT of things to come: evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians. Semin Cell Dev Biol. 17: 157-67. LENDER, T.H. (1952). Le role inducteur du cerveau dans la régénération des yeux d’une planaire d’eau douce. Ann. Biol. 28: 191-198. LITTLE, S.C. and MULLINS, M.C. (2006). Extracellular modulation of BMP activity in patterning the dorsoventral axis. Birth Defects Res C Embryo Today 78: 224- 42. LOGAN, C.Y. and NUSSE, R. (2004). The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 20: 781-810. MANNINI, L., ROSSI, L., DERI, P., GREMIGNI, V., SALVETTI, A., SALÓ, E. and BATISTONI, R. (2004). Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol 269: 346-59. MARIKAWA, Y. (2006). Wnt/beta-catenin signaling and body plan formation in mouse embryos. Semin Cell Dev Biol 17: 175-84. MARSAL, M., PINEDA, D. and SALÓ, E. (2003). Gtwnt-5 a member of the wnt family expressed in a subpopulation of the nervous system of the planarian Girardia tigrina. Gene Expr Patterns 3: 489-95. MINETA, K., NAKAZAWA, M., CEBRIÀ, F., IKEO, K., AGATA, K. and GOJOBORI, T. (2003). Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by compara- tive genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA 100: 7666- 71. MOLINA, M.D., SALÓ, E. and CEBRIÀ, F. (2007). The BMP pathway is essential for re-specification and maintenance of the dorsoventral axis in regenerating and intact planarians. Dev Biol 311: 79-94. MORGAN, T.H. (1902). Growth and regeneration in Planaria lugubris. Arch Entwicklungsmech Org 13: 179-212. MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M., CASALI, A., CASTILLO, E., BAYASCAS, J.R. and SALÓ, E. (1997). Dtprd-1, a novel planarian paired-like homeoprotein expressed in specific secretory cells. Dev. Genes Evol. 207: 296-305. MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M., CASALI, A., MIRALLES, A., BUENO, D., BAYASCAS, J.R., ROMERO, R. and SALÓ, E. (1998). Characterization of Platyhelminth POU domain genes: ubiquitous and specific anterior nerve cell expression of different epitopes of GtPOU-1. Mech. Dev. 76: 127-140. NEWMARK, P.A. and SÁNCHEZ-ALVARADO, A. (2002). Not your father’s planar- ian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet 3: 210-9. NIEHRS, C. (1999). Head in the WNT: the molecular nature of Spemann’s head 1326 E. Saló et al. organizer. Trends Genet 15: 314-9. NIEHRS, C. (2004). Regionally specific induction by the Spemann-Mangold orga- nizer. Nat Rev Genet 5: 425-34 NISHIMURA, K., KITAMURA, Y., INOUE, T., UMESONO, Y., SANO, S., YOSHIMOTO, K., INDEN, M., TAKATA, K., TANIGUCHI, T., SHIMOHAMA, S. et al. (2007a). Reconstruction of dopaminergic neural network and locomotion function in planarian regenerates. Dev Neurobiol 67: 1059-78. NISHIMURA, K., KITAMURA, Y., INOUE, T., UMESONO, Y., YOSHIMOTO, K., TAKEUCHI, K., TANIGUCHI, T. and AGATA, K. (2007b). Identification and distribution of tryptophan hydroxylase (TPH)-positive neurons in the planarian Dugesia japonica. Neurosci Res. NOGI, T. and WATANABE, K. (2001). Position-specific and non-colinear expres- sion of the planarian posterior (Abdominal-B-like) gene. Develop. Growth Differ. 43: 177-184. NUWAYSIR, E.F., HUANG, W., ALBERT, T.J., SINGH, J., NUWAYSIR, K., PITAS, A., RICHMOND, T., GORSKI, T., BERG, J.P., BALLIN, J. et al. (2002). Gene expression analysis using oligonucleotide arrays produced by maskless pho- tolithography. Genome Res 12: 1749-55. OGAWA, K., WAKAYAMA, A., KUNISADA, T., ORII, H., WATANABE, K. and AGATA, K. (1998). Identification of a receptor tyrosine kinase involved in germ cell differentiation in planarians. Biochem Biophys Res Commun 248: 204-9. ORII, H., KATAYAMA, T., SAKURAI, T., AGATA, K. and WATANABE, K. (1998). Immunohistochemical detection of opsins in turbellarians. Hydrobiologia 383: 183-187. ORII, H., KATO, K., UMESONO, Y., SAKURAI, T., AGATA, K. and WATANABE, K. (1999). The planarian HOM/HOX Homeobox genes (Plox) expressed along the anteroposterior axis. Dev. Biol. 210: 456-468. ORII, H., SAKURAI, T. and WATANABE, K. (2005). Distribution of the stem cells (neoblasts) in the planarian Dugesia japonica. Dev Genes Evol 215: 143-57. ORII, H. and WATANABE, K. (2007). Bone morphogenetic protein is required for dorso-ventral patterning in the planarian Dugesia japonica. Dev Growth Differ 49: 345-9 OSAKADA, F., OOTO, S., AKAGI, T., MANDAI, M., AKAIKE, A. and TAKAHASHI, M. (2007). Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J Neurosci 27: 4210-9.. PARISI, M. and LIN, H. (2000). Translational repression: A duet of Nanos and Pumilio. Current Biology 10: R81-R83. PASQUINELLI, A.E., MCCOY, A., JIMÉNEZ, E., SALÓ, E., RUVKUN, G., MARTINDALE, M.Q. and BAGUÑÀ, J. (2003). Expression of the 22 nucleotide let-7 heterochronic RNA throughout the Metazoa: a role in life history evolution? Evol. Dev. 5: 372-378. PETERSEN, C. and REDDIEN, P.W. (2008). Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science 319:327- 30. PINEDA, D., GONZÁLEZ, J., CALLAERTS, P., IKEO, K., GEHRING, W.J. and SALÓ, E. (2000). Searching for the prototypic eye genetic network: Sine oculis is essential for eye regeneration in planarians. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4525-4529. PINEDA, D., GONZÁLEZ, J., MARSAL, M. and SALÓ, E. (2001). Evolutionary conservation of the initial eye genetic pathway in planarians. Belg. J. Zool. 131: 77-82. PINEDA, D., ROSSI, L., BATISTONI, R., SALVETTI, A., MARSAL, M., GREMIGNI, V., FALLENI, A., GONZÁLEZ-LINARES, J., DERI, P. and SALÓ, E. (2002). The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax-6 independent. Development 129: 1423-1434. PINEDA, D. and SALÓ, E. (2002). Planarian Gtsix3, a member of the Six/so gene family, is expressed in brain branches but not in eye cells. Mech Dev 119 Suppl 1: S167-71. REDDIEN, P.W., BERMANGE, A.L., KICZA, A.M. and SÁNCHEZ ALVARADO, A. (2007). BMP signaling regulates the dorsal planarian midline and is needed for asymmetric regeneration. Development: 4043-51. REDDIEN, P.W., OVIEDO, N.J., JENNINGS, J.R., JENKIN, J.C. and SÁNCHEZ- ALVARADO, A. (2005). SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planar- ian stem cells. Science 310: 1327-30. REDDIEN, P.W. and SÁNCHEZ-ALVARADO, A. (2004). Fundamentals of planar- ian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol 20: 725-57. REUTER, M. and GUSTAFSSON, M.K. (1995). The flatworm nervous system: pattern and phylogeny. Exs 72: 25-59. REYA, T. and CLEVERS, H. (2005). Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434: 843-50. SAITOH, O., YURUZUME, E., WATANABE, K. and NAKATA, H. (1997). Molecular identification of a G protein-coupled receptor family which is expressed in planarians. Gene 195: 55-61. SAKAI, F., AGATA, K., ORII, H. and WATANABE, K. (2000). Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians-eye regeneration field and pathway selection by optic nerves-. Zool. Sci. 17: 375- 381. SALÓ, E. (2006). The power of regeneration and the stem cells kingdom: The freshwater planarian Schmidtea mediterranea (Platyhelminth). Bioessays 28: 546-559. SALÓ, E. and BAGUÑÀ, J. (1986). Stimulation of cellular proliferation and differen- tiation in the intact and regenerating planarian Dugesia(G) tigrina by the neuropeptide substance P. J Exp Zool 237: 129-35. SALÓ, E. and BAGUÑÀ, J. (2002). Regeneration in planarians and other worms: New findings, new tools, and new perspectives. J Exp Zool 292: 528-39. SALÓ, E., MUÑÓZ-MÁRMOL, A.M., BAYASCAS-RAMÍREZ, J.R., GARCÍA- FERNÀNDEZ, J., MIRALLES, A., CASALI, A., COROMINAS, M. and BAGUÑÀ, J. (1995). The freshwater planarian Dugesia (G) tigrina contains a great diversity of homeobox genes. Hydrobiologia 305: 269-275. SALÓ, E., PINEDA, D., MARSAL, M., GONZÁLEZ, J., GREMIGNI, V. and BATISTONI, R. (2002). Genetic network of the eye in Platyhelminthes: expres- sion and functional analysis of some players during planarian regeneration. Gene 287: 67-74. SALÓ, E., TAULER, J., JIMÉNEZ, E., BAYASCAS, J.R., GONZÁLEZ-LINARES, J., GARCÍA-FERNÀNDEZ, J. and BAGUÑÀ, J. (2001). Hox and ParaHox Genes in Flatworms. Characterization and Expression. Amer. Zool. 41: 652-663. SALVETTI, A., LENA, A., ROSSI, L., DERI, P., CECCHETTINI, A., BATISTONI, R. and GREMIGNI, V. (2002). Characterization of DeY1, a novel Y-box gene specifically expressed in differentiating male germ cells of planarians. Gene Expr Patterns 2: 195-200. SÁNCHEZ-ALVARADO, A. (2006). Planarian regeneration: Its end is its begining. Cell 124: 241-245. SÁNCHEZ-ALVARADO, A. and NEWMARK, P.A. (1999). Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5049-54. SÁNCHEZ-ALVARADO, A., NEWMARK, P.A., ROBB, S.M. and JUSTE, R. (2002). The Schmidtea mediterranea database as a molecular resource for studying platyhelminthes, stem cells and regeneration. Development 129: 5659-65. SATO, K., SHIBATA, N., ORII, H., AMIKURA, R., SAKURAI, T., AGATA, K., KOBAYASHI, S. and WATANABE, K. (2006). Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Dev Growth Differ 48: 615-28. SHAGIN, D.A., BARSOVA, E.V., BOGDANOVA, E., BRITANOVA, O.V., GURSKAYA, N., LUKYANOV, K.A., MATZ, M.V., PUNKOVA, N.I., USMAN, N.Y., KOPANTZEV, E.P. et al. (2002). Identification and characterization of a new family of C-type lectin-like genes from planaria Girardia tigrina. Glycobiology 12: 463-72. SHIBATA, N., UMESONO, Y., ORII, H., SAKURAI, T., WATANABE, K. and AGATA, K. (1999). Expression of vasa(vas)-related genes in germline cells and totipo- tent somatic stem cells of planarians. Dev Biol 206: 73-87. SODERGREN, E., SHEN, Y., SONG, X., ZHANG, L., GIBBS, R.A. and WEINSTOCK, G.M. (2006). Shedding genomic light on Aristotle’s lantern. Dev Biol 300: 2-8. STOICK-COOPER, C.L., WEIDINGER, G., RIEHLE, K.J., HUBBERT, C., MAJOR, M.B., FAUSTO, N. and MOON, R.T. (2007). Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development 134: 479-89. STORNAIUOLO, A., BAYASCAS, J.R., SALÓ, E. and BONCINELLI, E. (1998). A homeobox gene of the orthodenticle family is involved in antero-posterior patterning of regenerating planarians. Int. J. Dev. Biol. 42: 1153-1158. TETTAMANTI, G., SALÓ, E., GONZÁLEZ-ESTÉVEZ, C., FELIX, A.D., GRIMALDI, A. and DE EGUILEOR, M. (2008).Autophagy in invertebrates:insights into development, regeneration and body remodeling. Current Pharmaceutical Design 14: 116-125. Planarian regeneration 1327 Related, previously published Int. J. Dev. Biol. articles See our recent Special Issue Ear Development edited by Fernando Giraldez and Bernd Fritzsch at: http://www.ijdb.ehu.es/web/contents.php?vol=51&issue=6-7 Characterization of novel genes expressed specifically in the sexual organs of the planarian Dugesia ryukyuensis Sumitaka Hase, Emiko Kashiwagi, Kazuya Kobayashi, Motonori Hoshi and Midori Matsumoto Int. J. Dev. Biol. (2007) 51: 345-349 Expression of DjXnp, a novel member of the SNF2-like ATP-dependent chromatin remodelling genes, in intact and regenerating planarians. Leonardo Rossi, Paolo Deri, Ilaria Andreoli, Vittorio Gremigni, Alessandra Salvetti and Renata Batistoni Int. J. Dev. Biol. (2003) 47: 293-298 Planarian pharynx regeneration revealed by the expression of myosin heavy chain-A. Tomoko Sakai, Kentaro Kato, Kenji Watanabe and Hidefumi Orii Int. J. Dev. Biol. (2002) 46: 329-332 Disto-proximal regional determination and intercalary regeneration in planarians, revealed by retinoic acid induced disruption of regeneration. R Romero and D Bueno Int. J. Dev. Biol. (2001) 45: 669-673 THE ENCODE PROJECT CONSORTIUM. (2007). Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature 447: 799-816. VENTURINI, G., CAROLEI, A., PALLADINI, G., MARGOTTA, V. and LAURO, M.G. (1983). Radioimmunological and immunocytochemical demonstration of Met- enkephalin in planaria. Comp Biochem Physiol C 74: 23-5. VINSON, J.P., JAFFE, D.B., O’NEILL, K., KARLSSON, E.K., STANGE-THOMANN, N., ANDERSON, S., MESIROV, J.P., SATOH, N., SATOU, Y., NUSBAUM, C. et al. (2005). Assembly of polymorphic genomes: algorithms and application to Ciona savignyi. Genome Res 15: 1127-35. WANG, Y., ZAYAS, R.M., GUO, T. and NEWMARK, P.A. (2007). nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 5901-5906. WOLFF, E. and LENDER, T. (1950). Sur le role organisateur du cerveau dans la régénération des yeux chez une planaire d’eau douce. C.R. Acad. Sc. 230: 2238-2239. ZAYAS, R.M., HERNANDEZ, A., HABERMANN, B., WANG, Y., STARY, J.M. and NEWMARK, P.A. (2005). The planarian Schmidtea mediterranea as a model for epigenetic germ cell specification: analysis of ESTs from the hermaphroditic strain. Proc Natl Acad Sci USA 102: 18491-6. 5 yr ISI Impact Factor (2008) = 3.271